專利名稱：用于外科植入和引導(dǎo)細(xì)胞之組織培養(yǎng)表面的生物相容性材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供具有影響細(xì)胞功能的表面結(jié)構(gòu)和組成的生物相容性材料， 所述細(xì)胞功能尤其是涉及骨細(xì)胞礦化和骨組織形成、胚胎干細(xì)胞的分化尤 其是神經(jīng)元分化、和/或胚胎干細(xì)胞尤其是未分化胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)的細(xì)胞 功能。
背景技術(shù)：
促進(jìn)選定的細(xì)胞功能在多種應(yīng)用中是一項(xiàng)重要任務(wù)，比如開(kāi)發(fā)合適 植入物，生產(chǎn)未分化干細(xì)胞和/或等等。活細(xì)胞可以在其上附著、生長(zhǎng)和/ 或分化和/或還執(zhí)行多種生物學(xué)功能的生物相容性材料被期望用于各種治 療目的。
肌肉骨骼器官的退行性疾病、癌癥和創(chuàng)傷給公眾健康構(gòu)成日益增加
的問(wèn)題。僅脊稚疾病就影響了 30%的成年人口，而年紀(jì)大于65歲的人 中有40%有骨關(guān)節(jié)炎的癥狀。全世界每年進(jìn)行超過(guò)130萬(wàn)例關(guān)節(jié)異體移 植術(shù)(alloplasty )來(lái)治療衰弱的末期關(guān)節(jié)炎。由于沒(méi)有預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的 可接受療法，因此，由于西方人口的老化，可預(yù)料實(shí)施關(guān)節(jié)成形術(shù)將在 接下來(lái)的數(shù)十年內(nèi)顯著增加?，F(xiàn)在，歐洲和美國(guó)超過(guò)25%的全部保健費(fèi) 用涉及肌肉骨骼病，并且美國(guó)治療這些疾病的預(yù)算(2540億美元)例如 是研究和教學(xué)所用資源之和的二倍。
這些疾病的主要外科手術(shù)治療依靠與骨或骨替代物協(xié)同使用的金 屬醫(yī)用植入物。這些植入物必須能夠成功整合入骨組織中以獲得良好的 臨床效果。過(guò)去幾十年該領(lǐng)域內(nèi)取得了重要的進(jìn)展和成果，但是長(zhǎng)時(shí)間 以后植入物松動(dòng)對(duì)于成功的長(zhǎng)期關(guān)節(jié)置換仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。目前 的植入物表面不能橋接較大的骨缺損并單獨(dú)維持長(zhǎng)期的穩(wěn)定性。使用取 自患者自身的骨移植物來(lái)解決這些問(wèn)題之后是高達(dá)15-30%的供體部位 發(fā)病率。20%經(jīng)歷過(guò)髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者在首次外科手術(shù)之后10~15 年內(nèi)在假體周圍發(fā)生骨喪失，而且，在脊推融合術(shù)中20-30%的患者融 合較差。此外，由于在不久的將來(lái)患者群體將包括大量年紀(jì)較輕的患者，
因此關(guān)于長(zhǎng)期無(wú)菌性植入物松動(dòng)的問(wèn)題預(yù)計(jì)將顯著增加。
因此，骨組織內(nèi)植入物性能的改善將對(duì)生活質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)方面產(chǎn)生巨
大的影響。WHO已經(jīng)通過(guò)指定2000 ~ 2010年為"骨和關(guān)節(jié)的10年" i人可了這點(diǎn)(http:Vwww.bonejointdecade.org/),它也是由丹麥衛(wèi)生部 批準(zhǔn)的提案。
植入物在體內(nèi)的生物相容性/生物整合極為復(fù)雜，其涉及傳統(tǒng)上屬于 醫(yī)學(xué)科學(xué)、表面科學(xué)、材料科學(xué)和分子生物技術(shù)的過(guò)程。當(dāng)植入物放入 組織內(nèi)時(shí)，爭(zhēng)奪表面的竟?fàn)幜⒖涕_(kāi)始。在植入物插入體內(nèi)的若干毫秒內(nèi)， 由生理液體中水、蛋白質(zhì)和其它生物分子構(gòu)成的生物層就在植入物的表 面形成。然后，由于生物層中細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的刺激，周圍組織的 細(xì)胞遷移到植入物周圍的區(qū)域。因此，植入物表面和細(xì)胞之間的相互作 用通過(guò)該生物層調(diào)節(jié)。植入物表面的性質(zhì)強(qiáng)烈影響該層的性質(zhì)，并且這 種影響需要被理解和控制以優(yōu)化生物相容性。同樣重要的是細(xì)胞的性 質(zhì)，例如它們經(jīng)由信號(hào)分子穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)通信的能力。在骨愈合期間， 許多生物活性的信號(hào)分子控制骨生成，而一些蛋白質(zhì)已經(jīng)顯示出刺激骨 向植入物愈合的能力。所有這些機(jī)制有助于組織對(duì)植入物的響應(yīng)，并影 響植入物是否以足夠的機(jī)械強(qiáng)度固定在患者的骨內(nèi)或是否出現(xiàn)對(duì)植入 物的炎癥反應(yīng)，其將最終導(dǎo)致無(wú)菌性松動(dòng)和手術(shù)失敗。
