專利名稱：一種重組人20kD生長(zhǎng)激素表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、單克隆抗體的制備及其細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體，特別是一種含有人20kD生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)載體；本發(fā)明還涉及該表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)；本發(fā)明還涉及一種人20kD生長(zhǎng)激素單克隆抗體的制備及分泌該單克隆抗體的細(xì)胞株。
背景技術(shù)：
人生長(zhǎng)激素(human growth hormone,hGH)又名促生長(zhǎng)素(Somatropin)，是腺垂體前部的嗜酸性細(xì)胞合成、分泌的肽鏈，在垂體中產(chǎn)生的hGH主要有兩種形式分子量為22kD 和分子量為20kD。22kD GH在人體內(nèi)是含量最多的生長(zhǎng)激素，它是一條單鏈非糖化的、由191個(gè)氨基酸組成的親水性球蛋白，約占垂體hGH的70 % 75 %，占血液循環(huán)hGH的43 %。20kD hGH約占血液循環(huán)中hGH的5% -10%。它由176個(gè)氨基酸組成，較22kD GH 少了 N端第32-46位的15個(gè)氨基酸殘基，但是它仍然保持了 22kD原有的兩對(duì)二硫鍵，這樣使得20kD GH可以正常折疊并具有和22kD GH相似的分子結(jié)構(gòu)以及功能，同時(shí)也為特異分型單抗的制備帶來了困難。由于人體代謝的復(fù)雜性和運(yùn)動(dòng)員服用興奮劑水平的提高，部分重點(diǎn)興奮劑，如 hGH(重組22kD GH)等現(xiàn)在被過度濫用。hGH的代謝和脂解作用有很多潛在的有益效應(yīng)，如運(yùn)動(dòng)時(shí)增加心輸出量、出汗率和脂解作用，改善內(nèi)環(huán)境的熱穩(wěn)定，提供能量加強(qiáng)耐力運(yùn)動(dòng)， 并且可能增加韌帶強(qiáng)度和創(chuàng)傷愈合率，這些特點(diǎn)使得很多運(yùn)動(dòng)員意圖通過服用外源的hGH 去提高成績(jī)。國(guó)際奧委會(huì)和主要的運(yùn)動(dòng)團(tuán)體也因此明文禁止運(yùn)動(dòng)員服用外源hGH。抗20kD GH的特異性單抗的制備已成為成功檢測(cè)運(yùn)動(dòng)員服用外源性hGH的研究熱點(diǎn)，越來越受到國(guó)際研究同行的重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組質(zhì)粒表達(dá)載體，該載體含有人20kD生長(zhǎng)激素基因。本發(fā)明的另一目的在于上述質(zhì)粒表達(dá)的蛋白在制備抗人20kD生長(zhǎng)激素單克隆抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種單克隆抗體，該單克隆抗體能特異性識(shí)別并結(jié)合 20kD GH0本發(fā)明的另一目的在于上述特異性單克隆抗體在制備人血清或尿液中20kD GH濃度的檢測(cè)劑中的應(yīng)用。 本發(fā)明構(gòu)建含人20kD生長(zhǎng)激素基因的重組質(zhì)粒表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)C端攜帶組氨酸標(biāo)簽的生長(zhǎng)激素融合蛋白，在此基礎(chǔ)上制備抗20kDGH的特異性單克隆抗體，并篩選獲得分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為定量檢測(cè)人血清或尿液中20kD GH的濃度奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明以22kD生長(zhǎng)激素基因?yàn)槟０?，采用重組PCR方法擴(kuò)增出20kD基因片段。采用的表達(dá)載體PTIG-Trx是原核高效分泌表達(dá)質(zhì)粒，含有強(qiáng)的IIp啟動(dòng)子，通過選擇合適的多克隆酶切位點(diǎn)，將全長(zhǎng)的20kD生長(zhǎng)激素基因插入，并使其C端帶有6個(gè)組氨酸的尾巴，重組質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)含有20kD生長(zhǎng)激素目的基因(基因序列見序列表中的序列1)。 將含有pTIG-Trx/GH質(zhì)粒載體的菌株放入含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體并進(jìn)行15% SDS-PAGE分析，結(jié)果在分子量為20kD處出現(xiàn)了預(yù)期的目的條帶(蛋白氨基酸序列見序列表中的序列2)。本發(fā)明采用上述方法制備的20kD GH重組蛋白作為抗原，免疫BALb/C小鼠，加佐劑進(jìn)行基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫后，分別采用雜交瘤技術(shù)和免疫學(xué)方法融合、克隆化并篩選 20kD GH的單克隆抗體。因此，該單克隆抗體可特異用于制備人血清或尿液中20kD GH濃度的定量檢測(cè)試劑。


(見后)圖1為采用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增20kD GH基因產(chǎn)物的電泳結(jié)果；圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx_20GH的EcoR I和Xho I雙酶切鑒定結(jié)果；圖3為重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx-20GH的DNA測(cè)序結(jié)果；圖4為重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx-20GH在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果；圖5為20kD GH重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果；圖6為抗20kD GH的單克隆抗體特異性SI3R分析結(jié)果。包括㈧圖和⑶圖。圖1中PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明，所擴(kuò)增的ac和bd片段大小與預(yù)期一致，分別是 IlObp和438bp ；重疊延伸獲得的片段大小與20kDGH基因片段預(yù)期一致，為M8bp(含有酶切序列和保護(hù)堿基)。圖2中將重組質(zhì)粒pTIG-Trx_20GH轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)大腸桿菌。