專利名稱：L-氨基酸生產(chǎn)菌以及l(fā)-氨基酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-半胱氨酸等L-氨基酸的生產(chǎn)方法，具體來說涉及適于生產(chǎn)L-氨基 酸的細(xì)菌，以及使用該細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)方法。L-氨基酸在調(diào)味品、食品添加劑、飼料添 加劑、化學(xué)產(chǎn)品、醫(yī)藥品等多種領(lǐng)域中被利用。
背景技術(shù)：
L-氨基酸是通過使用屬于短桿菌屬、棒狀桿菌屬、埃希氏菌屬等的微生物的發(fā)酵 方法來進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的。在這些生產(chǎn)方法中，使用從自然界分離的菌株或者該菌株的人工 突變株，并且還使用通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾從而增加了堿性L-氨基酸生物合成酶的活 性的微生物等(專利文獻(xiàn)1 9)。此外，例如，L-半胱氨酸可以通過從毛發(fā)、角、羽毛等含有角蛋白質(zhì)的物質(zhì)中提取 而獲得，或者以DL-2-氨噻唑啉-4-羧酸為前體通過細(xì)菌酶轉(zhuǎn)化而獲得。此外，還計(jì)劃使用 新型酶通過固定化酶方法大量生產(chǎn)L-半胱氨酸。還嘗試通過使用細(xì)菌的發(fā)酵方法來生產(chǎn)L-半胱氨酸。例如，本發(fā)明人公開的使用 下述埃希氏菌屬細(xì)菌的L-半胱氨酸的生產(chǎn)方法，所述埃希氏菌屬細(xì)菌的L-半胱氨酸分解 系統(tǒng)受到了抑制、且降低了 L-半胱氨酸的反饋抑制并且攜帶了絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(serine acetyltransferase(EC 2.3. 1. 30)，下面也稱為“SAT”)(專利文獻(xiàn)11)。此外，作為通 過抑制L-半胱氨酸分解系統(tǒng)從而提高了 L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌，已知的有使胱硫 醚-β-裂解酶(專利文獻(xiàn)11)、色氨酸酶(專利文獻(xiàn)12)、0-乙酰絲氨酸巰基水解酶(專 利文獻(xiàn)13)的活性降低或缺失的棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏屬細(xì)菌。同樣地，還已知使用下 述細(xì)菌的L-半胱氨酸制造方法，所述細(xì)菌中，利用編碼降低了 L-半胱氨酸反饋抑制并具有 特定突變的SAT的DNA序列，使L-半胱氨酸物質(zhì)代謝擺脫了調(diào)控(專利文獻(xiàn)14)。還已知編碼YdeD蛋白質(zhì)的ydeD基因(非專利文獻(xiàn)1)以及編碼YfiK蛋白質(zhì)的 yfiK基因(專利文獻(xiàn)15)與L-半胱氨酸途徑的代謝產(chǎn)物的分泌有關(guān)。此外，已知通過增 強(qiáng)作為編碼適于排出針對(duì)細(xì)胞的有毒物質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因的mar-基因座、acr-基因座、 cmr-基因座、mex-基因座、bmr-基因座、qacA-基因位點(diǎn)(專禾U文獻(xiàn)16)、或emrAB、emrKY、 yojIH.acrEF.bcr或者cusA基因(專利文獻(xiàn)17)的表達(dá)來提高L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的技 術(shù)。另一方面，已經(jīng)報(bào)道了使用過量表達(dá)了下述基因的細(xì)菌來生產(chǎn)L-半胱氨酸的方 法，所述基因?yàn)榫幋a優(yōu)選使抗生物質(zhì)或?qū)?xì)菌有毒性的物質(zhì)直接從細(xì)胞放出的蛋白質(zhì)的基 因(專利文獻(xiàn)18)。此外，不僅是L-半胱氨酸，還已知對(duì)于提高細(xì)菌的L-氨基酸的生產(chǎn)力而言，可以 通過提高L-氨基酸的分泌蛋白質(zhì)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于棒狀桿菌型細(xì)菌，已有報(bào)道稱，通過 增強(qiáng)命名為IysE的L-賴氨酸分泌載體的表達(dá)量，可以提高L-賴氨酸的生產(chǎn)(專利文獻(xiàn) 19)。此外，對(duì)于埃希氏菌屬細(xì)菌，已知幾種預(yù)測(cè)為氨基酸分泌載體的膜蛋白質(zhì)。例如，報(bào) 道了通過增加命名為rhtB的基因的拷貝數(shù)，可以提高對(duì)于高濃度L-高絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸以及L-異亮氨酸的抗性，因此預(yù)測(cè)該基因產(chǎn)物為這些L-氨基酸的分 泌載體(專利文獻(xiàn)19)。已經(jīng)有報(bào)道稱，yeaS基因被推測(cè)為屬于上述rhtB基因家族的膜蛋白質(zhì)，通過增強(qiáng) 該基因表達(dá)量，與對(duì)照株相比也可以提高對(duì)于高濃度的L-蘇氨酸、L-高絲氨酸、L-賴氨酸、 L-谷氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、α-氨基丁酸的抗性，通過在L-氨基酸生產(chǎn)菌中增強(qiáng)該 基因的表達(dá)量，提高了 L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、以及L-組氨酸的生 產(chǎn)力(專利文獻(xiàn)20)。如上所述，通過增強(qiáng)yeaS基因的表達(dá)量，可以研究其對(duì)各種氨基酸生產(chǎn)的效果 (非專利文獻(xiàn)2)，但對(duì)于使L-氨基酸生產(chǎn)力提高的yeaS基因的突變尚屬未知。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1歐洲專利公開EP0643135B專利文獻(xiàn)2歐洲專利公開EP0733712B專利文獻(xiàn)3歐洲專利公開EP1477565A專利文獻(xiàn)4歐洲專利公開EP0796912A專利文獻(xiàn)5歐洲專利公開EP0837134A專利文獻(xiàn)6國(guó)際公開W001/53459專利文獻(xiàn)7歐洲專利公開EP1170376A專利文獻(xiàn)8國(guó)際公開W02005/010175專利文獻(xiàn)9國(guó)際公開W096/17930專利文獻(xiàn)10國(guó)際公開W02006/013807專利文獻(xiàn)11特開平11-155571號(hào)專利文獻(xiàn)12 特開 2003-169668專利文獻(xiàn)13 特開 2005-245311專利文獻(xiàn)14 特表 2000-504926專利文獻(xiàn)15特開2004-49237專利文獻(xiàn)16美國(guó)專利第5972663號(hào)專利文獻(xiàn)17 特開 2005-287333專利文獻(xiàn)18特開平11-56381號(hào)專利文獻(xiàn)19 特開 2000-189180專利文獻(xiàn)20歐洲專利申請(qǐng)公開第1013765A1非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)IDabler et al.，Mol. Microbiol. 36. 1101-1112 (2000)非專利文獻(xiàn)2Kutukova et al.，F(xiàn)EBS Lett. 579. 4629-4634(2005)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要 解決的問題本發(fā)明的課題是開發(fā)使細(xì)菌L-氨基酸生產(chǎn)能力提高的新型技術(shù)，提供L-氨基酸 生產(chǎn)菌、以及使用該細(xì)菌的L-氨基酸的生產(chǎn)方法。
解決問題的方法本發(fā)明人等為了解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過向yeaS基因?qū)?特定的突變，可以提高L-氨基酸的生產(chǎn)能力，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明如下所述。 (1). 一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L-氨基酸生產(chǎn) 能力、且經(jīng)過了修飾從而攜帶具有選自下述(I) (III)中的突變的突變型yeas基因的屬 于腸肝菌科的細(xì)菌，并從該培養(yǎng)基收集L-氨基酸(I)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第28位的蘇氨酸殘基被蘇氨酸以外的氨基酸所 取代的突變，(II)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第137位的苯丙氨酸殘基被苯丙氨酸以外的氨 基酸所取代的突變，(III)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第188位的亮氨酸殘基被亮氨酸以外的氨基 酸所取代的突變；其中，沒有所述突變的yeaS基因編碼下述(A)或(B)中的任一種蛋白質(zhì)(A)具有SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或(B)具有在SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10個(gè) 氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有當(dāng)在腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)使得L-半胱氨酸生產(chǎn)能 力與非修飾株相比有所提高的活性的蛋白質(zhì)。(2).上述的方法，其中，沒有所述突變的yeaS基因?yàn)橄率?a)或(b)的DNA (a)具有SEQ ID NO 1中所示的堿基序列的基因，或，(b)與SEQ ID NO=I中所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或能夠由該互補(bǔ)序列制備的探 針在嚴(yán)格條件下雜交、并且編碼具有當(dāng)在腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)使得L-半胱氨酸生產(chǎn)能 力與非修飾株相比有所提高的活性的蛋白質(zhì)的DNA。(3).上述的方法，其中所述(I) (III)的突變分別為下述(i) (iii)的突變(i)第28位的蘇氨酸殘基被天冬酰胺所取代的突變，(ii)第137位的苯丙氨酸殘基被絲氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸以 及甘氨酸中的任一種所取代的突變，(iii)第188位的亮氨酸殘基被谷氨酰胺所取代的突變。(4).上述的方法，其中所述細(xì)菌攜帶具有所述(ii)的突變的突變型yeaS基因，且 在該基因編碼的蛋白質(zhì)中第137位的苯丙氨酸殘基被絲氨酸或谷氨酰胺所取代。(5).上述的方法，其中，所述L-氨基酸選自L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-蘇氨酸、 L-絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-組氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-異亮氨酸、L-苯 丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸。(6).上述的方法，其中，所述L-氨基酸為L(zhǎng)-半胱氨酸。(7).上述的方法，其中，所述細(xì)菌經(jīng)過修飾從而增強(qiáng)了 L-半胱氨酸生物合成系統(tǒng) 酶的活性。(8).上述的方法，其中，所述細(xì)菌經(jīng)過修飾從而增強(qiáng)了絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。(9).上述的方法，其中，所述細(xì)菌攜帶降低了由L-半胱氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的突 變型絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。
(10).上述的方法，其中，所述細(xì)菌為泛菌屬細(xì)菌。(11).上述的方法，其中，所述細(xì)菌為Pantoea ananatis。(12).上述的方法，其中，所述細(xì)菌為大腸桿菌。 (13). 一種屬于腸肝菌科的細(xì)菌，其具有L-氨基酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過了修飾從 而攜帶具有選自下述(I) (III)中的突變的突變型yeaS基因(I)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第28位的蘇氨酸殘基被蘇氨酸以外的氨基酸所 取代的突變，(II)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第137位的苯丙氨酸殘基被苯丙氨酸以外的氨 基酸所取代的突變，(III)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第188位的亮氨酸殘基被亮氨酸以外的氨基酸 所取代的突變；其中，沒有所述突變的yeaS基因編碼下述(A)或(B)中的任一種蛋白質(zhì)(A)具有SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或(B)具有在SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10個(gè) 氨基酸而得到的氨基酸序列、并且具有當(dāng)在腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)使得L-半胱氨酸生產(chǎn) 能力與非修飾株相比有所提高的活性的蛋白質(zhì)。(14).權(quán)利要求13的細(xì)菌，其中，所述L-氨基酸為L(zhǎng)-半胱氨酸。(15). 一種DNA，其編碼具有選自下述⑴ (III)的突變的下述(A)或⑶中的 任一種蛋白質(zhì)(A)具有SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或(B)具有在SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10個(gè) 氨基酸而得到的氨基酸序列、并且具有當(dāng)在腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)使得L-半胱氨酸生產(chǎn) 能力與非修飾株相比有所提高的活性的蛋白質(zhì)；(I)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第28位的蘇氨酸殘基被蘇氨酸以外的氨基酸所 取代的突變，(II)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第137位的苯丙氨酸殘基被苯丙氨酸以外的氨 基酸所取代的突變，(III)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第188位的亮氨酸殘基被亮氨酸以外的氨基酸 所取代的突變。發(fā)明效果通過本發(fā)明可以提高屬于腸桿菌科的細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)力。此外，通過使用本 發(fā)明的細(xì)菌，可以更高效地發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸。此外，通過本發(fā)明，可以提供編碼具有使得宿主細(xì)胞的L-氨基酸生產(chǎn)力與非修飾 株相比提高的活性的蛋白質(zhì)的新基因。


圖1顯示啟動(dòng)子Pnlp序列的圖。圖2顯示E. coli MG1655的YeaSF137S強(qiáng)化株的半胱氨酸抗性(生長(zhǎng)繁育曲線) 的圖，〇表示野生型， 表示F137S突變。
圖3顯示P. ananatis的YeaSWT以及YeaSF137S強(qiáng)化株的培養(yǎng)液中氨基酸濃度的 圖。圖4顯示E. coli的YeaSWT以及YeaSF137S強(qiáng)化株的培養(yǎng)液中氨基酸濃度的圖。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式<1>本發(fā)明的細(xì)菌本發(fā)明的細(xì)菌為具有L-氨基酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過修飾從而攜帶了具有特定突 變的突變型yeaS基因的細(xì)菌。對(duì)于L-氨基酸的種類沒有特殊限制，可以列舉出L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-精氨 酸、L-組氨酸、L-瓜氨酸等堿性氨基酸，L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-甘 氨酸等脂肪族氨基酸，L"蘇氨酸、L"絲氨酸等羥基單氨基羧酸形式的氨基酸，L"脯氨酸等 環(huán)式氨基酸，L"苯丙氨酸、L"酪氨酸、L"色氨酸等芳香族氨基酸，L"半胱氨酸、L"胱氨酸、 L-甲硫氨酸等含硫氨基酸，L"谷氨酸、L"天冬氨酸、L"谷氨酰胺、L"天冬酰胺等等酸性氨 基酸，優(yōu)選L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-組氨酸、L-纈 氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸以及L-脯氨 酸，特別優(yōu)選L-半胱氨酸。本發(fā)明的細(xì)菌可以具有2種以上氨基酸的生產(chǎn)能力。此外，本發(fā)明中的L-氨基酸是指游離體的L-氨基酸以及/或者其鹽，例如包括硫 酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、銨鹽、鈉鹽、鉀鹽。L-氨基酸的生產(chǎn)能力是指，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌時(shí)，在培養(yǎng)基中或者 菌體內(nèi)生成L-氨基酸，并且積累達(dá)到可以從培養(yǎng)基中或者菌體中回收的水平的能力。此 外，具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌是指，與野生株或者親本株相比可以生產(chǎn)更多L-氨基酸 并在培養(yǎng)基中積累的細(xì)菌，優(yōu)選可以生產(chǎn)并在培養(yǎng)基中積累0. 2g/L以上，更優(yōu)選為0. 3g/ L，特別優(yōu)選為0. 4g/L以上的L-氨基酸的細(xì)菌。當(dāng)L-氨基酸為L(zhǎng)-半胱氨酸時(shí)，細(xì)菌生產(chǎn)的L-半胱氨酸在培養(yǎng)基中通過二硫鍵一 部分轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸。此外，如下述一樣，有時(shí)L-半胱氨酸通過和培養(yǎng)基中含有的硫代 硫酸反應(yīng)生成S-硫代半胱氨酸(Szcz印kowski T. ff.，Nature, vol. 182(1958))。進(jìn)一步， 細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)生成的L-半胱氨酸有時(shí)還和細(xì)胞中存在的酮或醛，例如與丙酮酸縮合，以硫 代半酮縮醇(、$手才》夕一>，hemithioketal)為中間體生成噻唑烷(千7、/ <J ” >， thiazolidine)衍生物(參考日本專利第2992010)。這些噻唑烷衍生物以及硫代半酮縮醇 有時(shí)作為平衡混合物存在。因此，L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，不僅限于在培養(yǎng)基中或者菌體內(nèi) 積累L-半胱氨酸的能力，是指除L-半胱氨酸之外，還包括L-胱氨酸、或者它們的衍生物， 例如S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍生物、或者硫代半酮縮醇、或者它們的混合物在培養(yǎng)基中 的積累能力。此外，對(duì)于在本發(fā)明的方法中生產(chǎn)的“L-半胱氨酸”沒有特殊限制，是指還原 性L-半胱氨酸、L-胱氨酸、或者上述的這些衍生物、或者它們的混合物。作為具有L氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌，可以為天然具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌， 但也可以是如下所述的細(xì)菌通過利用突變方法、重組DNA技術(shù)經(jīng)過修飾而具有了 -L氨基 酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌。作為在本發(fā)明中使用的細(xì)菌，只要是具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌即可，沒有 特殊限制，可以是屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、歐文氏 菌屬、沙門氏菌屬、摩根氏菌屬等腸肝菌科的細(xì)菌。具體地說，可以使用按照NCBI(美國(guó)國(guó)