骨組織細(xì)胞可以在其上附著和/或生長(zhǎng)并且還執(zhí)行各種生物學(xué)功能的 生物相容性材料被需要用于治療用途，尤其是涉及引入比如假體和骨替代 物等^物的外科治療中。通過(guò)這種治療獲得成功的結(jié)果代表一種 艮難的 挑戰(zhàn)，因?yàn)閊物需要允許^JV部位的組織再生，同時(shí)避免成為身體自身 強(qiáng)大的排斥機(jī)制的標(biāo)靶。植入物的臨床成功取決于植入物和宿主組織之間 界面的直接相鄰處中的細(xì)胞行為。因此，該領(lǐng)域中所述過(guò)程中的關(guān)^^要素 在于在制造這些植入物中生物相容性材料的鑒別和使用。
骨組織包含許多細(xì)胞類型，其中包括骨祖細(xì)胞(osteoprogenitor cells )。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)是產(chǎn)生骨祖細(xì)胞和其它細(xì)胞類型的多能 干細(xì)胞。骨祖細(xì)胞能夠分化并形成成骨細(xì)胞，尤其在響應(yīng)骨再生時(shí)。由 骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的骨建才莫蛋白(bone modeling proteins, BMP和其它 生長(zhǎng)激素)用來(lái)募集骨祖細(xì)胞，并刺激它們成熟為成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞 分泌例如TGF-beta BMP's、其它激素和生長(zhǎng)因子等，其充當(dāng)骨祖細(xì)胞
的趨化引誘劑，刺激成骨細(xì)胞的成熟并誘導(dǎo)骨基質(zhì)的形成。成骨細(xì)胞合
成并分泌有機(jī)骨基質(zhì)(例如膠原纖維、蛋白聚糖、骨鈣素(osteocalcin )、 骨連接蛋白(osteonectin)和骨橋蛋白(osteopontin ))，因此，成骨細(xì) 胞對(duì)礦化骨基質(zhì)的沉積起關(guān)鍵作用。
在骨礦化期間，成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶，以及很多種細(xì)胞因子和 生長(zhǎng)激素。
在尋找可用于假體和之后用于骨組織再生支架的新材料中，美國(guó)專 利US 5,282,861描述了滲有鉭的網(wǎng)狀開(kāi)孔泡沫碳。已經(jīng)表明涂布鉭的植 入物支持牙齒和矯形應(yīng)用中的骨內(nèi)向生長(zhǎng)。Price等(J Biomed Matter Res 70:129-138， 2004 )報(bào)道了成骨細(xì)胞在直徑較小的納米相碳纖維上的 選擇性粘附，而沒(méi)有觀察到纖維表面能的影響。US 6，767，928公開(kāi)了在 2D和3D水平圖案化(patterning)生物材料的方法，其可用于生產(chǎn)3 維或成形(contoured)的生物植入物，以及用于細(xì)胞或組織培養(yǎng)。現(xiàn)
在具有改善的生物相容性材料的持續(xù)開(kāi)發(fā)中，仍然需要鑒別其結(jié)構(gòu)與植 入外科手術(shù)相容并誘導(dǎo)骨再生的材料。
瑞典專利號(hào)SE 511863公開(kāi)了具有微結(jié)構(gòu)化(microtextured)表面 的尤其用于骨組織的植入物。該植入物的表面通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)植入物并同 時(shí)光照所涂的光刻膠層而形成。這種方法產(chǎn)生分布在其表面上的多個(gè)間 隔開(kāi)的凹陷。
美國(guó)專利號(hào)6,419,491公開(kāi)了牙齒植入物，其包括具有形式為交替 的脊和槽或凹陷的有序微幾何狀重復(fù)表面圖案的頸團(tuán)(collar)部分。
然而，上述現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有解決鑒別能促進(jìn)選定細(xì)胞功能的特異性結(jié) 構(gòu)的問(wèn)題，只是證明了在表面中制造不同尺寸的孔的方法。
此外，近年來(lái)，胚胎干細(xì)胞的治療應(yīng)用已經(jīng)吸引了相當(dāng)多的注意， 而且已經(jīng)引發(fā)日益增長(zhǎng)的對(duì)有效生長(zhǎng)神經(jīng)元和未分化胚胎干細(xì)胞以及 引導(dǎo)、控制胚胎干細(xì)胞分化的需求。因此，期望得到輔助/促進(jìn)這些方 法的合適的微環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中的單個(gè)細(xì)胞在微米或納米結(jié)構(gòu)水平看待其周圍
組織或組織培養(yǎng)的表面構(gòu)造，基于這種認(rèn)識(shí)，上述和其它需求可通過(guò)提 供具有微尺度特征的確定表面形態(tài)的生物相容性材料或結(jié)構(gòu)來(lái)解決，所 述材料或結(jié)構(gòu)可用于構(gòu)建細(xì)胞或組織培養(yǎng)表面和/或用于外科/治療處理 的植入物和裝置。
這些細(xì)胞的實(shí)例為形成骨的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)形成骨的細(xì)胞是指能夠形成 骨的任何種類的細(xì)胞，其包括天然存在的細(xì)胞類型和/或修飾的細(xì)胞類 型，例如通過(guò)基因技術(shù)修飾的細(xì)胞類型。其它的實(shí)例包括胚胎干細(xì)胞和 神經(jīng)元。
制造具有期望表面形態(tài)(可以完全是人工的或可以模擬自然中觀察 的表面結(jié)構(gòu))的結(jié)構(gòu)要求能夠定義微米級(jí)或納米級(jí)尺寸特征的技術(shù)。本 發(fā)明采用目前在微米和納米技術(shù)中開(kāi)發(fā)的工具和技術(shù)，其允許設(shè)計(jì)和建