挑取生長(zhǎng)良好的單菌落在帶氨芐抗性的LB液體養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，采用EcoR I和 Xho I進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳分析，可見經(jīng)EcoR I和Β ο I雙酶切后 pTIG-Trx-20GH酶解成為兩個(gè)片段，分別為530bp左右的20kD GH基因片段和5700bp左右的pTIG-Trx片段，與理論值相符。圖3中DNA測(cè)序結(jié)果表明插入的20kD GH片段完全正確。圖4中將pTIG-Trx-20GH質(zhì)粒和空載體pTIG_Trx轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，分別挑取單菌落于帶氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床220rpm過夜培養(yǎng)然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。其中PTIG-Trx用作陰性對(duì)照。將誘導(dǎo)得到的菌液離心，用適量滅菌去離子水重懸沉淀，超聲破菌之后離心，分別收集上清和沉淀進(jìn)行15% SDS-PAGE分析。結(jié)果表明重組質(zhì)粒在分子量約20000Da處有明顯的蛋白表達(dá)條帶，而空載體在相應(yīng)分子量處無蛋白表達(dá)條帶。同時(shí)超聲破菌后的電泳分析結(jié)果表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。圖5將pTIG-Trx-20GH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)包涵體進(jìn)行8M 尿素變性、凝膠過濾純化，得純度在90%左右的目的蛋白。圖6中按常規(guī)Sra方法檢測(cè)單克隆抗體的特異性，結(jié)果表明㈧當(dāng)22kD GH蛋白濃度恒定不變時(shí)，隨著20kD GH蛋白濃度的增大，抗體與20kD GH的親和力不斷增大；(B)當(dāng) 20kD GH蛋白濃度恒定不變時(shí)，無論22kD GH蛋白濃度如何變化，均未呈現(xiàn)抗體與22kD GH蛋白結(jié)合的情況，表明雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體是特異性結(jié)合20kD GH的單克隆抗體。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1. 20kD GH基因的獲得通過檢索GenBank，根據(jù)己報(bào)道的20kD GH的基因序列，用GeneI10011. 0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)它們序列的特異性引物，20kD GH核苷酸序列全長(zhǎng)528bp，為了方便克隆，在外引物a和 d的5'端分別引入了 EcoR I和BioI酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)如下a 5' CGGAATTCTAATGTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG 3'b 5' CAGGAGTTTAACCCACAGACCTCCCTC 3'C 5' CTGTGGGTTAAACTCCTGGTAGGTGTC 3'd 5' CCGCTCGAGGAAGCCACAGCTGCCCTCCA 3'以22kD GH表達(dá)載體pGEM_T/22GH為模板，采用重疊延伸PCR方法進(jìn)行兩步擴(kuò)增， 取5yL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果得到了 530bp左右的目的條帶。實(shí)施例2. pTIG-Trx-20GH重組表汰質(zhì)粒的構(gòu)津和在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分離出目的片斷，在長(zhǎng)波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，回收目的片段。將回收的20kD GH目的片段克隆至 PGEM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和鑒定，在LB平板上挑選生長(zhǎng)良好的白色菌落接種于帶氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，采用EcoR I 和》!0 I雙酶切鑒定，將陽性克隆的重組質(zhì)粒送北京奧科公司測(cè)序。將測(cè)序正確的pGMT-T_20kD GH和pTIG-Trx空載體用EcoR I和Xho I雙酶切，用 1.2%瓊脂糖凝膠分別分離回收。將回收的目的片斷克隆至pTIG-Trx空載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)大腸桿菌。挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于帶氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，采用EcoR I和B10 I雙酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送北京奧科公司測(cè)序，結(jié)果證實(shí)序列分析完全正確。實(shí)施例3. 20kD GH重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將pTIG-Trx-20GH質(zhì)粒和空載體pTIG_Trx轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng) 12-16h。分別挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落于5mL帶氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。其中pTIG-Trx用作對(duì)照。將活化菌液以1/100的比率轉(zhuǎn)接入帶氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、220rpm培養(yǎng)150min。當(dāng)0D600在0. 8左右時(shí)即用IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)條件為0. 3mmol/ L IPTG，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)Μι。將誘導(dǎo)得到的菌液于6000rpm離心lOmin，用500 μ L滅菌去離子水重懸沉淀。在超聲粉碎機(jī)上超聲破碎，將破碎好的菌液以12000rpm離心lOmin。 分別收集上清和沉淀進(jìn)行15% SDS-PAGE分析。結(jié)果表明重組質(zhì)粒在分子量約20000Da處有明顯的蛋白表達(dá)條帶，而空載體在相應(yīng)分子量處無蛋白表達(dá)條帶。同時(shí)超聲破菌后的電泳分析結(jié)果表明重組蛋白主要以包涵體形式存在進(jìn)行大量誘導(dǎo)，收集菌體沉淀并進(jìn)行超聲破菌，得到包涵體。采用包涵體變性、復(fù)性的方法純化目的蛋白。