8家生物技術(shù)信息中心，National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中記載 的分類屬于腸桿菌禾斗的細(xì)菌(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/wwwtax. cgiyyid = 91347)。作為用于修飾的腸桿菌科的親本株，其中優(yōu)選使用埃希氏菌屬細(xì)菌、腸 桿菌屬細(xì)菌、泛菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬、腸桿菌屬、或克雷伯氏菌屬。對(duì)于埃希氏菌屬細(xì)菌的親本株，沒有特別限制，具體而言，可以使用Neidhardt等 白勺胃作(Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of somemutant derivatives of Escherichia coli K-12,p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt(ed.),Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition, American Society for Microbiology Press，Washington，D. C.)列出的細(xì)菌。在這些細(xì)菌中，例 如可列舉大腸桿菌。作為大腸桿菌，具體地可列舉源自原型野生型K12菌株的大腸桿菌 W3110(ATCC 27325)和大腸桿菌 MG1655 (ATCC 47076)。這些菌株可從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive， Rockville, Maryland 20852 P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, UnitedStates of America)通過分售獲得。即，對(duì)每種菌株都給予了登錄號(hào)，可以使用這些號(hào)碼通過分售獲得 菌株(參考http://www.atcc. org/)。美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中列出了每種菌株 的對(duì)應(yīng)登錄號(hào)。腸桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例可以列舉出成團(tuán)腸桿菌(Enterobacteragglomerans)和 產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等、泛菌屬細(xì)菌的實(shí)例可以列舉出Pantoea ananatis。而且，近年來，成團(tuán)腸桿菌根據(jù)其16S rRNA的堿基序列的解析，被重新分類為 f^M&M (Pantoea agglomerans) ^ Pantoea ananatis (Pantoea ananatis) ^ Jff K^S (Pantoea stewartii)。在本發(fā)明中，只要是被分類為腸桿菌科的細(xì)菌，無論是屬于腸桿菌 屬或者泛菌屬中任一屬的細(xì)菌均可。特別地，泛菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬細(xì)菌和腸桿菌屬細(xì)菌是分類為變形細(xì)菌 (y -Proteobacteria)的細(xì)菌，它們?cè)诜诸悓W(xué)上的親緣關(guān)系非常近(J GenAppl Microbiol 1997 Dec ;43 (6)355-361、International Journal of SystematicBacteriology, Oct. 1997，pl061-1067)。近年來，依據(jù)DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)等，屬于腸桿菌屬的細(xì)菌中，有些 I^MSt^^^Jlif (Pantoeaagglomerans) ^ Pantoea dispersa ^ (International Journal of SystematicBacteriology, July 1989 ;39 (3) p. 337-345)。此外，屬于歐文氏 菌屬的細(xì)菌中，有些被重新分類為Pantoea ananas、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(參考 International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993 ;43 (1) p. 162—173)。腸桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產(chǎn)氣腸桿 菌(Enterobacter aerogenes)。具體地，可以使用歐州專利申請(qǐng)公開952221號(hào)說明書示例 的菌株。作為腸桿菌屬的代表性菌株，可以列舉出成團(tuán)腸桿菌ATCC12287株。作為泛菌屬細(xì)菌的代表性菌株，可以列舉出Pantoea ananatis,斯氏泛菌 (Pantoea stewartii) >j^lljSlif^'lT'RSlif (Pantoea citrea)Pantoeaananatis [本 地可以列舉出Pantoea ananatis AJ13355株、SC17株、以及SC17 (0)株。SC17株是以作為 低PH下能夠在含L-谷氨酸和碳源的培養(yǎng)基中增殖的菌株從靜R縣磐田市的土壤中分離出 來的菌株AJ13355(FERMBP-6614)為起始，作為粘液質(zhì)低生產(chǎn)突變菌株選擇出來的菌株(美 國(guó)專利第6，596，517號(hào))。SC17 (0)株是為了對(duì)Pantoea ananatis進(jìn)行基因破壞，而構(gòu)建的作為對(duì)λ Red基因產(chǎn)物具有抗性的菌株(W02008/075483)。SC17株已于平成21年2月4日 (2009年)保藏于產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(地址郵政編碼305-8566茨城 縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，并給予保藏號(hào)FERM ABP-11091。此外，SC17 (0)株已于 2005年9月21日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(VKPM), GNII Genetika)(地址Russia, 117545 Moscow, IDorozhny proezd. 1)，保藏號(hào)為 VKPM B-9246。Pantoea ananatis AJ13355株已于平成10年(1998年)2月19日保藏于通產(chǎn)省工 業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)名稱為產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，地 址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號(hào)為FERM P-16644， 并于平成11年(1999年)1月11日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，并給予保藏號(hào)FERM BP-6614。而且，該菌株在分離時(shí)被鑒定為成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)，并當(dāng) 作成團(tuán)腸桿菌AJ13355進(jìn)行了保藏。但是，近年來，基于16S rRNA核苷酸序列分析等，其被 MSt^^^J Pantoea ananatis 作為歐文氏菌屬細(xì)菌，可以列舉出解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)、胡蘿卜 軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)；作為克雷伯氏菌屬細(xì)菌，可以列舉出植生克雷伯氏 菌(Klebsiella planticola)0(L-氨基酸生產(chǎn)能力的賦予或增強(qiáng)) 為了給細(xì)菌賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力，可以使用在棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬 細(xì)菌等氨基酸生產(chǎn)菌的選育中沿用至今的方法，如獲取營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體、類似物抗性菌株 或代謝調(diào)節(jié)突變菌株，創(chuàng)建L-氨基酸生物合成系統(tǒng)酶表達(dá)增強(qiáng)的重組菌株等等(參見《7 笑7酸発酵》，(株)學(xué)會(huì)出版中心，1986年5月30日第一版發(fā)行，第77-100頁)。這里， 在L-氨基酸生產(chǎn)菌的選育中，被賦予的營(yíng)養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變等性質(zhì)可 以是單獨(dú)一種，也可以是兩種或者三種以上。此外，表達(dá)被增強(qiáng)的L-氨基酸生物合成系統(tǒng) 酶可以是單獨(dú)一種，也可以是兩種或三種以上。另外，可以將營(yíng)養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或 代謝調(diào)節(jié)突變等性質(zhì)的賦予與生物合成系統(tǒng)酶的增強(qiáng)組合進(jìn)行。具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體菌株、L-氨基酸類似物抗性菌株或代 謝調(diào)節(jié)突變菌株可如下獲得對(duì)親本菌株或野生型菌株施以常規(guī)突變處理，即X-射線或UV 照射或用誘變劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等處 理；其后，從所得的突變菌株中選擇顯示營(yíng)養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變并且還具 有L-氨基酸生產(chǎn)能力的菌株。此外，可以通過進(jìn)行基因重組來增強(qiáng)酶活性從而賦予或增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)能力。 酶活性的增強(qiáng)，可以列舉出例如通過修飾細(xì)菌從而增強(qiáng)編碼與L-氨基酸的生物合成相關(guān) 的基因的表達(dá)的方法。作為增強(qiáng)基因的表達(dá)的方法，可以這樣來實(shí)現(xiàn)導(dǎo)入擴(kuò)增的質(zhì)粒，所 述擴(kuò)增的質(zhì)粒是將包含這些基因的DNA片段導(dǎo)入適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒，例如至少包含負(fù)責(zé)質(zhì)粒在微 生物內(nèi)的復(fù)制增殖功能的基因的質(zhì)粒載體而形成的；或者，通過接合、基因轉(zhuǎn)移等使這些 基因在染色體上多拷貝化；抑或在這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)胪蛔?參考國(guó)際公開小冊(cè)子 W095/34672 號(hào))。當(dāng)向上述擴(kuò)增質(zhì)粒或者染色體上導(dǎo)入目的基因時(shí)，用于表達(dá)這些基因的啟動(dòng)子可 以是能夠在屬于腸桿菌科的細(xì)菌中發(fā)揮功能的任何啟動(dòng)子，可以是所使用的基因自身的啟動(dòng)子，也可以是經(jīng)修飾的啟動(dòng)子。也可以通過適當(dāng)?shù)剡x擇在屬于腸桿菌科的細(xì)菌中強(qiáng)力發(fā) 揮功能的啟動(dòng)子，或者通過使啟動(dòng)子的-35、-10區(qū)域與共有序列接近，來進(jìn)行基因表達(dá)量 的調(diào)節(jié)。如上所述的增強(qiáng)酶基因表達(dá)的方法，在W000/18935號(hào)小冊(cè)子、歐洲專利申請(qǐng)公開 1010755號(hào)說明書等中有記載。下面，對(duì)于給細(xì)菌賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力的具體方法、以及被賦予了 L-氨基酸生 產(chǎn)能力的細(xì)菌進(jìn)行舉例說明。L-半胱氨酸生產(chǎn)菌 L-半胱氨酸生產(chǎn)菌以及用于衍生L-半胱氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例可以列舉 出、但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如用編碼反饋抑制抗性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶 (SAT)的多種(^吐等位基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌譯15(美國(guó)專利第6，218，168號(hào))，具有編碼適 于向細(xì)胞分泌有毒物質(zhì)的蛋白質(zhì)的過表達(dá)基因的大腸桿菌W3110(美國(guó)專利第5，972，663 號(hào))，半胱氨酸脫巰基酶(cysteine desulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(特開平 11-155571號(hào)公報(bào))；由cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控物活性增強(qiáng)的大 腸桿菌W3110(W001/27307)等。本發(fā)明的細(xì)菌為經(jīng)過修飾而攜帶了具有特定突變的yeaS 基因的細(xì)菌。如下所述，yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)(下面，也稱為“YeaS蛋白質(zhì)”)被推測(cè)為 具有將L-半胱氨酸等L-氨基酸分泌到細(xì)胞外的活性。在大腸桿菌中，作為具有分泌L-半胱氨酸活性的公知的蛋白質(zhì)，已知了如上所述 的由ydeD編碼的蛋白質(zhì)(特開2002-233384)、由yfiK編碼的蛋白質(zhì)(特開2004-49237)、 由 emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、cusA 各基因編碼的蛋白質(zhì)(特開平 2005-287333)。除 了使細(xì)菌攜帶突變型yeaS基因之外，還可以增強(qiáng)它們的反饋抑制抗性的SAT的活性、L-半 胱氨酸分泌蛋白質(zhì)的活性。下面，作為賦予L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的方法，對(duì)增強(qiáng)L-半胱氨酸生物合成酶活性 的方法進(jìn)行說明。作為L(zhǎng)-半胱氨酸生物合成酶，可以列舉出例如，絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)。在屬 于腸桿菌科的細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)SAT活性，可以通過增加編碼SAT基因的拷貝數(shù)、或者通過 修飾編碼SAT基因的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列來實(shí)現(xiàn)。例如，將編碼SAT的基因片段，與在屬 于腸桿菌科的細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體、優(yōu)選多拷貝型載體連接制作重組DNA，并將其轉(zhuǎn)化導(dǎo) 入到屬于腸桿菌科的宿主細(xì)菌中即可。更為具體地，可以適用與后述的yeaS基因同樣的方 法。SAT基因可以任選埃希氏菌屬細(xì)菌來源的基因以及其他生物來源的基因使用。作 為大腸桿菌的編碼的SAT基因，從野生株以及L-半胱氨酸分泌突變株中克隆了 cysE，從而 得知其堿基序列(Denk, D. and Boeck, Α.，J. General Microbiol.，133，515-525 (1987))。 因此，使用基于該基因序列(SEQ IDNO 3)制成的引物，以埃希氏菌屬細(xì)菌的染色體DNA為 模板進(jìn)行PCR，可以獲得SAT基因(參考特開平11-155571號(hào))。其他生物的編碼SAT的基 因也可以同樣地獲得。通過上述方法得到的SAT基因，也可以像上述那樣進(jìn)行表達(dá)增強(qiáng)。而且，當(dāng)在SAT基因的表達(dá)中存在“L-半胱氨酸反饋抑制”等抑制機(jī)理時(shí)，通過修 飾表達(dá)調(diào)節(jié)序列或與抑制相關(guān)的基因從而使該抑制機(jī)制變?yōu)榉敲舾行缘?，也可以增?qiáng)SAT 基因的表達(dá)。例如，通過在屬于腸桿菌科的細(xì)菌中攜帶降低或解除了 L-半胱氨酸反饋抑制的SAT(下面，也稱為“突變型SAT”)，可以使SAT活性升高。作為突變型SAT，可以列舉出具有下述突變的SAT 用賴氨酸殘基以及亮氨酸殘基以外的氨基酸殘基取代相當(dāng)于野生型 SAT (SEQ ID NO 4)的第256位的甲硫氨酸殘基的氨基酸殘基的突變，或者從相當(dāng)于第256 位的甲硫氨酸殘基開始缺失C末端側(cè)的區(qū)域的突變。作為所述賴氨酸殘基以及亮氨酸殘基 以外的氨基酸殘基，可以列舉出，在通常構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，除甲硫氨酸殘基、賴氨酸 殘基以及亮氨酸殘基以外的17種氨基酸殘基?？梢粤信e出更優(yōu)選為異亮氨酸殘基或者谷 氨酸殘基。作為向野生型SAT基因中導(dǎo)入所期望的突變的方法，可以列舉出定點(diǎn)突變。作 為突變型SAT基因，已知編碼大腸桿菌的突變型SAT的突變型cysE (參考WO 97/15673號(hào) 國(guó)際公開小冊(cè)子、特開平11-155571號(hào))。攜帶了含有編碼由谷氨酸殘基取代第256位的甲 硫氨酸殘基的突變型SAT的突變型cysE的質(zhì)粒pCEM256E的大腸桿菌JM39-8菌株(大腸 桿菌JM39-8(pCEM256E)、內(nèi)部編號(hào)AJ13391)，已經(jīng)于平成9年(1997年)11月20日保藏于 工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地3 號(hào))，保藏號(hào)為FERMP-16527，并于2002年7月8日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，并 給予保藏號(hào)FERM BP-8112。在本發(fā)明中，“對(duì)L-半胱氨酸反饋抑制為非敏感性”既可以指如上所述的通過修 飾而使得對(duì)L-半胱氨酸的反饋抑制變?yōu)榉敲舾行?，也可以指原本就不受反饋抑制。已?擬南芥(Arabidopsis thaliana)的SAT為不受L-半胱氨酸反饋抑制，在本發(fā)明中優(yōu)選使 用。作為含有擬南芥來源的SAT基因的質(zhì)粒，已知的有pEAS-m(FEMS Microbiol. Lett.， 179(1999)453-459)。此外，通過增強(qiáng)編碼硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)蛋白質(zhì)群的cysPTWAM基因簇的 表達(dá)，也可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力(特開2005-137369號(hào)公報(bào)、EP1528108號(hào)說明 書)。此外，硫化物通過分別由cysK以及cysM基因編碼的0-乙酰絲氨酸(巰基)_裂 解酶-A或者B催化的反應(yīng)而被導(dǎo)入0-乙?；?L-絲氨酸，從而產(chǎn)生L-半胱氨酸。因此， 通過增強(qiáng)編碼這些酶的基因的表達(dá)也可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。用于增強(qiáng)目的基因的表達(dá)的修飾，可以例如，利用基因重組技術(shù)，通過提高細(xì)胞內(nèi) 的目的基因的拷貝數(shù)來進(jìn)行。例如，將含有目的基因的DNA片段，與在宿主細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮功能 的載體、優(yōu)選多拷貝型載體連接從而制成重組DNA，并將其導(dǎo)入細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可。另一方面，目的基因的拷貝數(shù)的提高，可以通過使目的基因在細(xì)菌的染色體DNA 上以多拷貝存在而實(shí)現(xiàn)。向細(xì)菌染色體DNA上導(dǎo)入目的基因可以利用后面針對(duì)突變型yeaS 基因描述的方法。另外，目的基因表達(dá)的增強(qiáng)，除了上述增大基因拷貝數(shù)之外，通過如在國(guó)際公開 00/18935號(hào)小冊(cè)子中記載的方法也可以實(shí)現(xiàn)將染色體DNA上或者質(zhì)粒上的yeaS基因的 啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列替換成強(qiáng)力的；或擴(kuò)增增強(qiáng)目的基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)子；或者缺失或 弱化降低目的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)子。作為使目的基因表達(dá)降低的調(diào)節(jié)子，已知的有Lrp蛋 白質(zhì)等(Kutukova et al.，F(xiàn)EBS Lett. 579. 4629-4634(2005))。作為強(qiáng)啟動(dòng)子，已知的 有例如Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子等。此外，通過向目的基因的啟動(dòng)子領(lǐng)域內(nèi)導(dǎo) 入堿基取代等，還可以修飾得到更強(qiáng)的啟動(dòng)子。通過這些啟動(dòng)子取代或者修飾可以強(qiáng)化 目的基因的表達(dá)。啟動(dòng)子強(qiáng)度的評(píng)價(jià)方法和強(qiáng)啟動(dòng)子的例子記載于Goldstein和Doi的論文(Goldstein, Μ. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryoticpromoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.，1，105-128)等中。而且，對(duì)表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾也可以與提高目的 基因拷貝數(shù)的方法進(jìn)行聚合。此外為了提高目的基因產(chǎn)物的生成，也可以在目的基因的翻 譯起始點(diǎn)附近導(dǎo)入突變從而提高翻譯效率，也可以將其與增強(qiáng)目的基因的表達(dá)相組合。對(duì)于目的基因表達(dá)的提高而言，可以通過將由該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量與野生株、或者非修飾株相比較來進(jìn)行確認(rèn)。作為評(píng)價(jià)mRNA的量的方法，可以列舉出Northern雜 交、RT-PCR 等(Sambrook, J. , et al. , MolecularCloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor LaboratoryPress, Cold spring Harbor(USA),2001)。使用抗體的蛋白質(zhì)印記(Western blot)可以對(duì)目的基因產(chǎn)物量的增加進(jìn)行確認(rèn) (上述 Molecular Cloning)。此外，通過抑制L-半胱氨酸分解系統(tǒng)，可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。抑 制L-半胱氨酸分解系統(tǒng)是指，細(xì)胞內(nèi)的L-半胱氨酸的分解活性與野生株或者親本 株等非修飾株相比有降低。作為承擔(dān)L-半胱氨酸分解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，已知的有胱硫 醚- β -裂解酶(metC 產(chǎn)物、特開平 11-155571 號(hào)，Chandraet. al.，Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)、色氨酸酶(tnaA 產(chǎn)物、特開 2003-169668，(Austin Newton et. al.， J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218) )、O-乙酰絲氨酸巰基水解酶B (cysM基因產(chǎn)物、特開 2005-245311)、以及malY基因產(chǎn)物(特開2005-245311)。通過使這些蛋白質(zhì)的活性降低， 從而提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。使蛋白質(zhì)的活性降低的修飾，例如，可以通過降低編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)來 實(shí)現(xiàn)。具體來說例如，通過使染色體上的基因的編碼區(qū)域的一部分或者全部缺損，可以降 低所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)的活性。此外，通過修飾基因的啟動(dòng)子或shine-dalgarno(SD)序 列等表達(dá)調(diào)節(jié)序列等，也可以降低基因的表達(dá)。此外，對(duì)表達(dá)調(diào)節(jié)序列以外的非翻譯區(qū)的修 飾也可以降低基因的表達(dá)量。而且，還可以缺失包括染色體上的基因的前后序列的整個(gè)基 因。此外，所述修飾還可以這樣完成通過向染色體上的目標(biāo)基因的編碼區(qū)域?qū)氚被?取代(錯(cuò)義突變)、或者導(dǎo)入終止密碼子(無義突變)、或者導(dǎo)入添加或缺失一 二個(gè)核苷 酸的移碼突變(Journal of biological Chemistry272 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences,USA955511-5515(1998),Journal of Biological Chemistry 266，20833-20839 (1991))。