造其表面結(jié)構(gòu)可以具有小到約6 nm的側(cè)向特征尺寸的結(jié)構(gòu)。這種特征 尺寸可以通過(guò)例如鐵蛋白的膠體光刻(lithography)和隨后除去有機(jī)相 并留下離子點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。特別地，j吏用電子束光刻(e-beam lithography ) 和光刻法(photolithography)允許制造精確限定的并能夠在相關(guān)用途 中精確再現(xiàn)的表面形態(tài)。
特別地，已經(jīng)證明，當(dāng)這種生物相容性材料的至少一部分表面的特 點(diǎn)在于包含多種特征的微米級(jí)形態(tài)結(jié)構(gòu)并且其中所述特征中任一個(gè)的 至少一個(gè)側(cè)向尺寸在約O.lnm和約10 nm之間時(shí)，各種不同細(xì)胞類型中 至少一種細(xì)胞的多項(xiàng)細(xì)胞功能顯著提高。
例如，對(duì)于骨植入物來(lái)說(shuō)，已經(jīng)證明不同的結(jié)構(gòu)類型對(duì)形成骨的細(xì) 胞的礦化以及胚胎干細(xì)胞的分化具有顯著不同的影響。
特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從表面伸出的間隔開(kāi)的突起的規(guī)則圖案對(duì)促進(jìn)上 述的細(xì)胞功能特別有效。
一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)突起的尺寸和特征之間間隙的尺寸是相關(guān)參數(shù)。 特別地，每個(gè)突起所具有截面的最小截面直徑不大于并且優(yōu)選小于2 fim,優(yōu)選在0.1 nm和2 pm之間,更優(yōu)選在0.5 和2jim之間,例如 在0.1 nm和1.5nm之間或0.5 nm和1.5 nm之間。此外，當(dāng)所述突起 位于二維規(guī)則網(wǎng)格的網(wǎng)格點(diǎn)上，其中沿至少一維的相鄰網(wǎng)格點(diǎn)之間的距 離不大于7jim,例如小于4nm，例如在0.1 jim和4nm之間，優(yōu)選在0.5nm和3.5nm之間，例如在1 jun和3 之間時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)礦化 和其它細(xì)胞功能的促進(jìn)尤其有效。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一組結(jié)構(gòu)尤其有效，其中每 個(gè)突起所具有的最小和最大截面直徑在1 nm和2 nm之間且中心到中心 的距離在3 nm和8 nm之間。
除特征尺寸外，還已經(jīng)證明很多類型的結(jié)構(gòu)圖案特別有利于促進(jìn)礦 化和胚胎干細(xì)胞分化的不同方面。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)包括具有不同截面幾何形狀的突起， 例如圓狀突起(例如圓形或卵形)和具有包括角的形狀的突起，例如多 邊形、三角形、矩形、正方形、六邊形、星形、平行四邊形等。特別地， 當(dāng)橫截面幾何形狀不同的突起以交替模式例如交替的行排布在規(guī)則的 二維網(wǎng)格上時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)礦化的促進(jìn)尤其有效。同樣地，當(dāng)結(jié)構(gòu)包含 不同橫截面區(qū)域的突起，尤其是當(dāng)該突起以規(guī)則圖案排布時(shí)，已經(jīng)獲得 良好的結(jié)果。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)提供良好礦化的這種圖案之一類似于篁魚(yú)皮，其 將在此^皮更為詳細(xì)地描述。
已經(jīng)提供良好結(jié)果的另一種結(jié)構(gòu)類型是這樣的結(jié)構(gòu)，其中突起位于 二維規(guī)則網(wǎng)格的格點(diǎn)上，使得只有格點(diǎn)的一部分被突起覆蓋，即一些格 點(diǎn)不被突起覆蓋。當(dāng)規(guī)則網(wǎng)格為六邊形網(wǎng)格時(shí)已經(jīng)觀察到類似的有利效 果。特別地，當(dāng)突起以平行的行排布且其中相鄰?fù)黄鹬g的中心到中心 的距離在相鄰行中不同時(shí)，已經(jīng)獲得了良好的效果。當(dāng)每若干行中相鄰 突起之間的中心到中心距離是相應(yīng)的相鄰行中相應(yīng)距離的整數(shù)倍時(shí)，形 成由突起包圍的平坦區(qū)域。特別地，當(dāng)中心到中心距離較大的行中的突 起與相鄰行的突起之間的相應(yīng)中心排成直線，以便將該突起放置在六邊 形的角上時(shí)，這些區(qū)域具有六邊形，其進(jìn)而已經(jīng)證實(shí)是尤其有利的。
對(duì)于人或動(dòng)物胚胎干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，還已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)這種生物相容性材 料的至少一部分表面的特點(diǎn)是包含多種特征的微米級(jí)形態(tài)結(jié)構(gòu)，其中任 一種所述特征的至少一個(gè)側(cè)向尺寸在約0.1 nm和約10 nm之間，尤其 是0.5jim和約2nm之間時(shí)，若將細(xì)胞和該表面接觸，則對(duì)未分化胚胎 干細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)顯著改善。當(dāng)該特征以相鄰/最鄰近特征之間最小間 隙尺寸在約2 nm和約6nm之間的規(guī)則圖案排布時(shí)，這種改善尤其顯著。