實(shí)施例4.抗20kD GH單克降抗體的制備(l)20kD GH重組蛋白的動(dòng)物免疫取重組蛋白50 μ g加福氏完全佐劑進(jìn)行完全乳化，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫8周齡、雌性BALb/C小鼠。以后依次用50 μ g 20kD rGH加福氏不完全佐劑同上述途徑加強(qiáng)免疫2次(每間隔2周)；并同時(shí)以100 μ g 20kDrGH經(jīng)腹腔免疫(間隔3周)。(2)雜交瘤細(xì)胞的融合取SP2/0細(xì)胞和加強(qiáng)沖擊免疫后的小鼠脾細(xì)胞懸液于50mL離心管中，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合后，加入含HAT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，分加入鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的M孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml，在5% CO2、37°C條件下培養(yǎng)。在融合后的第10天檢測(cè)培養(yǎng)上清中的特異性抗體。(3)陽性克隆的篩選和克隆化分別將20kD GH和22kD GH作為包被抗原，然后加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清(含雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體)，用ELISA方法篩選陽性克隆，選擇與20kD GH呈陽性反應(yīng)，而與22kD GH呈陰性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株作為陽性克隆，然后采用顯微操作進(jìn)行連續(xù)3次亞克隆培養(yǎng)，直至得到單克隆。(4)抗體的特異性鑒定①ELISA 按常規(guī)ELISA方法。結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清與20kD GH反應(yīng)，而不與22kD GH反應(yīng)，說明單克隆抗體是特異針對(duì)20kDGH的單克隆抗體。②表面等離子共振技術(shù)(SPR)分析按常規(guī)SI^R方法。結(jié)果表明當(dāng)22kD GH蛋白濃度恒定不變時(shí)，隨著 20kD GH蛋白濃度的增大，抗體與20kD GH的親和力不斷增大；當(dāng)20kD GH蛋白濃度恒定不變時(shí)，無論22kD GH蛋白濃度如何變化，均未呈現(xiàn)抗體與22kD GH蛋白結(jié)合的情況；進(jìn)一步證明雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體可以結(jié)合20kD GH，但不與22kD GH反應(yīng)，是特異性結(jié)合20kD GH的單克隆抗體。其中抗體和20kDGH結(jié)合的親和常數(shù)(Ka)為3. 4X ΙΟΙ1，解離常數(shù)(Kd)為2.95X10,M。③抗體效價(jià)測(cè)定包被20kD GH重組蛋白作為抗原，用ELISA 測(cè)定培養(yǎng)上清和腹水的效價(jià)用0. 01mol/L PBS倍比稀釋培養(yǎng)上清和腹水，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照孔(只加PBS)和陽性對(duì)照孔(只加免疫鼠的血清)。所檢測(cè)的培養(yǎng)上清為單克隆化雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，所檢測(cè)的腹水為BALb/C鼠腹腔注射單克隆雜交瘤細(xì)胞后誘導(dǎo)生成的腹水。
權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒載體，其特征是該載體含有人20kD生長(zhǎng)激素基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征是該載體為大腸桿菌表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征是該載體為pLLP-0mpA-20GH。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征是該載體轉(zhuǎn)化的是可以表達(dá)20kDGH基因的大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征是該載體表達(dá)的融合蛋白為C端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的20kD GH融合蛋白。
6.權(quán)利要求5所述的融合蛋白在制備抗20kD單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的細(xì)胞株中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的單克隆抗體在制備人血清或尿液中20kDGH濃度的檢測(cè)劑中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒載體，該載體含有人20kD生長(zhǎng)激素(hGH)基因。本發(fā)明還涉及上述該表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、抗20kD hGH單克隆抗體的制備，包括下列步驟a)構(gòu)建含有20kD hGH的原核重組表達(dá)載體；b)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)重組20kD hGH蛋白；c)將重組蛋白免疫小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備特異性單克隆抗體。該單克隆抗體可以應(yīng)用于制備人血清或尿液中20kD GH濃度的檢測(cè)劑。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102337287SQ20101022732
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者吳侔天, 杜宏武, 王杉, 陳光宇 申請(qǐng)人:北京意宏安生物科技有限公司, 國(guó)家體育總局反興奮劑中心