此外，只要是可以使目的蛋白質(zhì)的活性降低的修飾即可，也可以是通過X射線或 紫外線照射、或者N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍等突變劑進(jìn)行的常規(guī)突變處理引起的修 飾。就表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾而言，優(yōu)選為1個(gè)核苷酸以上，更優(yōu)選為2個(gè)核苷酸以上， 特別優(yōu)選為3個(gè)核苷酸以上。此外，在缺失編碼區(qū)域時(shí)，只要目標(biāo)蛋白質(zhì)的功能降低或缺失 即可，缺失的區(qū)域可以是N末端區(qū)域、內(nèi)部區(qū)域、C末端區(qū)域中的任何區(qū)域，也可以是整個(gè)編 碼區(qū)域。通常，缺失的區(qū)域較長(zhǎng)能夠切實(shí)地使基因失活。此外，優(yōu)選的是缺失區(qū)域的上游或 下游的讀碼框不一致。在目標(biāo)基因的編碼區(qū)域中插入其他序列時(shí)，可以為基因的任何區(qū)域，但插入的序 列較長(zhǎng)時(shí)能夠切實(shí)地使基因失活。插入部位的前后序列優(yōu)選讀碼框不一致。對(duì)于其他序列 沒有特殊限制，只要是能夠降低或缺損編碼的目的蛋白質(zhì)的功能即可，可以列舉例如攜帶抗生素抗性基因或?qū)-半胱氨酸生產(chǎn)有用的基因的轉(zhuǎn)座子等。L-蘇氨酸生產(chǎn)菌 作為具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的微生物優(yōu)選實(shí)例可以列舉出增強(qiáng)了 L-蘇氨酸生物 合成系統(tǒng)酶的1種或2種以上的活性的細(xì)菌。作為L(zhǎng)-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶，可以列舉出 天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)、thr操縱子所編碼的天冬氨酸 激酶I基因(thrA)、高絲氨酸激酶基因(thrB)、蘇氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)(aspC)。括號(hào)里為該基因的縮略符號(hào)(下文中也同樣)。這些酶中特別 優(yōu)選天冬氨酸半醛脫氫酶、天冬氨酸激酶I、高絲氨酸激酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因以及 蘇氨酸合酶。也可以將L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)基因?qū)胩K氨酸分解受到抑制的埃希氏屬 細(xì)菌中。作為蘇氨酸分解受到抑制的埃希氏菌屬細(xì)菌，例如可以列舉出蘇氨酸脫氫酶活性 缺損的TDH-6菌株(特開2001-346578號(hào))。L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶的活性受最終產(chǎn)物L(fēng)-蘇氨酸的抑制。因此，為了構(gòu) 建L-蘇氨酸生產(chǎn)菌，優(yōu)選對(duì)L-蘇氨酸生產(chǎn)菌合成系統(tǒng)進(jìn)行修飾以使所述酶不受L-蘇氨 酸的反饋抑制。上述thrA、thrB和thrC基因組成蘇氨酸操縱子，蘇氨酸操縱子形成弱化 子(attenuator)結(jié)構(gòu)，蘇氨酸操縱子的表達(dá)受到培養(yǎng)液中異亮氨酸和蘇氨酸的抑制，并 且表達(dá)受到弱化作用的抑制?？赏ㄟ^去除弱化區(qū)中的前導(dǎo)序列或弱化子來實(shí)現(xiàn)弱化作用 的消除或降低(Lynn, S. P.，Burton, W. S.，Donohue，T. J. , Gould, R. Μ.，Gumport，R. I., andGardner, J. F. J. Mol. Biol. 194 :59_69(1987)；國(guó)際公開第 02/26993 號(hào)小冊(cè)子；國(guó)際公 開第2005/049808號(hào)小冊(cè)子)。蘇氨酸操縱子的上游存在天然啟動(dòng)子，可用非天然啟動(dòng)子將其取代(參考 W098/04715號(hào)小冊(cè)子)，也可以構(gòu)建蘇氨酸操縱子使得蘇氨酸生物合成的相關(guān)的基因的表 達(dá)受到λ噬菌體的阻遏物Oppressor)和啟動(dòng)子的調(diào)控(參考?xì)W洲專利第0593792號(hào)說 明書)。此外，為了對(duì)細(xì)菌進(jìn)行修飾使其不受L-蘇氨酸的反饋抑制，可以通過選擇對(duì)α -氨 基-β-羥基戊酸(AHV)有抗性的菌株來獲得。對(duì)于如上所述經(jīng)修飾而不受L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子而言，優(yōu)選的 是其在宿主內(nèi)的拷貝數(shù)升高，或者是將其連接于強(qiáng)啟動(dòng)子而增加表達(dá)量。除了通過使用質(zhì) 粒的擴(kuò)增來增加拷貝數(shù)，還可以通過使用轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體等向基因組上轉(zhuǎn)入蘇氨酸操縱 子來提高拷貝數(shù)。理想的是，除了 L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶之外，還增強(qiáng)糖酵解系統(tǒng)、TCA、以及和 呼吸鏈中涉及的基因、調(diào)控這些基因表達(dá)的基因、和糖攝取基因。這些在L-蘇氨酸生產(chǎn)中 有效的基因的實(shí)例可以列舉出，轉(zhuǎn)氫酶基因(PntAB)(歐洲專利733712號(hào)說明)、磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶基因(PepC)(國(guó)際公開95/06114號(hào)小冊(cè)子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因 (pps)(歐洲專利877090號(hào)說明書)、棒狀桿菌型細(xì)菌或者芽孢桿菌屬細(xì)菌的丙酮酸羧化酶 基因(國(guó)際公開99/18228號(hào)小冊(cè)子、歐洲申請(qǐng)公開1092776號(hào)說明書)。此外，強(qiáng)化賦予L-蘇氨酸抗性的基因、賦予L-高絲氨酸抗性的基因的表達(dá)，或?qū)?宿主賦予L-蘇氨酸抗性、L-高絲氨酸抗性，也是合適的。作為賦予抗性的基因的實(shí)例，可 以列舉出rhtA基因(Res. Microbiol. 154 123-135 (2003))、rhtB基因(歐洲專利申請(qǐng)公開 第0994190號(hào)說明書)、rhtC基因(歐洲專利申請(qǐng)公開第1013765號(hào)說明書)、yfiK、yeaS 基因(歐洲專利申請(qǐng)公開第1016710號(hào)說明書)。此外關(guān)于對(duì)宿主賦予L-蘇氨酸抗性的方法，可以參考?xì)W洲專利申請(qǐng)公開第0994190號(hào)說明書、國(guó)際公開第90/04636號(hào)小冊(cè)子中所 記載的方法。L-蘇氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例，可以列舉出下述 屬于埃希氏菌屬的菌株，但并僅限于下述菌株大腸桿菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美 國(guó)專利第5，175，107號(hào)、美國(guó)專利第5，705，371號(hào))、大腸桿菌472T23/pYN7 (ATCC 98081) (美國(guó)專利第5，631，157號(hào))、大腸桿菌NRRL-21593 (美國(guó)專利第5，939，307號(hào))、大腸桿菌 FERMBP-3756 (美國(guó)專利第 5，474，918 號(hào))、大腸桿菌 FERM BP-3519 以及 FERMBP-3520 (美 國(guó)專利第 5,376,538 號(hào))、大腸桿菌 MG442 (Gusyatiner et al.，Genetika(俄語)，14， 947-956(1978))、大腸桿菌 VL643 以及 VL2055 (EPl 149911A)等。TDH-6菌株缺損thrC基因，是蔗糖同化型，此外其ilvA基因具有泄露(leaky)突 變。此外該菌株的rhU基因也有突變，該突變賦予了對(duì)高濃度的蘇氨酸或高絲氨酸的抗 性。B-3996菌株攜帶PVIC40質(zhì)粒，且該pVIC40是通過將含有突變的thrA基因的thrA*BC 操縱子插入到由RSF1010獲得的載體中而獲得。這種突變的thrA基因編碼的天冬氨酸激 酶高絲氨酸脫氫酶I的蘇氨酸反饋抑制基本上已被解除。B-3996菌株于1987年11月19 日被保藏于All-Union Scientific Center of Antibiotics (全聯(lián)盟抗生素科學(xué)中心) (Nagatinskaya Street 3-A，117105 Moscow，Russia)，保藏號(hào)為 RIA 1867。此夕卜，該菌株于 1987年4月7日被保藏于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (1 Dorozhny proezd.，1 Moscow 117545，Russia)，保藏號(hào)為 B-3996。
大腸桿菌VKPM B-5318(EP 0593792B)也可以作為L(zhǎng)-蘇氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍 生L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的親本株使用。B-5318菌株是非異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的，并且其質(zhì) 粒PVIC40中的蘇氨酸操作子的調(diào)控區(qū)域被溫度敏感的λ噬菌體阻遏物和ra啟動(dòng)子所取 代。VKPM B-5318在1990年5月3日國(guó)際保藏于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM， IDorozhny proezd.，IMoscow 117545，Russia)，保藏號(hào)為 VKPM B-5318。編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因已經(jīng)闡明(核苷酸編 號(hào) 337 2799，GenBank 登錄號(hào) NC_000913. 2，gi 49175990)。thrA 基因位于大腸桿菌 K-12 染色體上thrL基因和thrB基因之間。編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB基因已經(jīng)闡明 (核苷酸編號(hào) 2801 3733，GenBank 登錄號(hào) NC_000913. 2，gi 49175990)。thrB 基因位于 大腸桿菌K-12染色體上的thrA基因和thrC基因之間。編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的thrC 基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號(hào)3734 5020，GenBank登錄號(hào)NC_000913. 2，gi =49175990)。 thrC基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrB基因和yaaX開放閱讀框之間。這3個(gè)基因均 作為單獨(dú)的一個(gè)蘇氨酸操縱子發(fā)揮功能。為增加蘇氨酸操縱子的表達(dá)，優(yōu)選從操縱子中將 影響轉(zhuǎn)錄的弱化子區(qū)域去除(W02005/049808，W02003/097839)。編碼對(duì)蘇氨酸的反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA 基因，以及thrB基因和thrC基因，可以作為一個(gè)操縱子從熟知的pVIC40質(zhì)粒中獲得， 該質(zhì)粒存在與蘇氨酸生產(chǎn)株大腸桿菌VKPM B-3996中。有關(guān)pVIC40質(zhì)粒在美國(guó)專利第 5，705，371中有詳細(xì)的記載。rhtA基因存在于大腸桿菌染色體上的18分鐘處，并靠近編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 的成分的glnHPQ操縱子。rhtA基因與ORFl (ybiF基因，核苷酸編號(hào)764 1651，GenBank 登錄號(hào)AAA218541，gi =440181)相同，位于pexB與ompX基因之間。已將表達(dá)由ORFl編碼的蛋白質(zhì)的單位命名為rhtA基因(rht 對(duì)高絲氨酸和蘇氨酸有抗性)。此外，已經(jīng) 證明了 rhtA23突變是在相對(duì)于ATG起始密碼子的_1位置上的G — A取代(ABSTRACTS of the 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugationwith Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and MolecularBiology, San Francisco, California August 24-29,1997, abstract No. 457, EP1013765A)。大腸桿菌的asd基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號(hào)3572511 3571408，GenBank登錄號(hào) NC_000913. 1，gi 16131307)，且可以利用根據(jù)該基因的堿基序列制備的引物通過PCR獲得 (參考 White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185 (1989))。其他微生物的 asd 基因也可以 通過相同的方法獲得。
此外，大腸桿菌的aspC基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號(hào)983742 984932，GenBank登 錄號(hào)NC_000913. 1，gi 16128895)，且可以通過PCR獲得。其他微生物的aspC基因也可以 通過相同的方法獲得。L-賴氨酸生產(chǎn)菌屬于埃希氏菌屬的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的實(shí)例可以列舉出對(duì)L-賴氨酸類似物具有 抗性的突變株。L-賴氨酸類似物可抑制屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的生長(zhǎng)，但是這種抑制在當(dāng) L-賴氨酸共存于培養(yǎng)基中時(shí)會(huì)被全部或部分解除。L-賴氨酸類似物的實(shí)例可以列舉出、但 不限于，氧代賴氨酸，賴氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate), S_(2_氨乙基)_L_半胱氨酸 (AEC)，γ-甲基賴氨酸，α-氯代己內(nèi)酰胺等。將屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的人工誘 變處理可以得到對(duì)這些賴氨酸類似物具有抗性的突變株?？捎糜贚-賴氨酸生產(chǎn)的菌株的 具體實(shí)例可以列舉出大腸桿菌AJ11442(參考FERM BP-1543,NRRL B-12185 ；參見美國(guó)專利 第4，346，170號(hào))和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，L-賴氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的反饋 抑制已被解除。作為L(zhǎng)-賴氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-賴氨酸生產(chǎn)菌的親本株，可以列舉出 L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)酶的1種或者2種以上的活性被增強(qiáng)的菌株。作為涉及的酶 可以列舉出，但不限于二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氫吡啶 二羧酸還原酶(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶(ddh)(美國(guó) 專利第6，040，160號(hào))、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspC)、 二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(dapF)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)、四氫吡啶二羧酸琥珀酰 Sl (dapD) (tetrahydrodipicolinicacid succinylase)、砠 白酉先 二 M 基庚 二酸月兌酉先 Bl (dapE) (succinyl di amino pimelic acid deacylase)以及天冬氨酸酶基因(aspA) (EP1253195A)。在這些酶中，特別優(yōu)選為二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、 二氨基庚二酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、二氨基庚二酸差向 異構(gòu)酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脫酰 酶。此外，可以增加在親本株中下述基因的表達(dá)水平與能量效率相關(guān)的基因(cyo) (EP 1170376A)、編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的基因(pntAB)(美國(guó)專利第5，830，716號(hào))、71^飛基 因(W02005/073390)、或它們的組合。作為用于衍生L-氨基酸生產(chǎn)菌的親本株的例子，可以列舉催化通過從L-氨基酸 生物合成途徑分支而生成L-賴氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶的活性減少或者缺損的菌株。作為催化通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支而生成L-賴氨酸之外的化合物的反應(yīng)的 酶的例子，可以列舉出高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(美國(guó)專利第5，827，698號(hào))、和蘋果 酸酶(W02005/010175)。對(duì)于酶活性的降低而言，可以通過例如、使染色體上的目標(biāo)酶基因的編碼區(qū)域的 一部分或者全部缺損、以及向編碼區(qū)域中插入其他序列來實(shí)現(xiàn)。這樣的手段也稱為基因破 壞。此外，通過修飾目標(biāo)基因的啟動(dòng)子或Shine-Cklgarno(SD)序列等表達(dá)調(diào)節(jié)序列等來降 低目標(biāo)基因的表達(dá)，也可以使該基因失活。表達(dá)的降低中包括轉(zhuǎn)錄的降低和翻譯的降低。此 夕卜，對(duì)表達(dá)調(diào)節(jié)序列以外的非翻譯區(qū)的修飾也可以降低基因表達(dá)量。而且，還可以缺失包括染色體上的目標(biāo)基因的前后序列的整個(gè)目標(biāo)基因。此外，所 述目標(biāo)基因的失活還可以這樣完成通過向染色體上的目標(biāo)基因的編碼區(qū)域?qū)氚被崛?代(錯(cuò)義突變)、或者導(dǎo)入終止密碼子(無義突變)、或者導(dǎo)入添加或缺失一 二個(gè)核苷酸 的移碼突變(Journal of biologic alChemistry 272:8611—8617(1997)，Proceedings of the National Academy ofSciences, USA 955511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 266，20833-20839 (1991))?？梢耘e出大腸桿菌WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2作為優(yōu)選的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株 (W02006/078039)。該菌株為從WC196菌株出發(fā)，破壞其編碼賴氨酸脫羧酶的cadA以及IdcC 基因，并向其導(dǎo)入含有賴氨酸生物合成系統(tǒng)基因的PCABD2質(zhì)粒(美國(guó)專利第6，040, 160 號(hào))而構(gòu)建的菌株。WC196菌株為從來源于大腸桿菌K-12的W3110菌株獲取的菌株，該菌 株為用突變型IysC基因取代W3110菌株的染色體上的野生型IysC基因后，并通過賦予以 AEC抗性而培育的菌株(美國(guó)專利5，827，698)，該突變型IysC基因?yàn)榫幋a用異亮氨酸取代 了第352位的蘇氨酸從而解除了 L-賴氨酸的反饋抑制的天冬氨酸激酶III的突變型IysC 基因(美國(guó)專利第5，661，012號(hào))。WC196菌株被命名為大腸桿菌AJ13069，并于1994年12 月6日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究 所專利微生物保藏中心，郵編305-8566，日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保 藏號(hào)為FERM P-14690。其后根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1995年9月29日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏， 并賦予保藏號(hào)FERM BP-5252(美國(guó)專利第5,827,698號(hào))。WC196 Δ cadA Δ IdcC本身也為 優(yōu)選的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株。WC196 Δ cadA Δ IdcC被命名為AJl 10692，于2008年10月7日 在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利微生物保藏中心(郵編305-8566，日本茨城縣筑 波市東1 丁目1番地1中央第6)進(jìn)行國(guó)際保藏，并賦予保藏號(hào)!7ERM BP-11027。pCABD2為含有下述基因的質(zhì)粒編碼具有解除了 L-賴氨酸反饋抑制的突變的編 碼大腸桿菌來源的二氫吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的突變型dapA基因、編碼具有解除了 L-賴氨酸反饋抑制的突變的來源于大腸桿菌的天冬氨酸激酶III的突變型IysC基因、編碼 大腸桿菌來源的二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因、編碼乳發(fā)酵短桿菌來源的二氨基庚 二酸脫氫酶的ddh基因(國(guó)際公開第W095/16042、W001/53459號(hào)小冊(cè)子)。L-亮氨酸生產(chǎn)菌L-亮氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-亮氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例可以列舉出、 但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如對(duì)亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌株(例如，菌株 57 (VKPM B-7386，美國(guó)專利第6，124，121號(hào)))或?qū)α涟彼犷愃莆?