已經(jīng)證明，當(dāng)所述結(jié)構(gòu)包含按此處所述類似篁魚(yú)皮的規(guī)則圖案排布
的多個(gè)長(zhǎng)形脊時(shí)，當(dāng)細(xì)胞接觸該表面時(shí)，改善了對(duì)胚胎干細(xì)胞分化的促 進(jìn)。
同樣地，對(duì)于胚胎干細(xì)胞的分化來(lái)說(shuō)，還已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)這種生物相 容性材料的至少 一部分表面的特點(diǎn)是包含多種特征的微米級(jí)形態(tài)結(jié)構(gòu)，
其中任一種所述特征的至少一個(gè)側(cè)向尺寸在約O.l nm和約10 nm之間， 尤其是0.5 nm和約2 jim之間時(shí)，細(xì)胞和該表面接觸時(shí)對(duì)胚胎干細(xì)胞的 神經(jīng)元分化的促進(jìn)顯著改善，尤其是當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受補(bǔ)充有神經(jīng)元生長(zhǎng)因子 和化合物的培養(yǎng)基時(shí)如此。當(dāng)該特征以相鄰/最鄰近特征之間最小間隙 尺寸在約2 nm和約6 jim之間的規(guī)則圖案排布時(shí)，這種改善尤其顯著。 此外，當(dāng)該特征包含規(guī)則排布的突起以產(chǎn)生多個(gè)突起各自被排布為包圍 沒(méi)有突起的相應(yīng)平面區(qū)域(即表面區(qū)域相對(duì)于突起的頂面是凹陷的區(qū) 域)時(shí)，這種改善尤為顯著。當(dāng)特征/突起規(guī)則排布在交替的行中，其 中相鄰行的特征被排布為具有不同的節(jié)距(pitch distance),例如使得 一行中的節(jié)距為相鄰行中節(jié)距的整數(shù)倍和/或相對(duì)于彼此移位時(shí)，可以 提供這種圖案。優(yōu)選地，至少一些突起具有基本上是圓狀的截面，例如 環(huán)狀截面。
甚至還有，已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)這種生物相容性材料的至少一部分表面的 特點(diǎn)是包含多種特征的微米級(jí)形態(tài)結(jié)構(gòu)，其中任一種所述特征的至少一 個(gè)側(cè)向尺寸在約0.1 pm和約10 nm之間，尤其是1 pm和約10 之 間時(shí)，細(xì)胞和該表面接觸時(shí)促進(jìn)神經(jīng)突從初級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞沿限定方向長(zhǎng) 出(outgrowth)。當(dāng)該特征以相鄰/最鄰近特征之間最小間隙尺寸在約2 Hm和約6fim之間的規(guī)則圖案排布時(shí)，這種改善尤其顯著。
根據(jù)各方面，本發(fā)明提供了一種生物材料，或一種醫(yī)用植入物或生 物相容性涂層，其用于制造包含這種生物相容性材料的植入物。該生物 材料具有暴露的表面，其中該表面具有包含沿一個(gè)或多個(gè)側(cè)向的微尺度 特征的形態(tài)結(jié)構(gòu)。限定本發(fā)明生物相容性材料之形態(tài)的參數(shù)是這樣的， 其增強(qiáng)附著到其表面的形成骨的細(xì)胞的礦化并支持有助于礦化的生物 相互作用。
根據(jù)另一些方面，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)組織或細(xì)胞的裝置，例 如組織培養(yǎng)皿或瓶或能容納細(xì)胞的其它任何表面，該裝置包含用于接納 組織或細(xì)胞培養(yǎng)物的暴露表面，其中所述表面具有包含此處所述微米或
納米尺度特征的形態(tài)結(jié)構(gòu)，選擇所述特征以支持神經(jīng)元或胚胎干細(xì)胞的 生長(zhǎng)和/或分化，例如處于未分化狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)。另一些方 面涉及用于生產(chǎn)這些裝置的方法和工具，例如包含這些結(jié)構(gòu)的印模
(stamp)或這些結(jié)構(gòu)的藍(lán)圖，其將用于例如熱模壓和/或注射成型用于 生產(chǎn)包括所述結(jié)構(gòu)的生物相容性材料。


下面將結(jié)合實(shí)施方案并參照附圖以更為充分地解釋本發(fā)明，其中
圖1顯示篩選工具的一個(gè)實(shí)施例的頂;現(xiàn)圖一所謂的生物表面結(jié)構(gòu)陣列 (BioSurface Structure Array, BSSA)晶片(wafer)—用于鑒定促ii/增強(qiáng) 細(xì)胞功能比如骨形成細(xì)胞的礦化或者胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)元的生長(zhǎng)/分化的 形態(tài)結(jié)構(gòu)(topographical structures )。
圖2顯示圖1中篩選工具沿A-B線的截面視圖。 圖3顯示篩選工具另一個(gè)實(shí)施例的頂視圖。
圖4顯示包含交替的寬度為X (jrni)的槽和寬度為Y (nm)的脊 的形態(tài)結(jié)構(gòu)的頂視圖(圖4a)和截面視圖(圖4b)。
圖5顯示包含方孔和預(yù)定節(jié)距的形態(tài)結(jié)構(gòu)的頂視圖(圖5a)和截面 視圖(圖5b)。
圖6顯示包含由寬為Xnm的脊隔開(kāi)的尺寸為X (fim) x y ( ) 的矩形孔的形態(tài)結(jié)構(gòu)的頂視圖(圖6a)和截面視圖(圖6b、 c)。