包括β _2_噻吩基丙氨 酸、3-羥基亮氨酸、4-偶氮亮氨酸、5，5，5_三氟亮氨酸等)有抗性的大腸桿菌菌株(特公昭62-34397號(hào)和特開平8-70879號(hào))、通過W096/06926中描述的基因工程方法獲得的大腸桿 菌菌株；大腸桿菌H-9068 (特開平8-70879號(hào))等?？梢酝ㄟ^增加涉及L-亮氨酸生物合成的一種以上的基因的表達(dá)來改進(jìn)本發(fā)明中 使用的細(xì)菌。這些基因的實(shí)例可優(yōu)選列舉以編碼解除了 L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果 酸合酶的突變IeuA基因(美國(guó)專利第6，403，342號(hào))為代表的、IeuAB⑶操縱子中的基 因。此外，可以通過增加編碼從細(xì)菌細(xì)胞分泌L-氨基酸的蛋白質(zhì)的一種以上的基因的表 達(dá)來改進(jìn)本發(fā)明中使用的細(xì)菌。這類基因的實(shí)例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因) (EP1239041A2)。L-組氨酸生產(chǎn)菌 L-組氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-組氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例可以列舉出，但 不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌24菌株(VKPMB-5945，RU2003677)；大腸 桿菌 80 菌株(VKPM B-7270, RU2119536)；大腸桿菌 NRRL B-12116-B12121 (美國(guó)專利第 4，388，405 號(hào))；大腸桿菌 H-9342(FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美國(guó)專利第 6，344，347 號(hào))；大腸桿菌 H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)；大腸桿菌 AI80/pFM201 (美 國(guó)專利第6，258，554號(hào))等。L-組氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-組氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例還可以列舉出， 編碼L-組氨酸生物合成系統(tǒng)酶的一種以上的基因的表達(dá)增加的菌株。作為涉及的基因，可 以列舉出，ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP環(huán)化水解酶基因(hisl)、磷 酸核糖基AMP環(huán)化水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基亞氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷 酸異構(gòu)酶基因(hisA)、酰胺轉(zhuǎn)移酶基因(hisH)、組氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(hisC)、組氨 醇磷酸酶基因(hisB)、組氨醇脫氫酶基因(hisD)等。已知hisG和hisBHAFI編碼的L-組氨酸生物合成酶被L-組氨酸所抑制，因此還 可以通過向ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(hisG)中導(dǎo)入誘導(dǎo)對(duì)反饋抑制有抗性的突變來有 效地增加生產(chǎn)L-組氨酸的能力(俄羅斯專利2003677和2119536)。具有L-組氨酸生產(chǎn)能力的菌株具體實(shí)例可以列舉出FERM-P 5038和5048，已經(jīng)向 其中導(dǎo)入了攜帶編碼L-組氨酸生物合成酶的DNA的載體(特開昭56-005099號(hào))，導(dǎo)入了用 于氨基酸輸送的基因的大腸桿菌菌株(EP1016710A)，賦予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙 氨酸和鏈霉素抗性的大腸桿菌80菌株(VKPM B-7270，俄羅斯專利2119536)等。L-谷氨酸生產(chǎn)菌L-谷氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-谷氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例，可以列舉 出，但不限于大腸桿菌VL334thrC+(EP 1172433)等屬于埃希氏菌屬的菌株。大腸桿菌 VL334(VKPM B-1641)是L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并且在thrC和ilvA基 因有突變(美國(guó)專利4，278，765)。利用可在野生型大腸桿菌菌株K12 (VKPM B-7)細(xì)胞中增 殖的噬菌體Pl，通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法來轉(zhuǎn)移thrC基因的野生型等位基因。結(jié)果，獲得了 L-異 亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的L-谷氨酸生產(chǎn)菌VL334thrC+(VKPM B-8961)。L-谷氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-谷氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例，可以列舉出，但 不限于下述菌株，所述菌株為L(zhǎng)-谷氨酸生物合成系統(tǒng)酶的1種或者2種以上的活性被增 強(qiáng)的菌株。涉及的基因的實(shí)例可以列舉出，谷氨酸脫氫酶(gdhA)、谷氨酰胺合酶(glnA)、 谷氨酸合酶(gltAB)、異檸檬酸脫氫酶(icdA)、順烏頭酸水合酶(acnA，acnB)、檸檬酸合酶(gltA)、甲基檸檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脫氫酶(aceEF， lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油 變位酶(pgmA，pgml)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛_3_磷酸脫氫酶(gapA)、丙糖磷酸異 構(gòu)酶(tpiA)、果糖二磷酸醛縮酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)、葡糖磷酸異構(gòu)酶(pgi) 等。這些酶中，優(yōu)選谷氨酸脫氫酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基檸檬酸合 酶。經(jīng)修飾而增加了檸檬酸合成酶(citrate synthetase)基因、磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶基因和/或谷氨酸脫氫酶基因的表達(dá)的菌株的實(shí)例可以列舉出在EP1078989A、 EP955368A和EP952221A中公開的那些菌株。L-谷氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-谷氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例可以列舉出如 下菌株，該菌株為減少或缺損催化從L-谷氨酸生物合成途徑中分支并合成L-谷氨酸 以外的化合物的酶的活性的菌株。作為這樣的酶的實(shí)例，可以列舉出，異檸檬酸裂合酶 (aceA)、α-酮戊二酸脫氫酶(sucA)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羥酸 合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvl)、甲酸乙酰 轉(zhuǎn)移酶(pfl)、乳酸脫氫酶(Idh)、谷氨酸脫 羧酶(gadAB)等。α-酮戊二酸脫氫酶活性的缺損、以及α -酮戊二酸脫氫酶活性的降低 的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌、以及獲得這些細(xì)菌的方法在美國(guó)專利第5，378，616號(hào)以及第 5，573，945號(hào)中有所記載。作為具體實(shí)例可以列舉出下述細(xì)菌。大腸桿菌 W3IIOsucA Kmr大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)大腸桿菌AJ12628(FERM BP-3854)大腸桿菌AJ12949(FERM BP-4881)大腸桿菌W3110sucA: :Kmr是通過破壞大腸桿菌W3110的α -酮戊二酸脫氫酶基 因(下面，也稱為“sucA基因”)而得到的菌株。該菌株的α-酮戊二酸脫氫酶完全缺損。L-谷氨酸生產(chǎn)菌的其他實(shí)例還可以列舉出屬于埃希氏菌屬，并且具有對(duì)天冬氨 酸代謝拮抗物的抗性的細(xì)菌。這些菌株也可以是α-酮戊二酸脫氫酶缺損的菌株，可以列 舉出，例如大腸桿菌AJ13199(FERM BP-5807)(美國(guó)專利第5，908，768號(hào))、進(jìn)一步降低了 L-谷氨酸分解能力的FERM卩-12379(美國(guó)專利第5，393，671號(hào))；AJ13138 (FERM BP-5565) (美國(guó)專利第6，110，714號(hào))等。作為Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產(chǎn)菌的實(shí)例，可以列舉出Pantoeaananatis AJ13355株。該菌株是作為低pH下能夠在含有L-谷氨酸和碳源的培養(yǎng)基中增殖的菌株從 靜岡縣磐田市的土壤中分離出來的菌株。Pantoeaananatis AJ13355株已于1998年2月19 日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(地址郵政編碼305-8566 日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號(hào)為FERM P-16644，并于1999年1 月11日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，并給予保藏號(hào)FERM BP-6614。而且，該菌株在 分離時(shí)被鑒定為成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)，并當(dāng)作成團(tuán)腸桿菌AJ13355進(jìn) 行了保藏。但是，近年來，基于16S rRNA核苷酸序列分析等，該細(xì)菌被重新分類為Pantoea ananatisο此外，作為Pmtoea mmatis的L-谷氨酸生產(chǎn)菌，可以列舉出α -酮戊二酸脫氫酶(aKGDH)活性缺損、或者α KGDH活性降低的屬于泛菌屬的細(xì)菌。作為這樣的菌株有AJ13355和α KGDH-El亞基基因(sucA)缺損而得到的菌株AJ13356 (美國(guó)專利第6，331,419 號(hào))，以及從AJ13355株中作為粘液質(zhì)低生產(chǎn)突變菌株選擇出來的SC17株來源的sucA基因 缺損株SC17sucA(美國(guó)專利第6，596，517號(hào))。AJ13355株已于1998年2月19日保藏于工 業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，郵政編 碼305-8566茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號(hào)為FERMP-16645，并于1999 年1月11日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，并給予保藏號(hào)FERM BP-6616。AJ13355以 及AJ13356在上述的保藏機(jī)構(gòu)中是作為Enterobacter agglomerans保藏的，但在本說明書 中，記載為Pantoeaananatis。此外，SC17sucA株的內(nèi)部編號(hào)為AJ417株，已于2004年2月 26日保藏于產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏號(hào)FERM BP-08646。此外，作為Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產(chǎn)菌，可以列舉出SC17sucA/ RSFCPG+pSTVCB 菌株、AJ13601 菌株、NP106 菌株以及 NAl 菌株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株是在SC17sucA株中導(dǎo)入了包含大腸桿菌來源的檸檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶基因(PPsA)和谷氨酸脫氫酶基因(gdhA)的質(zhì)粒RSFCPG，以及導(dǎo)入了包含乳發(fā)酵 短桿菌來源的檸檬酸合酶基因(gltA)的質(zhì)粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601菌株是從該 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株中作為低pH下顯示出對(duì)高濃度L-谷氨酸的抗性的菌株而選擇 出的菌株。此外，NP106株是如實(shí)施例所述那樣，質(zhì)粒RSFCPG+pSTVCB從AJ13601株脫落而 得到的菌株。AJ13601菌株已于1999年8月18日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究 所專利生物保藏中心(地址郵政編碼305-8566日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央 第6)，保藏號(hào)為FERM P-17516，并于2000年7月6日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏， 并給予保藏號(hào)FERM BP-7207。L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例，可以列 舉出，但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶以及酪氨酸 阻遏物缺損的 E. coli AJ12739(tyrA: :TnlO, tyrR) (VKPMB-8197) (W003/044191),攜帶 了編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶_預(yù)苯酸脫氫酶的突變型pheA34基因的E. coli HW1089 (ATCC 55371)(美國(guó)專利第 5，354，672 號(hào))，E. coli MWEC101-b (KR8903681)、Ε· coli NRRL B-1214U NRRL B-12145、NRRL B-12146 以及 NRRL B-12147 (美國(guó)專利第 4，407，952 號(hào))等。此外，也可以使用攜帶了編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基 因的大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)以及 AJ 12604 和命名為大腸桿菌 K-12[W3110 (tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB] (FERM BP-3579)作為 親本株(EP 488424B1)。此外，此外，還可使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質(zhì)的活 性增加的屬于埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌(美國(guó)專利申請(qǐng)公開2003/0148473A1以及 2003/0157667AUW003/044192)。L-色氨酸生產(chǎn)菌L-色氨酸生產(chǎn)菌和用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例，可以列舉出，但 不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/ PMU91 (DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺損，該酶由突變的trpS基因編碼(美國(guó)專利第5，756，345號(hào))；大腸桿菌SV164(pGH5)，其具有編碼對(duì)絲氨酸反饋抑制有抗性的磷 酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼對(duì)色氨酸反饋抑制有抗性的鄰氨基苯甲酸合酶 (anthranilate synthase)的trpE等位基因(美國(guó)專利第6，180，373號(hào))；色氨酸酶缺 陷的大腸桿菌 AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264)(美 國(guó)專利第4，371，614號(hào))；磷酸烯醇丙酮酸的生產(chǎn)能力增加的大腸桿菌AGX17/pGX50， 口八0 41口8(109708333，美國(guó)專利第6，319，696號(hào))等。還可以使用由yedA基因或yddG 基因編碼的蛋白質(zhì)活性增強(qiáng)的屬于埃希氏菌屬的L-色氨酸生產(chǎn)菌(美國(guó)專利申請(qǐng)公開 2003/0148473A1和 2003/0157667A1)。L-色氨酸生產(chǎn)菌和用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例還可以列舉出下述 菌株，該菌株的從鄰氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)、3_脫氧_D_阿拉伯 庚酮醛酸-7-磷酸合酶(3- r才# * -D- 7，if 7 7 a >酸-7- ij >酸* >夕一七) (aroG)、3_脫氫奎寧酸合酶(aroB)、莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5_烯醇丙酮 酷莽草酸 3-憐酸合醇(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase) (aroA)禾口分支 酸合酶(aroC)、預(yù)苯酸脫水酶、分支酸變位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中選擇1種或2種以 上的酶的活性被增強(qiáng)。預(yù)苯酸脫水酶以及分支酸變位酶作為2個(gè)功能酶(CM-PD)，由pheA 基因編碼。在這些酶中，特別優(yōu)選磷酸甘油酸脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮醛酸-7-磷酸 合酶、3-脫氫奎寧酸合酶、莽草酸脫水酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、 分支酸合酶、預(yù)苯酸脫水酶、分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油 酸脫氫酶兩者均受L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此也可以向這些酶中導(dǎo)入使反饋 抑制解除的突變。具有此類突變的菌株的具體實(shí)例包括具有脫敏的鄰氨基苯甲酸合酶的大 腸桿菌SV164菌株和通過將質(zhì)粒pGH5 (W0 94/08031)轉(zhuǎn)入大腸桿菌SV164獲得的菌株，所 述質(zhì)粒PGH5包含突變的serA基因，該突變的serA基因編碼反饋抑制被解除了的磷酸甘油 酸脫氫酶。L-色氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例還可以列舉出， 導(dǎo)入了色氨酸操縱子的菌株，所述色氨酸操縱子包含編碼抑制解除型鄰氨基苯甲酸合酶的 基因(特開昭57-71397號(hào)，特開昭62-244382號(hào)，美國(guó)專利4，371，614)。此外，可以也通過 增加色氨酸操縱子(trpBA)中編碼色氨酸合酶的基因的表達(dá)來賦予L-色氨酸生產(chǎn)能力。色 氨酸合酶由a和0亞基組成，這兩種亞基分別由trpA和trpB編碼。另外，還可以通過增強(qiáng) 異檸檬酸裂解酶_蘋果酸合酶操縱子的表達(dá)來改進(jìn)L-色氨酸生產(chǎn)能力(W02005/103275)。L-脯氨酸生產(chǎn)菌L-脯氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-脯氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例，可以列舉出， 但不限于下述埃希氏菌屬的菌株，如ilvA基因缺陷并且能夠產(chǎn)生L-脯氨酸的大腸桿菌 702ilvA(VKPM B-8012) (EP 1172433)等?？梢酝ㄟ^增強(qiáng)涉及L-脯氨酸生物合成的1種以上的基因的表達(dá)來改進(jìn)本發(fā)明中 使用的細(xì)菌。用于L-脯氨酸生產(chǎn)菌的優(yōu)選基因的實(shí)例可以列舉出，編碼解除了 L-脯氨酸 反饋抑制的谷氨酸激酶的proB基因(德國(guó)專利第3127361號(hào))。此外，可以通過增加編碼 從細(xì)菌細(xì)胞分泌L-氨基酸的蛋白質(zhì)的1種以上的基因的表達(dá)來改進(jìn)本發(fā)明中使用的細(xì)菌。 這些基因包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。具有L-脯氨酸生產(chǎn)能力的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的實(shí)例NRRLB-12403和NRRLB-12404(英國(guó)專利第2075056號(hào))，VKPM B-8012 (俄羅斯專利申請(qǐng)2000124295)，德國(guó)專 利第 3127361 中描述的質(zhì)粒突變體，Bloom F. R.等(The 15th Miami Winter Symposium, 1983，p.34，等)。L-精氨酸生產(chǎn)菌L-精氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-精氨酸生產(chǎn)菌的親本株，可以列舉出，但不限于 下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌237菌株(VKPM B-7925)(美國(guó)專利申請(qǐng)公開 2002/058315A1)，及攜帶了突變的 N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase) 的衍生菌株(俄羅斯專利申請(qǐng)第2001112869號(hào))，大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926) (EP1170358A1)，導(dǎo)入了編碼 N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的 argA基因的精氨酸生產(chǎn)株(EP1170361A1)等。L-精氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-精氨酸生產(chǎn)菌的親本株，可以列舉出，編碼L-精 氨酸生物合成酶的1種以上基因的表達(dá)增加的菌株。涉及的基因的實(shí)例可以列舉出N-乙 酰谷氨酰磷酸還原酶基因(argC)、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因 (argB)、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(argD)、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因(argF)、精氨琥珀酸 合成酶基因(argG)、精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲?；姿岷铣擅富?carAB)。L-纈氨酸生產(chǎn)菌 L-纈氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-纈氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例可以列舉出，但不 限于經(jīng)修飾而過量表達(dá)ilvGMEDA操縱子的菌株(美國(guó)專利第5，998，178號(hào))。優(yōu)選將衰減 所需的ilvGMEDA操縱子的區(qū)域移除以使操縱子的表達(dá)不會(huì)被產(chǎn)生的L-纈氨酸所削弱。此 夕卜，優(yōu)選將操縱子中的ilvA基因破壞從而降低蘇氨酸脫氨酶的活性。L-纈氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-纈氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例還可以列舉出，具 有氨酰t-RNA合成酶突變的突變株(美國(guó)專利第5，658，766號(hào))。例如，可以使用大腸桿菌 VL1970，該菌株在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具有突變。已將大腸桿菌VL1970 在1988年6月24日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (IDorozhny Proezd.， IMoscowl 17545，Russia)，保藏號(hào)為 VKPM B-4411。此外，還可以使用生長(zhǎng)需要硫辛酸(lipoic acid)的突變株和/或缺乏H+-ATP酶 的突變株(W096/06926)作為親本株。L-異亮氨酸生產(chǎn)菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例可以列舉出、 但不限于對(duì)6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突變株(特開平5-304969號(hào))，對(duì)異亮氨酸類似物 如硫代異亮氨酸(thiaisoleucine)和異亮氨酸氧肟酸具有抗性的突變株，以及對(duì)DL-乙硫 氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突變株(特開平5-130882號(hào))。此 夕卜，還可以使用以編碼涉及L-異亮氨酸生物合成的蛋白質(zhì)(如蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥酸合 酶(acetohydroxate synthase)等)的基因轉(zhuǎn)化的重組菌株(特開平2-458號(hào)，F(xiàn)R0356739， 和美國(guó)專利第5，998，178號(hào))作為親本株。L-酪氨酸生產(chǎn)菌作為酪氨酸生產(chǎn)菌的例子，可以列舉出具有不受酪氨酸抑制的脫敏型預(yù)苯酸脫水 酶基因(tyrA)的埃希氏菌屬細(xì)菌(歐洲專利申請(qǐng)公開1616940號(hào)公報(bào))。為了提高本發(fā)明中使用的細(xì)菌的甘油同化型，可以弱化glpR基因的表達(dá)(EP1715056)，也可以強(qiáng)化 glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、 tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa 以及 talC 基因等甘油代謝基因(EP1715055A)的表達(dá)。(突變型yeaS基因)本發(fā)明的細(xì)菌可以通過修飾如上所述具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的 細(xì)菌，從而使其攜帶具有特定突變的突變型yeaS基因而獲得。但是，也可以在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行 上述修飾后，賦予其L-氨基酸生產(chǎn)能力。對(duì)于“特定的突變”將在后面 進(jìn)行描述。將不具 有所述特定突變的yeaS基因稱為“野生型yeaS基因”。對(duì)于不具有所述特定突變的yeaS 基因，只要具有增強(qiáng)其在腸桿菌中的表達(dá)時(shí)、能夠使L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力與非修飾株相 比有所提高的活性即可，即使有其他的突變，也稱為野生型yeaS基因。下面，針對(duì)于yeaS基因進(jìn)行說明。作為本發(fā)明的yeaS基因，具體地可以列舉出含有SEQ ID NO :1中所示的堿基序 列的基因。SEQ ID NO :1表示的是大腸桿菌的野生型yeaS基因的堿基序列。此外，SEQ ID NO 1表示了該基因編碼的氨基酸序列。已知通過增強(qiáng)yeaS基因的表達(dá)，可以提高各種氨基酸的生產(chǎn)能力 (FEBSLett. 579. 4629-4634 (2005))，但是對(duì)于L-半胱氨酸和yeaS基因之間的關(guān)系尚屬未 知。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過增強(qiáng)yeaS基因的表達(dá)，可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。yeaS基因，只要編碼具有下述活性的蛋白質(zhì)即可，所述活性是指當(dāng)增強(qiáng)該蛋白 質(zhì)在腸桿菌中的表達(dá)時(shí)，與非修飾株相比，能夠使L-氨基酸生產(chǎn)能力提高。yeaS基因也可 以為編碼具有在上述氨基酸序列中，在1個(gè)或數(shù)個(gè)位置上取代、缺失、插入或添加1個(gè)或者 數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。在這種情況下，增強(qiáng)在腸桿菌中的表達(dá) 時(shí)與非修飾株相比使L-氨基酸生產(chǎn)能力提高的活性的含義是指，與取代、缺失、插入或添 加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸之前的蛋白質(zhì)相比，保持了 70%以上的活性，優(yōu)選保持了 80%以上，更 優(yōu)選保持了 90%以上的活性。而且，上述“1個(gè)或數(shù)個(gè)”根據(jù)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)的立體結(jié) 構(gòu)中的位置或者氨基酸殘基的種類有所不同，但具體來說優(yōu)選為1 20個(gè)、更優(yōu)選為1 10個(gè)，更為優(yōu)選為1 5個(gè)。上述的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或者添加為可以正常維持蛋白質(zhì)的 功能的保守突變。保守突變的代表為保守取代。保守取代是指，當(dāng)取代部位為芳香族氨基 酸時(shí)，在Phe、Trp、Tyr之間相互取代；當(dāng)取代部位為疏水性氨基酸時(shí)，在Leu、lie、Val間 之間相互取代；當(dāng)為極性氨基酸時(shí)，在Gin、Asn之間相互取代；當(dāng)為堿性氨基酸時(shí)，在Lys、 Arg、His之間相互取代；當(dāng)為酸性氨基酸時(shí)，在Asp、Glu之間相互取代；當(dāng)為具有羥基的氨 基酸時(shí)，為在Ser、Thr之間相互取代的突變?？梢暈楸Ｊ厝〈娜〈唧w的可以列舉出， 用 Ser 或 Thr 取代 Ala、用 GlruHis 或 Lys 取代 Arg、用 Glu、Gln、Lys、His 或 Asp 取代 Asn、 用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp、用 Ser 或 Ala 取代 Cys、用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gin、用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu、用 Pro 取代 Gly、用 Asn、Lys、Gln、Arg 或 Tyr 取 代 His、用 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代 lie、用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu、用 Asn、Glu、 GlruHis 或 Arg 取代 Lys、用 Ile、Leu、Val 或 Phe 取代 Met、用 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 取 代Phe、用Thr或Ala取代Ser、用Ser或Ala的取代Thr、用Phe或Tyr的取代Trp、用His、 Phe或Trp取代Tyr、以及用Met、Ile或Leu的取代Val。此外，就上述這樣的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或者倒位等而言，還包括因基因來源的細(xì)菌的個(gè)體差異、種間差異等情 況而天然發(fā)生的突變(mutant或variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺失、插入、添加或者倒位。作為編碼保持提高宿主細(xì)胞的L-氨基酸生產(chǎn)能力的活性、且具有取代、缺失、插 入或添加1個(gè)或者數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的YeaS蛋白質(zhì)的基因，具體來說，可以 列舉出，編碼具有選自下述突變中的1種或2種以上突變的YeaS蛋白質(zhì)等的基因，所述突 變是指在SEQ ID NO 2中，具第11位的色氨酸殘基被甘氨酸取代的突變、第33位的賴氨 酸殘基被精氨酸取代的突變、第52位的異亮氨酸殘基被纈氨酸取代的突變、第59位的苯丙 氨酸殘基被絲氨酸取代的突變、第60位的亮氨酸殘基被谷氨酰胺取代的突變、第65位的纈 氨酸殘基被谷氨酸取代的突變、第72位蘇氨酸殘基被丙氨酸取代的突變、第77位天冬酰胺 殘基被絲氨酸取代的突變、第85位苯丙氨酸殘基被異亮氨酸取代的突變、第86位酪氨酸殘 基被苯丙氨酸取代。這些突變，在下述的實(shí)施例2中被推定為沒有使活性降低的沉默突變。 此外，保守突變并不僅限于上述突變，如實(shí)施例2所示的一樣，從人為的向yeaS基因內(nèi)導(dǎo)入 隨機(jī)突變而得到的突變體中，也可以獲得編碼下述YeaS蛋白質(zhì)的基因，該YeaS蛋白質(zhì)維持 了增強(qiáng)在腸桿菌中的表達(dá)時(shí)使L-氨基酸生產(chǎn)能力提高的活性、且具有1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被 取代而得到的氨基酸序列。 此外，也可以為下述蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與具有上述這樣的保守突變的基因編碼的 氨基酸序列全體相比，具有80%以上的同源性，優(yōu)選具有90%以上、更優(yōu)選具有95%以上、 更為優(yōu)選具有97%以上、特別優(yōu)選具有99%以上的同源性，且增強(qiáng)其在腸桿菌中的表達(dá)時(shí) 與非修飾株相比具有使L-半胱氨酸生產(chǎn)能力提高的活性。編碼上述這樣的與yeaS具有同 源性的蛋白質(zhì)的基因(yeaS同源物)的序列信息，可以以上述大腸桿菌菌株的野生型yeaS 基因作為提問序列，使用BLAST檢索或FASTA檢索，從公開的數(shù)據(jù)庫中容易地獲取，可以通 過使用基于該公知的基因序列作成的寡核苷酸作為引物獲得yeaS同源物。而且，在本說明 書中，“同源性(homoloyg)”有些情況下是指“同一性(identity)”。此外，yeaS基因只要編碼具有增強(qiáng)其在腸桿菌中的表達(dá)時(shí)與非修飾株相比具有使 L-氨基酸生產(chǎn)能力提高的活性的蛋白質(zhì)即可，還可以為與上述堿基序列互補(bǔ)的序列、或者 能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交的基因?！皣?yán)格條件”可以列舉出下述條 件，例如在60°C，1 X SSC、0. 1 % SDS優(yōu)選0. 1 X SSC、0. 1 % SDS相當(dāng)?shù)柠}濃度下，洗滌1次優(yōu) 選2 3次的條件。上述雜交用探針也可以為基因的互補(bǔ)序列的一部分。這樣的探針，可以以基于公 知的基因序列制得的寡核苷酸為引物，以包含這樣的堿基序列的DNA片段為模板，通過PCR 反應(yīng)來制備。當(dāng)作為探針使用300bp左右長(zhǎng)度的DNA片段時(shí)，上述雜交的洗滌條件可以列 舉出為 50°C、2XSSC、0. 1% SDS0就增加在腸桿菌中的表達(dá)時(shí)與非修飾株相比具有使L-氨基酸生產(chǎn)能力提高的活 性而言，是指賦予下述能力的活性，所述能力為增加了在腸桿菌中的表達(dá)時(shí)，與非修飾株， 例如與野生株或親本株相比，可以生產(chǎn)更多數(shù)量的L-氨基酸，例如L-半胱氨酸，并在培養(yǎng) 基中積累的能力，優(yōu)選賦予可以積累高達(dá)0. lg/L以上、更優(yōu)選高達(dá)0. 2g/L以上、特別優(yōu)選 高達(dá)0. 3g/L以上L-氨基酸的能力的活性。是否具有增加在腸桿菌中的表達(dá)時(shí)與非修飾株相比具有使L-氨基酸生產(chǎn)能力提 高的活性，可以通過下述方法確認(rèn)，基于野生株或親本株制作使編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)菌，將其在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并定量培養(yǎng)基中積累的L-氨基酸的量。L-氨基酸為 L-半胱氨酸時(shí)，野生株或親本株可以列舉出在大腸桿菌MG1655菌株中使編碼解除了反饋 抑制的突變型SAT基因增強(qiáng)了的菌株。 為了得知是否具有增加在腸桿菌中的表達(dá)時(shí)與非修飾株相比具有使L-氨基酸生 產(chǎn)能力提高的活性，也可以通過該基因的表達(dá)被增強(qiáng)了的細(xì)菌在含有比野生株或親本株濃 度更高的L-氨基酸的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁育比野生株或親本株的生長(zhǎng)繁育更為良好來確 認(rèn)，即，通過調(diào)查L(zhǎng)-氨基酸抗性來容易地得到確認(rèn)。L-氨基酸為L(zhǎng)-半胱氨酸時(shí)，具體來說， 可以在含有0. 1 IOmM左右的L-半胱氨酸的培養(yǎng)基中接種細(xì)菌，在10小時(shí) 120小時(shí)后 的適當(dāng)時(shí)間測(cè)定菌落的直徑，通過該數(shù)值大于野生株或親本株進(jìn)行確認(rèn)。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn) 與非修飾株相比使宿主細(xì)胞的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力提高的活性與L-半胱氨酸抗性之間具 有相當(dāng)?shù)南嚓P(guān)關(guān)系。在所述突變型yeaS基因中的“特定突變”是指，具體來說從下述(I) (III)中 選擇的突變。(I)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第28位的蘇氨酸殘基被蘇氨酸以外的氨基酸所 取代的突變，(II)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第137位的苯丙氨酸殘基被苯丙氨酸以外的氨 基酸所取代的突變，(III)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第188位的亮氨酸殘基被亮氨酸以外的氨基 酸所取代的突變。所述(I) (III)的突變，具體來說，可以分別舉出下述⑴ (iii)的突變。(i)第28位的蘇氨酸殘基被天冬酰酰胺所取代的突變，(ii)第137位的苯丙氨酸殘基被絲氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸以 及甘氨酸中任一個(gè)所取代的突變，(iii)第188位的亮氨酸殘基被谷氨酰胺所取代的突變。突變可以為上述任1種突變，也可以為任意的2種、或3種突變的組合。特別優(yōu)選的所述突變?yōu)?，所?ii)的突變中的第137位的苯丙氨酸殘基被絲氨酸 或谷氨酰胺所取代的突變。所述(I) (III)的突變中的第28位、第137位或第188位是指，不一定總是表 示從yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)(YeaSN)的N末端起算的絕對(duì)位置，有時(shí)還表示相對(duì)于SEQ ID NO :2中記載的氨基酸序列的相對(duì)位置。例如，在含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的 YeaS蛋白質(zhì)中，當(dāng)?shù)?8位的N末端側(cè)的位置發(fā)生一個(gè)氨基酸殘基缺失時(shí)，所述第28位就變 成了 27位。在這樣情況下，第27位的氨基酸殘基在本發(fā)明中仍然是“第28位”的氨基酸 殘基。氨基酸取代的絕對(duì)位置，可以通過將對(duì)象的YeaS蛋白質(zhì)的氨基酸序列和SEQ ID NO 2的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)來決定。向yeaS基因中導(dǎo)入(I) (III)的各種突變可以通過下述方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過 定點(diǎn)突變法或重疊延伸法(overlap extension)等，向野生型YeaS基因的對(duì)應(yīng)突變的密碼 子導(dǎo)入指定突變來實(shí)現(xiàn)。突變后的密碼子只要是編碼指定的氨基酸的密碼子即可，沒有特 殊的限制，但優(yōu)選使用在目的腸桿菌中使用頻率較高的密碼子。向細(xì)菌的染色體上的yeaS基因中導(dǎo)入選自所述(I) (III)中的突變，可以通過使含有突變點(diǎn)的突變型yeaS基因或其片段與染色體上的相當(dāng)于yeaS基因的部分進(jìn)行取代 來進(jìn)行。此外，也可以將突變型yeaS基因或含有該基因的載體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中。在這種情況 下，突變型yeaS基因可以攜帶在染色體上，也可以攜帶在質(zhì)粒上。此外，染色體上的野生型 yeaS基因可以是保持不變的，也可以為缺損的。此外，細(xì)菌攜帶的突變型yeaS基因，可以為1個(gè)拷貝，也可以為2個(gè)拷貝或以上。 并且，用于使突變型yeaS基因表達(dá)的啟動(dòng)子可以為野生型yeaS基因的啟動(dòng)子，也可以為其 他啟動(dòng)子，例如Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子等。作為用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，可以列舉出能夠在使用的微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒。例如， 作為在屬于腸桿菌科的微生物中可以自主復(fù)制的質(zhì)粒，可以列舉出PUC19、pUC18、pBR322、 RSFlO 10、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pTWV228、pTWV229 (pHSG、 pSTV、pTWV 可從 TAKARABio 公司獲得)，pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW 可從 NIIPONGENE公司獲得)等。此外，作為棒狀桿菌型細(xì)菌用的質(zhì)粒，可以列舉出pAM330 (特開 昭 58-67699 號(hào)公報(bào))、pHM1519 (特開昭 58-77895 號(hào)公報(bào))、pSFK6 (參 考特開 2000-262288 號(hào)公報(bào))、pVK7(美國(guó)專利申請(qǐng)公開說明書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特 開昭58-192900號(hào)公報(bào))、pCGl (特開昭57-134500號(hào)公報(bào))、pCG2 (特開昭58-35197號(hào)公 報(bào))、pCG4、pCGll (特開昭57-183799號(hào)公報(bào))、pHK4 (特開平5-7491號(hào)公報(bào))等。作為轉(zhuǎn)化方法，可以舉出例如基于大腸桿菌K-12而報(bào)道的，用氯化鈣處理受 體菌細(xì)胞來增加DNA的透過性的方法(Mandel, M.和Higa, A.，J. Mol. Biol. 1970，53， 159-162)，或者基于枯草芽孢桿菌而報(bào)道的，由處于增殖階段的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞并導(dǎo) 入 DNA 的方法(如 Duncan，C. H. ,Wilson,G. Α.和 Young，F(xiàn).E·· , 1997. Gene 1 :153_167)?；?者，也可以利用基于枯草桿菌、放線菌類和酵母而已知的，將DNA受體菌的細(xì)胞制備成容易 導(dǎo)入重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球的狀態(tài)，再將重組DNA導(dǎo)入DNA受體菌的方法(Chang， S.和 Choen，S.N. , 1979. Mol. Gen. Genet. 168 111-115 ；Bibb,Μ. J. ,Ward, J. M.和 Hopwood， 0. A. 1978. Nature 274 :398_400 ；Hinnen, Α. ，Hicks, J. B.禾口 Fink，G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 :1929-1933)。此外，采用電脈沖法(特開平2-207791號(hào)公報(bào))也能夠進(jìn) 行微生物的轉(zhuǎn)化。此外，向細(xì)菌中導(dǎo)入突變型yeaS基因，可以像下面就突變型yeaS基因所描述 的那樣，通過向宿主微生物的染色體上導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)。為了向微生物的染色體上導(dǎo)入突 變型yeaS基因，可以通過使用轉(zhuǎn)座子或Mini-Mu向染色體上隨機(jī)導(dǎo)入的方法(特開平 2-109985號(hào)公報(bào)、US5, 882，888EP805867B1)，或者利用在染色體DNA上多拷貝存在的序列 作為靶標(biāo)，通過同源重組來進(jìn)行。作為在染色體DNA上多拷貝存在的序列，可以利用重復(fù) DNA(repetitiveDNA)、存在于轉(zhuǎn)座元件端部的反向重復(fù)序列?；蛘?，可以通過采用Red驅(qū)動(dòng) 整合法(W02005/010175)將目的基因?qū)氲饺旧w上。此外，還可以使用Pl噬菌體等噬菌 體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者利用接合轉(zhuǎn)移載體將目的基因?qū)氲饺旧w上。此外，如在W003/040373 中所記載的一樣，還可以以生產(chǎn)目的物質(zhì)時(shí)不必須的基因作為靶標(biāo)導(dǎo)入突變型yeaS基因。 在這樣的方法中可以向靶標(biāo)序列上1個(gè)拷貝或多個(gè)拷貝地導(dǎo)入突變型yeaS基因。染色體上轉(zhuǎn)移了目的基因的確認(rèn)，可以通過使用具有與目的基因或其中的一部分 相互補(bǔ)的序列的探針進(jìn)行Southern雜交，或使用基于目的基因的序列制備的引物通過PCR 等進(jìn)行確認(rèn)。