圖7顯示包含具有預(yù)定尺寸和預(yù)定節(jié)距的柱的形態(tài)結(jié)構(gòu)的頂視圖 (圖7a)和截面視圖(圖7b)。
圖8顯示包含交替的方孔和柱的形態(tài)結(jié)構(gòu)的頂視圖。
圖9顯示在玻璃(a)和在BSSA晶片的參考表面(b)上培養(yǎng)的 MC3T3細(xì)胞。已經(jīng)通過(guò)羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色顯示肌動(dòng)蛋白纖維。
圖IO顯示在具有"D2/4"表面結(jié)構(gòu)的測(cè)試區(qū)域上培養(yǎng)的MC3T3細(xì) 胞。已經(jīng)通過(guò)羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色顯示肌動(dòng)蛋白纖維。
圖11顯示在具有"D2/10"表面結(jié)構(gòu)的測(cè)試區(qū)域上培養(yǎng)的MC3T3 細(xì)胞。已經(jīng)通過(guò)羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色顯示肌動(dòng)蛋白纖維。
圖12顯示用于胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)元的礦化和/或生長(zhǎng)/分化的形態(tài)結(jié) 構(gòu)之實(shí)例的示意性頂視圖。
圖13顯示促進(jìn)礦化的形態(tài)結(jié)構(gòu)的實(shí)例。
圖14舉例說(shuō)明與礦化誘導(dǎo)基因聯(lián)合應(yīng)用的基因誘導(dǎo)測(cè)試的實(shí)例。
圖15顯示用于綿羊中骨形成測(cè)試的樣品保持器。
圖16顯示BSSA晶片局部視圖的兩個(gè)實(shí)施例，其顯示出四個(gè)測(cè)試 方塊的一些部分。
圖17顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其說(shuō)明與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比選定結(jié)構(gòu)如何增加細(xì) 胞培養(yǎng)中特征性胚胎干細(xì)胞集落的數(shù)目。
圖18顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其說(shuō)明與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比類似篁魚(yú)皮的選定結(jié) 構(gòu)如何指導(dǎo)分化。
圖19顯示定量結(jié)果，其說(shuō)明與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比選定尺寸范圍內(nèi)的結(jié) 構(gòu)如何增加細(xì)胞培養(yǎng)中特征性胚胎干細(xì)胞集落的數(shù)目。
圖20顯示定量結(jié)果，其說(shuō)明與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比一些選定結(jié)構(gòu)如何增 加細(xì)胞培養(yǎng)中特征性胚胎干細(xì)胞集落的數(shù)目。
圖21顯示定量結(jié)果，其說(shuō)明一些結(jié)構(gòu)在胚胎干細(xì)胞集落的表型外 觀方面如何增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞集落的質(zhì)量，而另一些結(jié)構(gòu)如何引導(dǎo)胚胎干 細(xì)胞沿分化通路繼續(xù)進(jìn)行。
圖22~26顯示被允許在對(duì)照結(jié)構(gòu)以及各種形態(tài)結(jié)構(gòu)上在B27培養(yǎng) 基中分化14天、固定并用抗p-微管蛋白III的抗體(神經(jīng)元標(biāo)志物， 紅色)和DAPI (給細(xì)胞核染色，藍(lán)色)染色的細(xì)胞的照片。
圖27顯示定量結(jié)果，其說(shuō)明不同結(jié)構(gòu)上神經(jīng)元分化的程度。
圖28顯示定量結(jié)果，其說(shuō)明不同尺寸結(jié)構(gòu)上神經(jīng)元分化的程度。
圖29顯示不同結(jié)構(gòu)上用抗-|5-微管蛋白III抗體染色的原代神經(jīng)元培 養(yǎng)物的照片。
圖30示意性顯示具有微尺度結(jié)構(gòu)的暴露表面的組織培養(yǎng)皿的截面圖。
具體實(shí)施例方式
一般期望植入物成功并入骨組織中，以便獲得良好的臨床結(jié)果。過(guò) 去幾十年該領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)取得了主要的進(jìn)展和成果，但是植入物隨時(shí)間而 松弛對(duì)于成功的長(zhǎng)期關(guān)節(jié)置換術(shù)一直是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。具有能促進(jìn)骨 形成細(xì)胞之礦化的表面的植入物或裝置可以基于其使用而改善治療的 效果。因此，本發(fā)明提供一種生物相容性材料或結(jié)構(gòu)，其支持骨形成細(xì) 胞(包括成骨細(xì)胞)的礦化作用。
整形植入物具有有限的壽命，其中植入物和骨組織之間的粘附性差 可能導(dǎo)致植入物的錯(cuò)位。因此，本發(fā)明還提供一種植入表面，其支持骨 形成細(xì)胞的礦化，從而提高該植入物的生物相容性。