<2>本發(fā)明的L-氨基酸的生產(chǎn)方法在培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過上述方法得到的本發(fā)明的細(xì)菌，并通過從該培養(yǎng)基中采集 L-氨基酸，可以生產(chǎn)L-氨基酸。L-氨基酸也可以為L(zhǎng)-氨基酸的衍生物。當(dāng)L-氨基酸為 L-半胱氨酸時(shí)，作為L(zhǎng)-半胱氨酸的衍生物，可以列舉出上述的S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍 生物、相當(dāng)于該噻唑烷衍生物的硫代半酮縮醇等。作為使用的培養(yǎng)基，可以列舉出含有碳源、氮源、硫源、無機(jī)離子以及需要的其他 有機(jī)成分的通常的培養(yǎng)基。作為碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、糖蜜、淀粉水解物等糖類、富馬酸、 檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸類。作為氮源，可以使用硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等無機(jī)銨鹽、大豆水解物等有機(jī)氮、氨 氣、氨水等。作為硫源，可以列舉出硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫化物、連二亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等無 機(jī)硫化物。
作為有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)源，優(yōu)選適量含有維生素Bl等必需物質(zhì)或者酵母提取物等。除 此之外，根據(jù)需要可以少量添加磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。培養(yǎng)在需氧的條件下進(jìn)行30 90小時(shí)較好，培養(yǎng)溫度為25V 37°C，且優(yōu)選將 培養(yǎng)中的PH控制在5 8的范圍內(nèi)。此外，可以使用無機(jī)或者有機(jī)的酸性或者堿性物質(zhì)， 以及氨氣等來調(diào)節(jié)PH值。就培養(yǎng)結(jié)束后從培養(yǎng)基溶液中采集L-氨基酸而言，在本發(fā)明中不需要特別的方 法。本發(fā)明中采集出的L-氨基酸除了含有作為目標(biāo)的L-氨基酸之外，還可以含有微生 物菌體、培養(yǎng)基成分、水分以及微生物的代謝副產(chǎn)物等。采集的L-氨基酸的純度為50% 以上，優(yōu)選為 85% 以上，特別優(yōu)選為 95% 以上(US5，431，933，JP1214636B, US4，956，471， US4, 777，051，US4946654, US5, 840358，US6, 238，714，US2005/0025878)。可以通過組合已經(jīng)公知的離子交換樹脂法(Nagai，H. et al. =SeparationScience and Technology，39 (16) ,3691-3710)、膜分離法(特開平 9-164323 號(hào)、特開平 9-173792 號(hào))、晶析法(W02008/078448、W02008/078646)、以及其他的方法采集L-氨基酸。通過上述方法得到的L-半胱氨酸，可以用來生產(chǎn)L-半胱氨酸的衍生物。作為L(zhǎng)-半 胱氨酸的衍生物包含甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸(carbocysteindjt 代半胱氨酸、乙酰半胱氨酸等。此外，當(dāng)L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培養(yǎng)基中積累時(shí)，通過使噻唑烷衍生物和 L-半胱氨酸之間的反應(yīng)平衡向L-半胱氨酸一側(cè)移動(dòng)，可以生產(chǎn)得到L-半胱氨酸。此外，當(dāng) S-硫代半胱氨酸在培養(yǎng)基中積累時(shí)，例如可以使用二硫蘇糖醇等還原劑通過進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化 得到L-半胱氨酸。
實(shí)施例以下，針對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行更具體的說明。(實(shí)施例1)通過強(qiáng)化野生型YeaS使得L-半胱氨酸生產(chǎn)增加的效果為了研究由于增強(qiáng)了在P. ananat i s中野生型yeaS基因的表達(dá)而對(duì)于L-半 胱氨酸生產(chǎn)產(chǎn)生的影響，構(gòu)建了導(dǎo)入了編碼突變型SAT的基因cysE5(美國(guó)專利申請(qǐng)第20050112731號(hào))、且提高了 yeaS基因的拷貝數(shù)的菌株。
首先，構(gòu)建了用于構(gòu)建上述菌株的質(zhì)粒。其方法如下所示。以大腸桿菌MG1655 (ATCC No. 47076)的染色體 DNA 為模板，使用 Pl (agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac :SEQ ID NO 20) I^l 及 P2 (agctgagcatgcttccaact gcgctaatga cgc =SEQ ID NO :21)作為引物，通過PCR獲得了含有nlpD基因的啟動(dòng)子區(qū)域 (以下，將野生型nlpD基因啟動(dòng)子記為“PnlpO”)約300bp的DNA片段。在上述引物的5， 末端和3’末端分別設(shè)計(jì)了限制性內(nèi)切酶SalI以及PaeI的位點(diǎn)。PCR循環(huán)如下所述95°C 3 分鐘后，95 °C 60 秒、50 "C 30 秒、72 °C 40 秒循環(huán) 2 次，94 V 20 秒、55 °C 20 秒、72 °C 15 秒循環(huán) 25 次，最后在72°C下5分鐘。用SalI以及PaeI處理得到的片段，并將其插入到pMIV_5JS (特 開2008-99668)的SalI-PaeI位點(diǎn)中，得到pMIV-PnlpO質(zhì)粒。在該質(zhì)粒pMIV-PnlpO中插 入的PnlpO啟動(dòng)子的PaeI-SalI片段的堿基序列如SEQ ID NO 5所示。隨后，以MG1655的染色體DNA為模板，使用P3 (agctgatcta gaaaacagaatttgcctggc ggc :SEQ ID NO 22)禾口 P4 (agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc =SEQ ID NO :23)作為引物，通過PCR獲得了含有rrnB基因的終止子區(qū)域約300bp的DNA 片段。在上述引物的5’末端分別設(shè)計(jì)了限制性內(nèi)切酶XbaI以及BamHI的位點(diǎn)。PCR循環(huán) 如下所述95°C 3分鐘后，95°C 60秒、50°C 30秒、72°C 40秒循環(huán)2次，94°C 20秒、59°C 20 秒、72°C 15秒循環(huán)25次，最后在72°C下5分鐘。用XbaI以及BamHI處理得到的片段，并將 其插入到pMIV-PnlpO的XbaI-BamHI位點(diǎn)處從而得到pMIV-PnlpO_ter質(zhì)粒。接下來，以MG1655的染色體DNA為模板，使用P5 (agctgagtcg acgtgttcgctgaatacggg gt :SEQ ID NO 24) IMM P6 (agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc =SEQ ID NO :25)作為引物，通過PCR獲得了含有yeaS基因的約700bp的DNA片段。在 上述引物的5’末端分別設(shè)計(jì)了限制性內(nèi)切酶SalI以及XbaI的位點(diǎn)。PCR循環(huán)如下所述 950C 3 分鐘后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循環(huán) 2 次，94°C 20 秒、55°C 20 秒、72°C 15 秒循環(huán)25次，最后在72°C下5分鐘。用SalI以及XbaI處理得到的片段，并將其插入到 pMIV-PnlpO-ter 的 SalI-XbaI 位點(diǎn)處從而得到 pMIV-PnlpO_YeaS3 質(zhì)粒。由此，在 pMIV_5JS 載體上，構(gòu)建了按照nlpD啟動(dòng)子、yeaS基因以及rrnB終止子的順序連接的yeaS的表達(dá)單兀。為了通過修飾nlpD啟動(dòng)子的-10區(qū)域來得到更強(qiáng)的啟動(dòng)子，采用下述方法進(jìn)行 了 -10區(qū)域的隨機(jī)化。在nlpD啟動(dòng)子區(qū)域(圖1)中存在兩個(gè)推測(cè)為起啟動(dòng)子功能的區(qū)域， 在圖中分別由pnlpl和pnlp2表示。以質(zhì)粒pMIV-PnlpO為模板，使用Pl以及P7 (atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatnangtcactgg( "n_，，表不可以為 a, t, g, c 中的任意一種)，SEQ ID NO 26)作為引物，通過PCR獲得了將包含于nlpD啟動(dòng)子的3’末 端側(cè)的-10區(qū)域(記為-IO(Pnlpl))隨機(jī)化而得的DNA片段(圖1)。PCR循環(huán)如下所述 950C 3 分鐘后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循環(huán) 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、72°C 15 秒循環(huán)25次，最后在72°C下5分鐘。另一方面，同樣地以質(zhì)粒pMIV-PnlpO為模板，使用P2以及 P8 (tggaaaagatcttcannnnn cgctgacctg cg(a, t, g, c Φ ^Ι Μ一ft ) SEQ IDNO 27)作為引物，通過PCR獲得了將包含于nlpD啟動(dòng)子的5，末端側(cè)的-10區(qū)域 (記為-10(Pnlp2))隨機(jī)化而得的DNA片段(圖1)。PCR循環(huán)如下所述95°C 3分鐘后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循環(huán) 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、72°C 15 秒循環(huán) 25 次，
最后在72 °C下5分鐘。可以通過在引物P7和P8上設(shè)計(jì)的BglII位點(diǎn)將得到的3’末端側(cè)和5’末端側(cè)的片段連接，并可以構(gòu)建2個(gè)-10領(lǐng)域被隨機(jī)化的完整nlpD啟動(dòng)子。以該片段為模板，使用 Pl以及P2作為引物，通過PCR獲得了修飾型完整nlpD啟動(dòng)子的DNA片段。PCR循環(huán)如下 所述95°C 3 分鐘后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循環(huán) 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、 720C 15秒循環(huán)12次，最后在72°C下5分鐘。用在引物的5’末端上設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶SalI以及PaeI處理擴(kuò)增的片段，并通 過將其插入到同樣地用SalI以及PaeI處理的質(zhì)粒pMIV-PnlpO-YeaS3中，將質(zhì)粒上的野生 型nlpD啟動(dòng)子部位(PnlpO)替換成突變型Pnlp。從其中選擇了具有如圖1所示的啟動(dòng)子 序列(Pnlp8)的質(zhì)粒，并將其命名為pMIV-Pnlp8-YeaS7。插入在該質(zhì)粒中的Pnlp8啟動(dòng)子 的PaeI-SalI片段的堿基序列如SEQ ID N0:6所示。同樣地，將含有突變的nlpD啟動(dòng)子 區(qū)域的DNA片段插入到用SalI以及PaeI處理了的質(zhì)粒pMIV-PnlpO-ter上，從而將該質(zhì) 粒上的nlpD啟動(dòng)子部位(PnlpO的部分)替換為突變型Pnlp。將其中的一個(gè)質(zhì)粒命名為 pMIV-Pnlp23-ter。該質(zhì)粒中插入的Pnlp23啟動(dòng)子的PaeI-SalI片段的堿基序列如SEQ ID NO :7所示。隨后，從 pMW-Pomp-cysE5(W02005007841)中，用 Pael、SacI 將 Pomp_cysE5 盒 (cassette)的部分切出，插入到pMIV_5JS的相同位點(diǎn)處，從而構(gòu)建了 pMIV-Pomp-CysE5。 pMW-Pomp-cysE5為將編碼連接于ompC基因啟動(dòng)子的突變型SAT的基因cysE5插入到 PMW118中而得到的質(zhì)粒。從pACYC184 (GenBank/EMBL登錄號(hào)X06403、可從NIIP0NGENE公司 獲得)上，用XbaI、Eco88I將四環(huán)素抗性基因切出，將該基因片段通過克列諾片段(Klenow fragment)處理后,插入至Ij pMIV-Pomp-CysE5 的 PvuI 位點(diǎn)處,從而構(gòu)建了 pMT_Pomp-CysE5。 接下來，用HindIII酶切pMIV-Pnlp8-YeaS7，并通過克列諾片段進(jìn)行平滑末端化后，用NcoI 進(jìn)行酶切，將含有PnlpS-YeaS-rrnB終止子的盒和氯霉素抗性標(biāo)記的片段切出。將該片 段和，同樣以PMIV-5JS為骨架(backbone)的pMT_Pomp-CysE5的Smal、NcoI酶切片段相 連接，從而構(gòu)建了 pMT-EY2。pMT-EY2為在一個(gè)質(zhì)粒上具有Pnlp8-YeaS_rrnB終止子盒和 Pomp-CysE5盒的質(zhì)粒。為了研究增強(qiáng)野生型yeaS基因的表達(dá)對(duì)L-半胱氨酸生產(chǎn)所產(chǎn)生的效果，將按 照上述方法構(gòu)建的pMT-Pomp-CysE5和pMT_EY2導(dǎo)入P. ananatisSC17菌株(美國(guó)專利 6596517)，并對(duì)得到的轉(zhuǎn)化菌株的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在培養(yǎng)中使用了 L-半胱氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基(組成15g/L硫酸銨，1.5g/L磷酸二氫 鉀，lg/L硫酸鎂七水合物，0. lg/L胰蛋白質(zhì)胨，0. 05g/L酵母提取物，0. lg/L氯化鈉，20g/L 碳酸鈣，40g/L葡萄糖，20mg/L四環(huán)素)。L-半胱氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)按照下述規(guī)程進(jìn)行。將SC17/pMT-PompCySE5菌株和SC17/ PMT-EY2菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基上涂開，在34°C下進(jìn)行過夜預(yù)培養(yǎng)，之后用接種環(huán)挑取平板 的八分之一的菌體，并接種到已經(jīng)放入大試管(內(nèi)徑23mm、長(zhǎng)度20cm)的2mL的L-半胱氨 酸培養(yǎng)基中，在220-230rpm下在32°C下進(jìn)行振動(dòng)培養(yǎng)，2天后結(jié)束培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)基中產(chǎn)生 的 L-半胱氨酸的定量，通過 Gaitonde，Μ. K. (Biochem J. 1967Aug ； 104 (2) :627_33·)記載 的方法進(jìn)行。如表1所示，可以得知增強(qiáng)yeaS基因的表達(dá)，具有使L-半胱氨酸的生產(chǎn)量增加的效果。此外，在此定量的L-半胱氨酸除了 L-半胱氨酸之外，還包括L-胱氨酸或它們 的衍生物，例如S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍生物或者硫代半酮縮醇、或者它們的混合物，以 下如果沒有特別的記載，則通過本方法定量的L-半胱氨酸均具有相同含義。[表 1]表1在SC17菌株中強(qiáng)化yeaS的效果 (實(shí)施例2)獲得突變型yeaS基因和L-半胱氨酸生產(chǎn)增加效果下面，為了獲得與野生型YeaS相比使宿主細(xì)胞的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力提高的活 性較高的突變體，通過易錯(cuò)(error-prone)PCR人為地向yeaS基因內(nèi)導(dǎo)入隨機(jī)突變。(DyeaS的易錯(cuò)PCR和突變導(dǎo)入文庫的制作首先，對(duì)于向yeaS基因中導(dǎo)入1 3個(gè)突變的易錯(cuò)PCR的條件，在現(xiàn)有知識(shí)(Evert Bokma et al. ， (2006)FEBS Letters 580 :5339_5343、Zao et al. ， (1998)Nat Biotechnol Mar ； 16 (3) :258_61)的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究。DNA聚合酶使用taqpolymerase (QIAGEN公司 制造)，反應(yīng)液組成為 IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 3)、50mMKCl、7mM MgCl2、0. 2mM dGTP，dATP、 ImM dCTP，dTTP以及12. 5μΜ MnCl20引物使用了分別添加了 NcoI位點(diǎn)和PstI位點(diǎn)的 Ρ9 (catgccatgg tcgctgaatacggggttctg, SEQ ID NO 禾口 PlO (aactgcagtc aggattgcag cgtcgcc, SEQ ID NO :29)，通過 94°C 5 分鐘后，94°C 30 秒、50°C 45 秒、72°C 45 秒循環(huán) 50 次， 最后在72°C下7分鐘的PCR循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。將反應(yīng)液分裝于16個(gè)獨(dú)立的PCR管中進(jìn)行反 應(yīng)，從而使得突變沒有偏向。用NcoI和PstI酶切擴(kuò)增得到的片段，將其與通過同樣的酶處理的pTrC99_Kmr相 連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109菌株中。此外，pTrC99-Kmr為按照下述方法制備的質(zhì)粒，該 質(zhì)粒為用DraI限制性內(nèi)切酶處理pTrc99A (GenBank/EMBL登錄號(hào)M22744，可以從Amershanm Bioscience公司獲得)，將氨芐青霉素抗性基因除去，并在該位置上插入卡那霉素抗性基 因的質(zhì)粒。以pACYC177 ((GenBank/EMBL登錄號(hào)X06402、可從NIIP0NGENE公司獲得))為模 板，使用 Pll (aaagccacgt tgtgtctcaa aatc, SEQ IDNO :30)禾口P12 (ggtgttgctg actcatacca ggc，SEQ ID NO 31)作為引物，通過94°C 1分鐘后，94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 75秒循環(huán) 30次、最后在72°C下5分鐘的PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增從而獲得卡那霉素抗性基因。將上述轉(zhuǎn)化體在含有25mg/L的卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選，以從得到的 菌落中隨機(jī)挑選的菌株為模板，使用P13(gacaattaat catccggctc g，SEQ ID NO 32)禾口 P14(tttatcagac cgcttctgcg, SEQ ID NO :33)作為引物，進(jìn)行 94°C 5 分鐘后，98°C 5 秒、 60°C 10秒、72°C 45秒循環(huán)30次，最后在72°C下2分鐘的PCR程序，對(duì)轉(zhuǎn)化菌株中攜帶導(dǎo)入 突變的yeaS進(jìn)行了確認(rèn)。將平板上的全部菌落取下來，通過WizardR Plus MidiprepsDNA ^itM^ (WizardR Plus Midipreps DNA purification System) (Promega ^w] ) [ηΙ^Μ 粒，得到文庫。(2)以L-半胱氨酸抗性為指標(biāo)篩選突變型yeaS
利用電穿孔法將得到的文庫導(dǎo)入MG1655中，并涂布在分別含有3mM、6mM的L-半 胱氨酸的M9選擇平板(12. 8g/L磷酸氫二鈉七水合物、3. Og/L磷酸二氫鉀、0. 5g/L氯化鈉、 1. Og/L氯化銨、2mM硫酸鎂、0. 4%葡萄糖、0. ImM氯化鉀、25mg/L卡那霉素、1. 5%瓊脂糖) 上。將該選擇平板放置在37°C下經(jīng)過2晚培養(yǎng)后，在含有6mM的L-半胱氨酸的M9選擇平 板上得到不足100個(gè)抗性菌株，在含有3mM的L-半胱氨酸的M9選擇平板上得到200 300 個(gè)抗性菌株。從含有6mM的L-半胱氨酸的平板上獲得的菌落中分離出單菌落80株、以及 從含有3mL的L-半胱氨酸的平板上得到的菌落中分離出12株單菌落，并將這些菌落作為 模板，使用P13和P14作為引物，通過94°C 5分鐘后，98°C 5秒、60°C 10秒、72°C 45秒循環(huán) 30次，最后在72°C下2分鐘的PCR程序?qū)|(zhì)粒上的含有yeaS基因區(qū)域的DNA片段進(jìn)行擴(kuò) 增。用作為測(cè)序引物的P13對(duì)這些片段的堿基序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)yeaS基因內(nèi)的突變導(dǎo)入 部位。將堿基序列可讀的克隆中重復(fù)的克隆分組之后，從有代表性的克隆中提取出質(zhì)粒，并 將其導(dǎo)入到下述L-半胱氨酸生產(chǎn)菌中，進(jìn)行培養(yǎng)評(píng)價(jià)。得到的克隆中，有相當(dāng)一部分包含 了 T28N突變，獲得了許多如表2所示那樣的導(dǎo)入了 T28N的同時(shí)還導(dǎo)入了其他突變的2重、 3重突變菌株。此外，也獲得了多株包含F(xiàn)137S突變的克隆。另外也獲得了單獨(dú)具有L188Q 突變的克隆。(3)為了確認(rèn)突變型yeaS的效果而構(gòu)建L-半胱氨酸生產(chǎn) 菌_1 (向P. ananatis SC17菌株中導(dǎo)入了 cysE5、突變型yeaS)上述的pMT-EY2具備來源于pMIV_5JS (特開2008-99668)的Mu噬菌體附著位 點(diǎn)(attachment site)。由于該質(zhì)粒和具有Mu轉(zhuǎn)座酶(Mu transposase)的輔助質(zhì)粒 pMHIO (Zimenkov D. et al.，Biotechnologiya(俄語)，6，1-22 (2004))可以在同一細(xì)胞內(nèi) 共存，因此可以將該質(zhì)粒PMT-EY2上以被Mu噬菌體的附著位點(diǎn)夾持的形式存在的含有氯霉 素抗性標(biāo)記的PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB終止子盒，插入到P. ananatis SC17 (美國(guó)專 利6596517)菌株的染色體上。而且，由于在質(zhì)粒PMT-EY2上存在的氯霉素抗性標(biāo)記具有夾 在2個(gè)λ噬菌體的輔助位點(diǎn)(XattR和XattL)之間的結(jié)構(gòu)，因此通過后述的方法可以將 氯霉素抗性標(biāo)記除去。首先，將通過電穿孔向SC17菌株中導(dǎo)入了 pMHIO而得到的菌株，在含有20mg/L卡 那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在30°C下過夜培養(yǎng)來進(jìn)行了選擇。將得到的轉(zhuǎn)化菌株在30°C下 培養(yǎng)，并進(jìn)一步通過電穿孔向該菌株中導(dǎo)入PMT-E2。將用pMHIO和pMT_EY2這兩者轉(zhuǎn)化的 菌株，在42°C，20分鐘的條件下進(jìn)行熱擊，之后在含有20mg/L氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩 選氯霉素抗性菌株的菌落。此時(shí)培養(yǎng)溫度為39°C。通過上述方法，獲得約50個(gè)克隆，通過 分別在LB瓊脂培養(yǎng)基上在39°C下培養(yǎng)48小時(shí)，進(jìn)行pMHIO以及pMT_EY2的消除(curing)。 通過在染色體上插入了盒來顯示出氯霉素抗性，且消除了兩個(gè)質(zhì)粒后的結(jié)果獲得了對(duì)卡那 霉素以及氨芐青霉素顯示敏感性的菌株。隨后，以該菌株的染色體DNA為模板，使用Pl和 P6作為引物通過PCR，確認(rèn)了得到的菌株的染色體上目的盒的插入。得到的全部克隆分別 命名為EYOl EY50，并進(jìn)行EYOl EY50的L-半胱氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)使用上述實(shí)施例 1所示的方法。結(jié)果，篩選出L-半胱氨酸生產(chǎn)量最多的克隆EY19菌株。通過來源于λ噬菌體的切出系統(tǒng)除去ΕΥ19菌株中導(dǎo)入的氯霉素抗性標(biāo)記。具體 來說，將攜帶了 λ噬菌體的Int-Xis基因的pMT-Int-Xis2(W02005/010175)轉(zhuǎn)化到EY19 菌株中，從得到的轉(zhuǎn)化菌株中獲得了顯示氯霉素敏感性的EY19(s)菌株。
(4)為了確認(rèn)突變型yeaS的效果而構(gòu)建L-半胱氨酸生產(chǎn)菌_2(由EY19(s)菌株制作cysPTWA基因表達(dá)強(qiáng)化菌株)接下來，為了強(qiáng)化cysPTWA基因的表達(dá)，將染色體上的在cysPTWA基因簇上游存在 的啟動(dòng)子，替換為上述的強(qiáng)啟動(dòng)子Pnlp8。首先以pMIV-Pnlp8-YeaS7為模板，使用Pl以及 P2通過PCR獲得含有nlp8啟動(dòng)子的約300bp的DNA片段。PCR循環(huán)如下所述95°C 3分鐘 后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循環(huán) 2 次，94°C 20 秒、59°C 20 秒、72°C 15 秒循環(huán) 20 次，最后在72°C下5分鐘。將擴(kuò)增得到的含有nlp8啟動(dòng)子的DNA片段利用克列諾片段處理后插入到用XbaI 酶切后通過克列諾片段處理的質(zhì)粒pMW118-U att L-KmR-λ attR) (W02006/093322A2) 上，從而得到了質(zhì)粒pMW-Km-Pnlp8。將pMW-Km-Pnlp8作為模板使用，并使用引物 P15(tccgctcacg atttttttca tcgctggtaaggtcatttat cccccaggaa aaattggtta, SEQ ID NO 34)以 及 P16 (tttcacaccg ctcaaccgcagggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg，SEQ ID NO 35)進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增得到含有 Km_Pnlp8 盒的約 1. 6kb 的 DNA 片 段。此時(shí)的PCR循環(huán)如下所述95°C 3分鐘后，95°C 60秒、50°C 30秒、72°C 40秒循環(huán)2次， 940C 20秒、54°C 20秒、72°C 90秒循環(huán)30次，最后在72°C下5分鐘。在兩個(gè)引物上設(shè)計(jì)有 為 了通過 λ 依賴整合(被稱為“Red-driven integration”的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97，No. 12，p6640_6645))而插入目的片段的染色體上的靶標(biāo)的序列(這種 情況下為cysPTWA啟動(dòng)子附近的序列)。因此，在將得到的DNA片段通過該λ依賴整合插 入到目的菌株中時(shí)，在染色體上的cysPTWA基因的鄰近前方插入了 Km-PnlpS，從而形成了 在nlp8啟動(dòng)子上連接了 cysPTWA基因的結(jié)構(gòu)。在SEQ ID NO 12中顯示了 cysPTWA基因簇 的堿基序列，在SEQ ID NO 13 15中顯示了 cysP、cysT、cysW各基因編碼的氨基酸序列。 SEQ ID N0:16、17分別顯示了 cysA基因的堿基序列，以及該基因編碼的氨基酸序列。P. ananatis SC17 (0)/RSF-Red-TER菌株是用于使λ依賴整合效果更好地進(jìn)行 的宿主菌株，該菌株中導(dǎo)入了在對(duì)λ Red基因產(chǎn)物具有抗性的P. ananatis菌株SC17 (0) 菌株中表達(dá)λ的gam、bet以及exo各基因(以下稱為“ λ Red基因”)的輔助質(zhì)粒 RSF-Red-TER(W02008/075483)。SC17(0)株于2005年9月21保藏于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生
(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms (VKPM) ,GNII Genetika)(地址Russia，1175451 Moscow, IDorozhny proezd. 1)，保藏號(hào) VKPM B-9246。 此外，該質(zhì)粒RSF-Red-TER的構(gòu)建方法在W02008/075483中有詳細(xì)地記載。在添加用于誘導(dǎo)λ Red基因的表達(dá)的IPTG的條件下培養(yǎng)上述SC17 (0) / RSF-Red-TER菌株，制備了電穿孔用的細(xì)胞。通過電穿孔向這些細(xì)胞中導(dǎo)入了上述的目 的DNA片段，以卡那霉素抗性為指標(biāo)，通過λ依賴整合，獲得了在cysPTWA基因上游插入 了 nlp8啟動(dòng)子的重組菌株。以獲得的菌株的染色體DNA為模板，使用P17 (ctttgtccct ttagtgaagg, SEQ ID NO 36)禾口 P18 (agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac,SEQ ID NO 37)作為引物，通過PCR反應(yīng)，確認(rèn)形成了目標(biāo)的Km-Pnlp8-cysPTWA結(jié)構(gòu)， 并將該菌株命名為SC17(0)-Pnlp8-PTWA菌株。接下來，純化SC17 (0) -Pnlp8-PTWA菌株的染色體DNA，將10 μ g該染色體DNA通過 電穿孔法導(dǎo)入到EY19(s)菌株中，獲得卡那霉素抗性菌株。以得到的菌株的染色體DNA為 模板，使用P17、P18作為引物利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，從而確認(rèn)了在EY19(s)菌株的染色體上導(dǎo)入了 Km-Pnlp8-CySPTWA結(jié)構(gòu)。將通過上述方法獲得的菌株命名為EYP197菌株。進(jìn)一步， 使用上述的PMT-Int-Xis2，將卡那霉素抗性標(biāo)記從染色體上除去，將變?yōu)榭敲顾孛舾行?的菌株命名為EYP197(s)菌株。(5)為了確認(rèn)突變型yeaS的效果而構(gòu)建L-半胱氨酸生產(chǎn)菌_3(由EYP197(s)菌 株制作攜帶了突變型3-磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglyceratedehydrogenase) (serA348) 基因的菌株)作為向L-半胱氨酸生產(chǎn)菌導(dǎo)入的3-磷酸甘油酸脫氫酶，通過下述的方法構(gòu)建了 serA348基因，該基因是編碼來源于Pantoea ananatis的3_磷酸甘油酸脫氫酶的基因，其 編碼用丙氨酸取代了第348位的天冬酰胺殘基的突變型酶(N348A) (J. Biol. Chem. 1996 ； 271(38) 23235-8)。Pantoea ananatis來源的野生型serA基因的序列如SEQ ID NO :10所示。為 了得到導(dǎo)入了上述突變的serA基因的3’側(cè)的DNA片段，進(jìn)行下述操作，以SC17菌株染 DNA ^jHIS., jiffi P19 (agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactggaa, SEQ ID NO :38)禾口 P20 (gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc, SEQ IDNO 39)作為弓丨物進(jìn)行 PCR(95°C 3 分鐘后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循環(huán) 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、72°C 60 秒循環(huán) 25次，最后在72°C下5分鐘)。接下來，為了同樣地獲得導(dǎo)入了突變的5’側(cè)的DNA片段， 以 SC17 菌株染色體 DNA 為模板，使用 P21(agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg，SEQID NO 40)和 P22 (aaaaccgccc gggcgttctc ac, SEQ ID NO 41)作為引物進(jìn)行 PCR(95°C 3 分 鐘后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循環(huán) 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、72°C 20 秒循環(huán) 20 次，最后在72°C下5分鐘)。通過限制性內(nèi)切酶SmaI處理得到的兩個(gè)PCR片段之后，通過 DNA連接酶進(jìn)行連接，得到含有目的突變(N348A)的突變型serA基因全長(zhǎng)的DNA片段。以 該DNA片段為模板，使用P19和P21作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增((95°C 3分鐘后，95°C 60秒、 50 "C 30秒、72 °C 40秒循環(huán)2次，94"C 20秒、60 "C 20秒、72 °C 75秒循環(huán)15次，最后在72 °C下 5分鐘)。利用Sall.Xbal處理在P19和P21引物上設(shè)計(jì)的Sal I ,XbaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 之后，將其插入到同樣用SalI、XbaI處理的pMIV-Pnlp8_ter中，制得pMIV-Pnlp8_serA348。構(gòu)建的pMIV-Pnlp8-serA348 上攜帶了來源于 pMIV_5JS (特開 2008-99668)的 Mu 附著位點(diǎn)。如果使用該質(zhì)粒，則如上所述，通過使用具有Mu轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pMHIO，可以 將含有氯霉素抗性標(biāo)記的Pnlp8-serA348-rrnB終止子盒插入到P. ananatis SC17菌株的 染色體上。在SC17(0)菌株中導(dǎo)入了質(zhì)粒pMIV-Pnlp8-serA348以及pMHIO，獲得了在染色 體上插入了 Pnlp8-serA348-rrnB終止子盒的菌株。使用引物PI、P21通過PCR反應(yīng)，確認(rèn) 了目的盒存在于細(xì)胞中。針對(duì)得到的50個(gè)克隆，測(cè)定細(xì)胞提取液中的3-磷酸甘油酸脫氫 酶的活性，篩選活性最高的菌株，將其命名為SC17int-serA348菌株。接下來，將10 μ g的 SC17int-serA348染色體DNA通過電穿孔導(dǎo)入到EYP197 (s)菌株中，獲得了氯霉素抗性菌 株，使用引物P1、P21通過PCR反應(yīng)，確認(rèn)了在EYP197(s)菌株的染色體上與氯霉素抗性標(biāo) 記一起導(dǎo)入了 Pnlp8-serA348的結(jié)構(gòu)。將這樣得到的菌株命名為EYPS1976菌株。通過上述的使用pMT-Int-Xis2的標(biāo)記除去方法，將氯霉素抗性標(biāo)記除去，并將變 為氯霉素敏感性的菌株命名為EYPS1976(s)菌株。(6)為了確認(rèn)突變型yeaS的效果而構(gòu)建L-半胱氨酸生產(chǎn)菌_4(由EYPS1976(s) 菌株制作攜帶了 0-乙酰-L-絲氨酸-巰基水解酶-B(cysM)基因的菌株)
首先，為了在適當(dāng)強(qiáng)度的啟動(dòng)子上克隆cysM基因，制作了新啟動(dòng)子。首先，以 P. ananatis SC17菌株的基因組為模板，獲得了含有nlpD基因的啟動(dòng)子區(qū)域約180bp的DNA 片段 ° 使用弓 I物 P23 (agctgaaagc ttgcatgcacgcgtggcgat ctggcctgac tgc, SEQ ID NO: 42)禾口 P24 (￡igctg￡igtcg accccgtggtggcaaccttt aaaaaactg, SEQ ID NO :43)，弓 L 的5’末端分別設(shè)計(jì)了限制性內(nèi)切酶SalI以及PaeI位點(diǎn)。PCR循環(huán)如下所述95°C 5分鐘 后，94°C 20秒、59°C 20秒、72°C 20秒循環(huán)27次，最后在72°C下5分鐘。
在SEQ ID NO 14中顯示了大腸桿菌cysM基因的堿基序列，在SEQ IDNO 15中顯 示了該基因編碼的氨基酸序列。使用SalI以及PaeI處理得到的DNA片段，并將其插入到同樣用SalI以及PaeI 處理的 pMIV-PnlpO-ter 中，獲得了 pMIV-Pnlp4_ter。在該質(zhì)粒 pMIV-Pnlp4_ter 中插入 的啟動(dòng)子Pnlp4的PaeI-SalI片段的堿基序列如SEQ IDNO 8中所示。同樣地，以質(zhì)粒 pMIV-Pnlp4-ter 為模板，使用弓丨物 P23 以及 P25 (agctgagtcg acnnngtggt ggcaaccttt aaaaaactg ( “η-” 表示可以為 a, t, g, c 中的任意一種)，SEQ ID NO :44)，通過 PCR(95°C 5 分鐘后，94°C 20秒、59°C 20秒、72°C 20秒循環(huán)27次，最后在72°C下5分鐘)，制得了在 nlpD啟動(dòng)子5’末端側(cè)含有的_7 -9區(qū)域被隨機(jī)化的DNA片段，用SalI以及PaeI處理， 并將其插入到用同樣的酶處理后的pMIV-PnlpO-ter中，從而得到pMIV-Pnlpl-ter。在該 pMIV-Pnlpl質(zhì)粒中插入的Pnlpl啟動(dòng)子的PaeI-SalI片段的堿基序列如SEQ ID NO 9所 示。-7 -9區(qū)域表示從nlpD啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起5’側(cè)的第7個(gè)堿基到第9個(gè)堿基 的位置。在上述的載體中整合了由大腸桿菌MG1655菌株克隆的cysM基因。具體來說，以 大腸桿菌MG1655菌株的基因組為模板，使用引物P26(agctgagtcgacgtgagtac attagaacaa acaat, SEQ ID NO 45)禾口 P27 (agctgatcta gaagtctccgatgctattaa tcc, SEQ ID NO 46) 通過PCR(95°C 5分鐘后，98°C 5秒、50°C 10秒、72°C 60秒循環(huán)30次，最后在72°C下2分 鐘)進(jìn)行擴(kuò)增。利用Sail、XbaI限制性內(nèi)切酶處理這樣得到的DNA片段，并將其插入到用 相同的酶處理的pMIV-Pnlp4-ter以及pMIV-Pnlpl-ter中，從而制得pMIV-Pnlp4_CysM禾口 pMIV-PnlpI-CysM0使用上述構(gòu)建的pMIV-Pnlp4_CysM和pMIV-Pnlpl-CysM，通過使用上述的pMHIO 的方法，分別獲得了在SC17菌株的染色體上插入了含有cysM基因的盒的菌株。將通過上 述方法制得的菌株命名為SC17int-4M和SC17int-lM，并從各菌株中提取染色體DNA。將 10μg該染色體DNA通過電穿孔導(dǎo)入到EYP1976(S)菌株中，獲得了氯霉素抗性株。將上述 制得的菌株分別命名為EYPSint-4M、EYPSint-lM，通過上述的使用pMT-Int_Xis2的標(biāo)記除 去方法，進(jìn)行氯霉素抗性標(biāo)記的去除，將變?yōu)槁让顾孛舾行缘木昝麨镋YPSint-4M(s)、 EYPSint-IM(s)菌株。(7)突變型yeaS對(duì)L-半胱氨酸生產(chǎn)帶來的影響向如上所述制得的L-半胱氨酸生產(chǎn)菌EYPSintlM(s)中，從上述實(shí)施例2、(2)中 得到的突變型yeaS基因中選擇幾種，導(dǎo)入到到此為止構(gòu)建的L-半胱氨酸生產(chǎn)菌中，進(jìn)行 L-半胱氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)。將評(píng)價(jià)對(duì)象菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基上涂開，在34°C下進(jìn)行過夜預(yù)培 養(yǎng)，用IOyL大小的接種環(huán)(NUNC公司制造)從平板上挑取約7平方厘米范圍的菌體，并按 照培養(yǎng)開始時(shí)刻的菌體量基本相同的方式接種到已經(jīng)放入大試管(內(nèi)徑23mm、長(zhǎng)度20cm)的2mL的L-半胱氨酸培養(yǎng)基(組成15g/L硫酸銨，1. 5g/L磷酸二氫鉀，lg/L硫酸鎂七水 合物，0. lmg/L硫胺鹽酸鹽，1. 7mg/L硫酸亞鐵七水合物，0. 15mg/L鉬酸鈉二水合物，0. 7mg/ L氯化鈷六水合物，1. 6mg/L氯化錳四水合物，0. 3mg/L硫酸鋅七水合物，0. 25mg/L硫酸銅水 合物，0. 6g/L胰蛋白胨，0. 3g/L酵母提取物，0. 6g/L氯化鈉，20g/L碳酸鈣，135mg/L L-組 氨酸鹽酸鹽一水合物，4g/L硫代硫酸鈉，2mg/L吡哆醇鹽酸鹽，20g/L葡萄糖，20mg/L卡那霉 素，ImM IPTG)中。在32°C下進(jìn)行振動(dòng)培養(yǎng)，葡萄糖消耗用盡的時(shí)刻終止培養(yǎng)(約15 19小時(shí))，定 量在培養(yǎng)基中生產(chǎn)的L-半胱氨酸。表2中的測(cè)試No. 1、2為進(jìn)行了 3 5次的平行實(shí)驗(yàn)， 測(cè)試No. 3為單一實(shí)驗(yàn)，并分別獨(dú)立的進(jìn)行了 2回。結(jié)果得到的L-半胱氨酸生產(chǎn)量的平均 值和標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2所示。上述通過篩選系統(tǒng)得到的突變體，在L-半胱氨酸的生產(chǎn)培養(yǎng)中 也是有效的。從結(jié)果可知，至少第28位、第188位上的突變可以單獨(dú)地具有效果。此外，在 L-半胱氨酸生產(chǎn)能力提高的多個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)了含有第137位突變(F137S)的3重突變。由 此，可以認(rèn)為F137S可以單 獨(dú)地與提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力相關(guān)。此外，從各種解析可 知，可以認(rèn)為在第11位、33位、52位、59位、60位、65位、72位、77位、85位以及86位上的 突變?yōu)椴粫?huì)使YeaS蛋白質(zhì)的活性降低的沉默突變。[表 2]表2篩選得到的菌株的培養(yǎng)評(píng)價(jià) (8)在yeaS基因中導(dǎo)入代表突變，以及對(duì)突變導(dǎo)入菌株在液體培養(yǎng)基中的L-半胱 氨酸抗性評(píng)價(jià)將第137位的苯丙氨酸被絲氨酸所取代的F137S突變單獨(dú)地導(dǎo)入yeaS基因，通過 將突變型基因加載于PSTV29 (TAKARABio公司)，對(duì)該突變單獨(dú)的效果進(jìn)行研究。
通過重疊(Overlap)PCR,制作組合了目的突變和yeaS自身的啟動(dòng)子、終止子的載 體。首先，設(shè)計(jì)含有突變的弓丨物 P28(cgataaactg tacgaaagacgacacataga ac, SEQ ID NO: 47)，同時(shí)使用 P29(cgcggatcca gtggtcattt agtgc，SEQ ID NO 48)作為引物，以大腸桿菌 MG1655的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到DNA ‘片段1，。此外PCR程序?yàn)?4°C 5分鐘 后，98°C 5秒、55°C 10秒、72°C 45秒循環(huán)30次、，最后在72°C下2分鐘。隨后，使用P9和 P30 (cgcggatcc t gtgggatttg aagcatcc，SEQ ID NO 49)，進(jìn)行程序?yàn)?94°C 5 分鐘后，98 °C 5 秒、55°C 10秒、72°C 60秒循環(huán)30次，最后在72°C下2分鐘的PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到DNA ‘片 段2’。對(duì)于得到的各片段，在瓊脂糖凝膠電泳后將條帶切出，進(jìn)行純化。將DNA ‘片段1’ 和DNA ‘片段2，混合并稀釋10倍后作為模板，使用引物P29和P30，進(jìn)行94°C5分鐘后， 980C 5秒、55°C 10秒、72°C 1分鐘10秒循環(huán)30次，最后在72°C下2分鐘的PCR反應(yīng)，與上 述相同，在瓊脂糖凝膠電泳后純化擴(kuò)增的DNA片段。使用BamHI酶切純化產(chǎn)物和載體pSTV29之后，對(duì)載體使用CIAP(TAKARABio公 司)進(jìn)行末端去磷酸化處理后，將它們連接，并將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM109中。從轉(zhuǎn)化子 中提取質(zhì)粒，得到了攜帶了突變型yeaS基因的pSTV-YeaSF137S，其中該突變型yeaS基因 編碼第137位的苯丙氨酸殘基被絲氨酸所取代的YeaS。此外，作為對(duì)照，構(gòu)建了結(jié)構(gòu)與該 pSTV-YeaSF137S相同的攜帶了野生型yeaS基因的pSTV-YeaSWT。但是，由于不需要導(dǎo)入突 變，因此省略了制作‘片段1’和‘片段2’的步驟，以大腸桿菌MG1655的基因組為模板，以 P29和P30為引物通過PCR方法獲得了含有yeaS基因的片段。接下來，確認(rèn)了突變型yeaS基因?qū)刖暝谝后w培養(yǎng)基中的L-半胱氨酸抗性。 向大腸桿菌 MG1655 中轉(zhuǎn)化 pSTV-YeaSWT 和 pSTV_YeaSF137S，制得了 MG1655/pSTV_YeaSWT 和MG1655/pSTV-YeaSF137S。將各菌株接種于含有25mg/L氯霉素和0. 4%葡萄糖的M9 培養(yǎng)基(Sambrook et al. , Molecularcloning, 3rd edition, 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press)中，在37°C下培養(yǎng)24小時(shí)獲得種子培養(yǎng)液。將該種子培養(yǎng)液按1/50 的接種量接種于新準(zhǔn)備的M9培養(yǎng)基中。在37°C下培養(yǎng)14小時(shí)后，測(cè)定這些菌的在660nm 處的吸光度(0D660)。調(diào)整所有試驗(yàn)菌株的菌濃度，使得與其中0D660最小的試驗(yàn)菌株的 0D660相匹配，之后接種于已經(jīng)裝入含有200 μ M的L-半胱氨酸的Μ9培養(yǎng)基的L字型試管 中，接種量為1/100。將該L-字型試管設(shè)置在自動(dòng)OD測(cè)定培養(yǎng)裝置(BI0-PH0T0REC0RDER TN-1506(ADVANTEC公司))中，每10分鐘測(cè)定0D660并由此觀察生長(zhǎng)繁育情況。