此外，在不同的應(yīng)用例如治療應(yīng)用中，期望生產(chǎn)特異性細(xì)胞類型， 例如用于細(xì)胞替代療法治療帕金森病的多巴胺能神經(jīng)元。與之相似，對(duì) 于例如藥物篩選目的，期望控制特定細(xì)胞類型均一群體的重復(fù)性、質(zhì)量 及其量，以便能實(shí)現(xiàn)/促進(jìn)潛在新藥的大規(guī)模篩選和測(cè)試。
在一些應(yīng)用中，期望生長(zhǎng)大量未分化的胚胎干細(xì)胞，然后誘導(dǎo)胚胎 干細(xì)胞分化成期望的細(xì)胞類型。 一旦分化成特殊的細(xì)胞類型，這些特殊 細(xì)胞類型可用于很多不同應(yīng)用，例如藥物篩選、細(xì)胞替代治療、糖尿病、 軟骨損傷等。
本發(fā)明基于這種認(rèn)識(shí)，即指導(dǎo)礦化、生長(zhǎng)和/或分化的細(xì)胞功能受細(xì) 胞微環(huán)境的強(qiáng)烈影響。因此認(rèn)為，體內(nèi)骨細(xì)胞的礦化、神經(jīng)元或未分化 胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)及其隨后的分化可依賴于提供細(xì)胞可粘附其上的合 適結(jié)構(gòu)。特別地，本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞微環(huán)境中表面的2-和3-維結(jié)構(gòu)或 形態(tài)是上述過(guò)程的關(guān)鍵因素。具有極大量的不同可能的微環(huán)境。因此本 發(fā)明在一方面涉及提供一種生物相容性材料，其表面形態(tài)形成可以增強(qiáng) 礦化并導(dǎo)致植入物更好地整合入其余骨中的特殊微環(huán)境。可以受表面形
態(tài)影響的其它細(xì)胞功能包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、擴(kuò)增、分離、遷移、分化、去 分化、細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間組織結(jié)構(gòu)等。由于蛋白質(zhì)和細(xì)胞的尺寸為從納米 到微米的范圍，因此對(duì)于提供生物形容性材料的問(wèn)題，這些是相關(guān)的長(zhǎng) 度水平。
I.證明本發(fā)明生物相容性材料的生物相容性及其對(duì)細(xì)胞功能的促進(jìn)， 例如對(duì)礦化的促進(jìn)作用的方法。
通過(guò)利用提供不同候選表面結(jié)構(gòu)的篩選工具/測(cè)試來(lái)篩選具有不同 表面形態(tài)的材料可以鑒定本發(fā)明的生物相容性材料或結(jié)構(gòu)。
特別地，礦化測(cè)試，利用例如茜素紅染色(實(shí)施例2、 3)、 vonKossa 染色(von Kossa, J (1901): "Ueber die im Organismus kuenstlich erzeugbaren Verkalkungen." Beitr Pathol Anat AIIg Pathol 29: 163-202)，異位骨形成(實(shí)施例5)和體內(nèi)骨形成/骨內(nèi)生(實(shí)施例6)
合適形態(tài)結(jié)構(gòu)的工具。
適用于所述篩選形態(tài)結(jié)構(gòu)的篩選工具的實(shí)例包括所謂的生物表面 結(jié)構(gòu)陣列(BSSA)晶片。圖1顯示了這種生物表面結(jié)構(gòu)陣列晶片的一 個(gè)實(shí)例的頂視圖。BSSA晶片1包含60個(gè)測(cè)試區(qū)域。許多測(cè)試區(qū)域2 保持"空白"，即它們未被加工為具有結(jié)構(gòu)化的表面。因此，測(cè)試區(qū)2 的表面基本是平的。因此，對(duì)照實(shí)驗(yàn)被內(nèi)在地包括在每個(gè)使用BSSA篩 選工具的平行篩選測(cè)試中。被指定為Sl、 S2...S54的其余測(cè)試區(qū)域包含 此處所述的各自結(jié)構(gòu)化的表面。這些測(cè)試區(qū)為尺寸為10 mmx 10 mm的 正方形。
可以通過(guò)許多生產(chǎn)技術(shù)制造用作篩選工具來(lái)鑒定誘導(dǎo)/增強(qiáng)細(xì)胞功 能例如礦化、生長(zhǎng)和分化的結(jié)構(gòu)的晶片。
用于其制造的方法的實(shí)例包括本領(lǐng)域公知的下列技術(shù)中的一種或 多種
光刻方法光刻是一種已知的方法，其中幾何形狀/圖案從光掩膜轉(zhuǎn)移至 待結(jié)構(gòu)化的表面，如晶片的表面。具有最小側(cè)向特征尺寸在約1微米至 100納米以下范圍的光刻設(shè)備是已知的。例如下文中描述了光刻工藝
S.M.Sze: Semiconductor Devices, Physics and Technology, 2nd Edition, John Wiley & Sons 2002, Chapter 12: Lithography and Etching;和 Plummer, Deal, Griffin: Silicon VLSI Technology, Fundamentals, Practice, and Modeling, Prentice Hall 2000, Chapter 5: Lithography,
電子束光刻原則上，電子束光刻可以按光刻中^f吏用光的完全相同的方 式進(jìn)行光刻膠的啄光。電子束光刻具有可達(dá)約5納米的特別高的分辨率。