從而，通 過判斷在上述培養(yǎng)基中開始生長(zhǎng)繁育的早晚，評(píng)價(jià)各試驗(yàn)菌株的L-半胱氨酸抗性的不同。 在該培養(yǎng)中，L-半胱氨酸的抗性越高，0D660越早開始上升，抗性越低則0D660越晚開始上 升，即表觀上無法確認(rèn)生長(zhǎng)繁育的時(shí)間(lag)將變長(zhǎng)。該生長(zhǎng)繁育曲線如圖2所示。如圖 2所示的一樣，具有F137S突變的YeaS(YeaSF137S)與野生型YeaS (YeaSWT)相比，0D660值 較早開始上升，說明其被賦予了 L-半胱氨酸抗性。(9)YeaSF137S對(duì)L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響在含有L-半胱氨酸的M9培養(yǎng)基中，為了確認(rèn)YeaSF137S強(qiáng)化菌株的L-半胱氨酸 生產(chǎn)能力，該YeaSF137S強(qiáng)化菌株比YeaSWT強(qiáng)化菌株顯示了更高的L-半胱氨酸抗性，構(gòu)建 了連接有更強(qiáng)的PnlpS啟動(dòng)子支配下的編碼YeaSF137S的基因的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒導(dǎo)入到 L-半胱氨酸生產(chǎn)菌EYPSint-4M中，確認(rèn)L-半胱氨酸生產(chǎn)的效果。首先，以pSTV-YeaSWT、 pSTV_YeaSF137S 為模板，使用 P31(aagtcgacgt gttcgctgaa tacggggttc tg, SEQ ID NO:50)、P32(aatctagatc aggattgcag cgtcgcc, SEQ ID NO 51)作為引物，進(jìn)行程序?yàn)?94°C 5 分鐘后，98°C 5秒、60°C 10秒、72°C 60秒循環(huán)30次，最后在72°C下2分鐘的PCR反應(yīng)，擴(kuò) 增了在5，端和3，端上分別添加了 SalI和XbaI的yeaSWT基因片段以及yeaSF137S基因 片段。并與上述的pMIV-Pnlp8 —起，進(jìn)行SalI和XbaI酶切，并連接，將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到 JM109中。從各轉(zhuǎn)化子中提取各質(zhì)粒，并導(dǎo)入L-半胱氨酸生產(chǎn)菌株EYPSint-4M(s)中，分別 得到了 EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSWT、EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSF137S。此外，作為 對(duì)照也制作了僅導(dǎo)入載體的EYPSint-4M/pMIV-5JS，按照上述(3)中所述的方法進(jìn)行試管 培養(yǎng)評(píng)價(jià)。但是，將葡萄糖濃度變更為40g/L，并且變更為不添加IPTG。結(jié)果如表3所示?？芍褂肶eaSWT強(qiáng)化僅使L-半胱氨酸些許增加，而通過 YeaSF137S強(qiáng)化卻大幅提高了 L-半胱氨酸的生產(chǎn)。也就是說，可以認(rèn)為YeaSF137S與以往 的YeaSWT相比，大幅地提高了與非修飾株相比使宿主細(xì)胞的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力提高的 活性。[表 3] 表3在半胱氨酸生產(chǎn)菌株中強(qiáng)化YeaSWT以及YeaSF137S的效果 (10)YeaSF137S對(duì)大腸桿菌L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響對(duì)在大腸桿菌(E. coli)中yeaS基因表達(dá)增強(qiáng)的效果進(jìn)行了研究。首先，構(gòu)建攜帶了突變型cysE基因的質(zhì)粒。具體來說，如特開2005-137369中記 載的pACYC-DES構(gòu)建方法，其中省略了攜帶編碼不受絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫 酶脫氫酶的突變型serA5基因(美國(guó)專利第6，180，373號(hào)中所述)的步驟，構(gòu)建了質(zhì)粒 pACYC-DEl.該pACYC-DES為攜帶了上述突變型serA5、編碼反饋抑制被解除了的突變型SAT 基因的cysEX基因，以及編碼L-半胱氨酸、乙酰絲氨酸分泌因子的ydeD基因(US5972663A) 的質(zhì)粒，與此相對(duì)在本次構(gòu)建的pACYC-DEl中，不含有serA5，而攜帶了 cysEX以及ydeD。各 基因的表達(dá)均使用ompA啟動(dòng)子。如下述所示，預(yù)計(jì)YeaS與L-半胱氨酸的分泌相關(guān)，但在對(duì)YeaSF137S的效果進(jìn) 行評(píng)價(jià)時(shí)，考慮到L-半胱氨酸的分泌因子ydeD產(chǎn)物可能會(huì)提高背景值。因此，為了確認(rèn) YeaSF137S的實(shí)際效果，使pACYC-DEl中的ydeD基因缺損。用MnuI處理pACYC-DEl，并通過 自連接，構(gòu)建了使ydeD基因ORF內(nèi)側(cè)約330bp缺損的質(zhì)粒。由此，使作為L(zhǎng)-半胱氨酸分泌因 子發(fā)揮功能的YdeD不表達(dá)，該僅搭載了 CysEX的質(zhì)粒命名為pACYC_El。將該質(zhì)粒pACYC_El 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，制得了 MG1655/pACYC-El菌株。將該MG1655/pACYC_El菌株作 為宿主，將搭載了野生型yeaS基因的質(zhì)粒pMIV-PnlpS-yeaSWT、搭載了突變型yeaS基因的 質(zhì)粒pMIV-Pnlp8-yeaS137、以及作為對(duì)照的pMIV_5JS，分別通過電穿孔導(dǎo)法導(dǎo)入到該宿主 中。按照與實(shí)施例1所示的方法相同的條件，通過試管培養(yǎng)對(duì)得到的菌株的L-半胱氨酸生 產(chǎn)進(jìn)行研究(表4)。此外，在試管培養(yǎng)中，對(duì)各菌株分別進(jìn)行了 4組平行實(shí)驗(yàn)，表中顯示的是其平均值?？梢缘弥捎趛eaS基因以及突變型yeaS基因的表達(dá)量的增強(qiáng)，提高了在具 有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌中的L-半胱氨酸的生產(chǎn)量。即，確認(rèn)了 yeaS基因產(chǎn)物 即使對(duì)于具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌，也可以顯示出與非修飾株相比使宿主細(xì) 胞的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力提高的活性。[表 4]表4在大腸桿菌半胱氨酸生產(chǎn)菌株中強(qiáng)化YeaSWT以及YeaSF137S的效果 (ll)YeaSF137S 的特性解析從到此為止的結(jié)果可以明確YeaSF137S對(duì)于L-半胱氨酸的生產(chǎn)是有用的。作為理 由，可以考慮是由于提高了 L-半胱氨酸的分泌能力，但為了研究對(duì)其他氨基酸分泌能力的 影響，用 0. IN 鹽酸稀釋將上述的 EYPSint-4M/pMIV-5JS、EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSWT、 EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSF137S共計(jì)3株菌株的試管培養(yǎng)后的培養(yǎng)基各3個(gè)樣品稀釋 20倍，并利用氨基酸分析器(L-8500(日立制作所制造))對(duì)各種L-氨基酸進(jìn)行定量。結(jié)果 如圖3所示。與YeaSWT相比，YeaSF137S分泌了各種L-氨基酸，特別是分泌的L-亮氨酸 從21mg/L增加到656mg/L。從上述內(nèi)容可知，通過用絲氨酸取代YeaS的第137位的苯丙氨 酸殘基，不僅可以促進(jìn)L-半胱氨酸在培養(yǎng)基中的積累，還可以促進(jìn)L-亮氨酸、L-蘇氨酸、 L-絲氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-組氨酸、L-纈氨酸等等其他氨基 酸的積累。因此，可以推測(cè)YeaSF137S也可以促進(jìn)上述這些氨基酸的分泌。因此，YeaSF137S 對(duì)于這些氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)是有利的。此外，對(duì)于大腸桿菌MG1655，同樣地制作了導(dǎo)入了 pMIV-5JS、pMIV-Pnlp8_YeaSWT、 pMIV-Pnlp8-YeaSF137S的菌株，并在與EYPSint-4M(s)的培養(yǎng)相同的條件下，進(jìn)行試管 培養(yǎng)，并對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行了與上述相同的氨基酸分析。結(jié)果如圖4所示。對(duì)于大腸桿菌， YeaSF137S也可以促進(jìn)甘氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸、 L-纈氨酸、以及L-谷氨酸的積累，從而對(duì)于這些氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)是有利的。(12)對(duì)于YeaS的第137位被其他氨基酸殘基所取代的效果的研究當(dāng)YeaS的第137位的苯丙氨酸殘基被絲氨酸以外的其他氨基酸所取代時(shí)，研 究了其對(duì)L-半胱氨酸生產(chǎn)產(chǎn)生的影響。首先，以pMIV-PnlpS-YeaS為模板，使用引物 P33(aaacgtgagg aaatacctgg,SEQ ID NO 禾口P34(cgBtaaactg tacgaannnc gacacataga ac( “η-”表示可以為a，t，g，c中的任意一種)，SEQ ID NO 53)，通過PCR擴(kuò)增了 DNA ‘片 段1，。此外，PCR程序?yàn)?4°C 5分后，98°C 5秒、60°C 10秒、72°C 1分鐘循環(huán)30次，最后在 72°C下1分鐘。此外，同樣地使用P31和P32在該循環(huán)下擴(kuò)增了 DNA‘片段2，。將‘片段1， 和‘片段2’混合并稀釋10倍后作為模板，使用P32和P33作為引物通過上述程序進(jìn)行重疊 PCR，將得到的DNA片段純化后，用SalI和XbaI處理，并將其導(dǎo)入到用同樣的酶處理后的上 述pMIV-Pnlp23載體中，制得了 pMIV-Pnlp23-YeaSF137*。通過測(cè)序確認(rèn)，將搭載了突變型yeaS基因的質(zhì)粒通過電穿孔法導(dǎo)入到大腸桿菌MG1655菌株中，其中該突變型yeaS基因?yàn)?導(dǎo)入了第137位的苯丙氨酸被絲氨酸以外的其他氨基酸所取代的突變的突變型yeaS基因， 并將上述菌株平鋪在按照與上述同樣的方法制作的含有ImM的L-半胱氨酸的M9選擇平板 上，并在37 °C下培養(yǎng)，研究L-半胱氨酸抗性。結(jié)果，以苯丙氨酸(WT)為基準(zhǔn)對(duì)L-半胱氨酸抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)除絲氨酸(S)以 外的谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、組氨酸(H)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)的取代體也可以提高 對(duì)L-半胱氨酸的抗性水平。特別是谷氨酰胺取代體(F137Q)的L-半胱氨酸抗性非常強(qiáng)。在此，用SalI和XbaI處理pMIV-Pnlp23_YeaSF137Q，并將其插入到由 同樣的酶處理的pMIV-Pnlp8中，制作了連接有在pnlp8支配下的yeaSF137Q的 pMIV-Pnlp8-YeaSF137Q。對(duì)其進(jìn)行P. ananatis的L-半胱氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)。作為對(duì)象，使用 導(dǎo)入了 pMIV-Pnlp8-YeaSWT、或 pMIV-Pnlp8-YeaSF137S 的 EYPSint-lM( s)。該結(jié)果如表 5 所示。對(duì)于第137位的苯丙氨酸被谷氨酰胺所取代的突變型YeaS(YeaSF137Q)而言，可以 知道其與非修飾株相比使宿主細(xì)胞的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力提高的活性，比野生型YeaS有 所提高。[表 5]表5在半胱氨酸生產(chǎn)菌株中強(qiáng)化YeaSWT、YeaSF137S以及YeaSF137Q的效果 如上所示，可以得知增加突變型yeaS的表達(dá)量引起的L-半胱氨酸抗性的獲得與 L-半胱氨酸生產(chǎn)量的增加之間的關(guān)聯(lián)性。這一點(diǎn)可以認(rèn)為是由于L-半胱氨酸的抗性提高 促進(jìn)了 L-半胱氨酸向細(xì)胞外的分泌。由此，可以認(rèn)為在含有L-半胱氨酸的M9選擇平板上 具有了 L-半胱氨酸抗性提高的效果的、第137位的苯丙氨酸被丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸、 或者甘氨酸所取代的各突變型yeaS也同樣具有使L-半胱氨酸生產(chǎn)提高的效果。為了驗(yàn)證 上述結(jié)論，可以通過下述方法進(jìn)行確認(rèn)按照與構(gòu)建上述pMIV-Pnlp8-YeaSF137Q的相同的 方法，制作 pMIV-Pnlp8-YeaSF137A、pMIV-Pnlp8_YeaSF137H、pMIV-Pnlp8_YeaSF137C、以及 pMIV-Pnlp8-YeaSF137G,并將它們導(dǎo)入到EYPSint-lM(s)中并進(jìn)行L-半胱氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)。(序列表說明)SEQ ID NO 1 野生型yeaS基因的堿基序列SEQ ID NO 2 野生型YeaS的氨基酸序列SEQ ID NO 3 野生型cysE基因的堿基序列SEQ ID NO 4 野生型cysE編碼的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列SEQ ID NO 5 =PnlpO 的堿基序列SEQ ID NO 6 :Pnlp8 的堿基序列SEQ ID NO 7 :Pnlp23 的堿基序列SEQ ID NO 8 :Pnlp4 的堿基序列
SEQ ID NO 9 =Pnlpl 的堿基序列SEQ ID NO 10 =Pantoea ananatis 野生型 serA 基因的堿基序列SEQ ID NO 11 =Pantoea ananatis野生型serA基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 12 :cysPTWA基因簇的堿基序列 SEQ ID NO 13 :cysP基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 14 :cysT基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 15 :cysW基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO :16 :cysA基因的堿基序列SEQ ID NO 17 :cysA基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO :18 :cysM基因的堿基序列SEQ ID NO 19 :cysM基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 20 53 引物 Pl P3權(quán)利要求
一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L-氨基酸生產(chǎn)能力、且經(jīng)過了修飾從而攜帶具有選自下述(I)～(III)中的突變的突變型yeaS基因的屬于腸肝菌科的細(xì)菌，并從該培養(yǎng)基收集L-氨基酸(I)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第28位的蘇氨酸殘基被蘇氨酸以外的氨基酸所取代的突變，(II)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第137位的苯丙氨酸殘基被苯丙氨酸以外的氨基酸所取代的突變，(1II)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中，第188位的亮氨酸殘基被亮氨酸以外的氨基酸所取代的突變；其中，沒有所述突變的yeaS基因編碼下述(A)或(B)中的任一種蛋白質(zhì)(A)具有SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或(B)具有在SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1～10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有當(dāng)在腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)使得L-半胱氨酸生產(chǎn)能力與非修飾株相比有所提高的活性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，沒有所述突變的yeaS基因?yàn)橄率?a)或(b)的DNA (a)具有SEQID N0:1中所示的堿基序列的基因，或，(b)與SEQID NO :1中所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或能夠由該互補(bǔ)序列制備的探針在 嚴(yán)格條件下雜交、并且編碼具有當(dāng)在腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)使得L-半胱氨酸生產(chǎn)能力與 非修飾株相比有所提高的活性的蛋白質(zhì)的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述(I) (III)的突變分別為下述(i) (iii)的突變(i)第28位的蘇氨酸殘基被天冬酰胺所取代的突變，(ii)第137位的苯丙氨酸殘基被絲氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸以及甘 氨酸中的任一種所取代的突變，(iii)第188位的亮氨酸殘基被谷氨酰胺所取代的突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)菌攜帶具有所述(ii)的突變的突變型 yeaS基因，且在該基因編碼的蛋白質(zhì)中第137位的苯丙氨酸殘基被絲氨酸或谷氨酰胺所取 代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述L-氨基酸選自L-半胱氨酸、 L-亮氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-組氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-精氨 酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述L-氨基酸為L(zhǎng)-半胱氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述細(xì)菌經(jīng)過修飾從而增強(qiáng)了L-半胱氨酸生物 合成系統(tǒng)酶的活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述細(xì)菌經(jīng)過修飾從而增強(qiáng)了絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移 酶活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述細(xì)菌攜帶降低了由L-半胱氨酸導(dǎo)致的 反饋抑制的突變型絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌為泛菌屬細(xì)菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述細(xì)菌為Pantoeaananatis。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌為大腸桿菌。
13.一種屬于腸肝菌科的細(xì)菌，其具有L-氨基酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過了修飾從而攜帶 具有選自下述(I) (III)中的突變的突變型yeaS基因(I)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第28位的蘇氨酸殘基被蘇氨酸以外的氨基酸所取代 的突變，(II)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第137位的苯丙氨酸殘基被苯丙氨酸以外的氨基酸 所取代的突變，(III)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第188位的亮氨酸殘基被亮氨酸以外的氨基酸所取 代的突變；其中，沒有所述突變的yeaS基因編碼下述(A)或⑶中的任一種蛋白質(zhì)(A)具有SEQID NO :2中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或(B)具有在SEQID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10個(gè)氨 基酸而得到的氨基酸序列、并且具有當(dāng)在腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)使得L-半胱氨酸生產(chǎn)能 力與非修飾株相比有所提高的活性的蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)菌，其中，所述L-氨基酸為L(zhǎng)-半胱氨酸。
15.一種DNA，其編碼具有選自下述(I) (III)的突變的下述(A)或(B)中的任一種 蛋白質(zhì)(A)具有SEQID NO 2中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或(B)具有在SEQID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10個(gè)氨 基酸而得到的氨基酸序列、并且具有當(dāng)在腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)使得L-半胱氨酸生產(chǎn)能 力與非修飾株相比有所提高的活性的蛋白質(zhì)；(I)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第28位的蘇氨酸殘基被蘇氨酸以外的氨基酸所取代 的突變，(II)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第137位的苯丙氨酸殘基被苯丙氨酸以外的氨基酸 所取代的突變，(III)在yeaS基因編碼的蛋白質(zhì)中第188位的亮氨酸殘基被亮氨酸以外的氨基酸所取 代的突變。 全文摘要
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L-半胱氨酸等氨基酸生產(chǎn)能力、且經(jīng)過修飾從而攜帶了具有特定突變的yeaS基因的屬于腸桿菌科的細(xì)菌，使L-氨基酸在培養(yǎng)基中生成積累，并從該培養(yǎng)基收集L-氨基酸，從而生產(chǎn)L-氨基酸。
文檔編號(hào)C12P13/10GK101864465SQ201010114678
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日
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