熱壓印熱壓印使用原模(master stamp)在聚合物基底上壓印微米和 納米尺度的結(jié)構(gòu)。該方法允許4吏用廣泛的聚合物材料，利用原才莫生產(chǎn)許 多完全圖案化的基底。熱壓印技術(shù)提供了一種低成本、高多樣性的制造 方法，可很好地適用于從研發(fā)應(yīng)用到大恥漠生產(chǎn)中所用BSSA的制造。 極高度均勻的高深寬比可以在大尺寸晶片(如8英寸或12英寸晶片)上 的微米和納米尺度結(jié)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)。尺寸在20納米以下的特征是可能的。原 ?？梢酝ㄟ^(guò)如電子束光刻等技術(shù)制造。
納米壓印光刻(nano imprint lithography )、激光燒蝕(laser ablation )、 化學(xué)蝕刻(chemical etching )、等離子噴涂、磨料噴射(abrasive blasting )、 雕刻、刻劃、或孩i^a工(micro machining)等。
圖2顯示圖1中晶片的截面圖。圖2a顯示該晶片沿A-B線的整個(gè) 寬度上的截面圖。圖2b顯示其中一個(gè)測(cè)試區(qū)域之表面一部分的放大圖。 晶片l具有層狀結(jié)構(gòu)，其包括圖案化的基底層21例如硅層，以及表面 層23。晶片表面被圖案化，例如通過(guò)光刻工藝來(lái)圖案化，以在各測(cè)試區(qū) 域Sl、 S2, ...， S54的表面上分別提供不同的圖案。該結(jié)構(gòu)的深度/高 度為H。在光刻過(guò)程中，高度H可通過(guò)蝕刻過(guò)程來(lái)控制。圖案化的表 面覆蓋有二氧化硅薄層22，和/或不同生物相容材料的表面層23，所述 生物相容材料例如鉭或任何其他金屬、金屬氧化物、金屬氮化物、金屬 碳化物、金剛石、金剛石樣碳、半導(dǎo)體、半導(dǎo)體氧化物/氮化物、絕緣 體、聚合物、共聚物。測(cè)試區(qū)域之間有沒(méi)有結(jié)構(gòu)的"空白"邊界區(qū)域，即 邊界區(qū)域沒(méi)有加工為具有結(jié)構(gòu)化的表面。在此情況下，空白邊界區(qū)域的 寬度為0.3mm?？瞻走吔缇€輔助視覺(jué)對(duì)準(zhǔn)和識(shí)別所述結(jié)構(gòu)。所述空白邊 界還用作與每個(gè)測(cè)試方塊相鄰的小對(duì)照表面。
應(yīng)當(dāng)注意的是，圖2是示意圖而未按比例繪制。具體來(lái)說(shuō)，為了改
善可讀性，豎向尺度可能被夸大。
II.本發(fā)明生物相容性材料的化學(xué)組成
生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案可以采取各種形式，比如
-醫(yī)用植入物或用于制造醫(yī)用植入物的生物相容性涂料，
-具有暴露給細(xì)胞培養(yǎng)的表面的組織培養(yǎng)皿/瓶，其中所述暴露表 面具有支持例如神經(jīng)元或未分化狀態(tài)下胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)或分 化等期望細(xì)胞功能的結(jié)構(gòu)，
-組織培養(yǎng)表面或例如組織培養(yǎng)塑料，其已經(jīng)被修飾為在其表面 上顯示這些結(jié)構(gòu)或這些結(jié)構(gòu)的藍(lán)圖。在這方面，組織培養(yǎng)塑料 意思是可用于生產(chǎn)能夠用于體外細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)的表面的 任何聚合物。
生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案可以包含基底層和任選地表面層。
適于制備生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的基底材料包括任何半導(dǎo)體(摻雜 或未摻雜)、單種金屬、金屬氧化物、金屬氮化物、合金、陶瓷、聚合 物、共聚物、復(fù)合材料、藥物遞送系統(tǒng)、具有生物活性分子的聚合物、 其它生物活性化合物或其任意組合。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，表面層包含其生物相容性足以增強(qiáng)骨形成
細(xì)胞礦化的材料。表面層的實(shí)例包括表面金屬沉積，例如鉭、鈦、Ti-Al-V 合金、金、鉻、金屬氧化物、半導(dǎo)體氧化物、金屬氮化物、半導(dǎo)體氮化 物、聚合物、生物聚合物或其它合金。用于植入物的優(yōu)選表面組成包括 鉭或鈦。
在一些實(shí)施方案中，生物相容性材料或結(jié)構(gòu)還包含可以沉積或吸附 到所述材料或結(jié)構(gòu)的暴露表面或表面層上的其它組分，例如一種或多種 生物活性化合物。例如，所述化合物可以選自抗體、抗原、糖蛋白、脂 蛋白、DNA、 RNA、多糖、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物。 優(yōu)選地，選自BMP、類EGF、 TGF-p的生長(zhǎng)激素被吸附或結(jié)合到生物 相容性材料的表面。
III.本發(fā)明生物相容性材料的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
生物相容性材料或結(jié)構(gòu)(其可以采用上述各種形式)的全部或部分 表面在所述材料或結(jié)構(gòu)表面所限定的平面內(nèi)包含一維或多維的微米尺
度特征。此處所用的術(shù)語(yǔ)微尺度和微米尺度指的是約1 pm至約1000 nm 的長(zhǎng)度尺度。此處所用的術(shù)語(yǔ)納米尺度指的是約1 nm至約1000 nm尤 其是約1 nm至約100 nm的長(zhǎng)度尺度。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述特征是結(jié)構(gòu)/形態(tài)特征，如從生物 相容性材料表面伸出的突起。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，微米尺度特征在至少一個(gè)方向上具有 側(cè)向尺寸，其中所述尺寸選自下列區(qū)間之一約1 jim和約20 nm之間； 約1 ~ 10 ,之間；約10 ~ 20阿之間，約1拜~ 2阿之間，約2 jim ~ 4 nm之間，約4 nm ~ 6 pm之間，約6 Jim ~ 8 pm之間，約8 nm ~ 10 [im 之間；約10 12nm之間；約12 14fim之間；約14一16nm之間； 約16~18 jun之間；約18 ~ 20 nm之間。優(yōu)選至少一個(gè)側(cè)向尺寸為1 Hm 6jmi之間。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，從特征的截面區(qū) 內(nèi)任一給定點(diǎn)到截面區(qū)邊緣的最短距離為小于20 nm，小于10nm，小 于8阿，小于6jim， 小于4阿，例如小于2nm。
所述側(cè)向尺寸沿基本平行于所述表面或至少基本與所述表面相切 的方向測(cè)量。
任何微米尺度特征和其最近相鄰特征之間的最大距離或間隙在至 少一個(gè)側(cè)向上具有側(cè)向尺寸，其中所述尺寸選自下列區(qū)間之一約0.5 jim ~ 1阿之間，約1 [im ~ 2 ,之間,約2 , ~ 4 ,之間,約4 ~ 6nm之間，約6nm 8fim之間，約8 pm ~ 10 jim之間，約10 fim ~ 12 nm之間，約12 pm ~ 14 jim之間，約14 ~ 16nm之間。優(yōu)選戶斤述 側(cè)向尺寸為1 fim ~ 12 jim之間。微米尺度特征在生物相容性材料表面的 布置優(yōu)選沿一個(gè)或多個(gè)側(cè)向是周期性的，并可以通過(guò)具有選自下列區(qū)間 之一的側(cè)向節(jié)距(pitch )尺寸的周期函數(shù)來(lái)描述約1 nm~2 nm之間， 約2 Jim ~ 4 jim之間，約4 jim ~ 6 之間,約6 ~ 10 之間,約 10nm 16nm之間，約16 nm ~ 20 nm之間,約20 ~ 24 之間。 優(yōu)選節(jié)距尺寸為2 nm ~ 12 nm之間。
所述微米尺度特征的周期函數(shù)可以沿一個(gè)方向具有較小周期和沿
另一個(gè)方向具有較大周期，例如大2、 3、 IO倍或更大的周期。生物相 容性材料表面的任一種微米尺度特征可以被定義為周期性結(jié)構(gòu)的 一個(gè) 周期。因此，周期性結(jié)構(gòu)特征的側(cè)向尺寸可以被定義為周期性形狀/函 數(shù)的周期，即該結(jié)構(gòu)重復(fù)其形狀的最短間隔的長(zhǎng)度。
微米尺度特征的深度/高度，即它們?cè)趶纳锵嗳菪圆牧媳砻嫱怀龅?方向上的線性尺寸可以是納米或微米尺度，即該結(jié)構(gòu)可以具有1 nm~ 10 nm的高度/深度，或者其高度/深度選擇下列區(qū)間的范圍約0.07 pm ~ 0.6 pm之間，0.6 fim ~ 1.6 jim之間，約1.6 ~ 3.0 fim之間，約3 [iin ~ 10 fim之間。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)具有大于0.6 nm、至少1.2 jun、 1.6jim、 2.0 nm、 3.0 jim、 5.0 jim、 10 pm的深度/高度，盡管更大的高 度也是可能的，例如至少20nm、 50nm、 100 jun或1000 nm。在一些 實(shí)施方案中，所有特征基本具有相同的高度，而在另一些實(shí)施方案中所 述特征可以具有不同的高度。
任一種微米尺度特征的側(cè)向截面優(yōu)選為幾何形狀，如正方形、矩形、 六邊形、多邊形或星形。所述特征的頂和/或側(cè)面優(yōu)選基本為平面。然 而，微米尺度特征的表面也能夠包括納米尺度的特征以實(shí)現(xiàn)微米和納米 尺度的形態(tài)協(xié)同效應(yīng)。這可以通過(guò)例如化學(xué)蝕刻(例如用NaOH或檸檬 酸)、離子蝕刻、膠體平版印刷術(shù)(colloidal lithography )(例如用聚苯 乙烯珠、巴基球或蛋白質(zhì))、切向入射物理氣相沉積^布、CVD涂布或 等離子體噴涂等獲得。生物相容性材料表面的特征可以具有相同或不同 的形狀。優(yōu)選生物相容性材料表面的特征為幾何(例如正方形、矩形、 六邊形、星形或多邊形)形狀。
在一些實(shí)施方案中，所述特征的截面形狀可以來(lái)源于簡(jiǎn)單幾何形狀 如正方形、或圓形等，例如通過(guò)修飾正方形的角獲得。這些修飾的實(shí)例 包括切除角或圓角處理。因此，這些形狀一般地是正方形、或圓形等， 但是它們與完美的正方形或圓形稍有變化，從而引入更多的角和/或修 飾相交于每個(gè)角的邊緣之間的角。
一般地，2維周期性結(jié)構(gòu)可以通過(guò)具有預(yù)定形狀如正方形、矩形、 六邊形等的表面之平面內(nèi)的單元格子和定義單元格中詳細(xì)結(jié)構(gòu)的重復(fù) 單元(基礎(chǔ))來(lái)定義，所述重復(fù)單元比如孔或突起，例如方形柱、多棱柱、圓柱、角錐體等。通過(guò)單元格所定義的位置來(lái)定義重復(fù)距離，而重
復(fù)單元?jiǎng)t定義預(yù)定的形狀和尺寸。這些單元格的位置可以通過(guò)各自的2 維向量來(lái)定義。因此，該網(wǎng)格結(jié)構(gòu)由沿所述表面限定的二維尤其是沿單 元格維度的各自倍數(shù)從單元格的平移而獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)
特征的中心位置可以通過(guò)向量V限定，V-IhVi + Il2V2，其中Vi和V2是 表面內(nèi)線性無(wú)關(guān)的向量，而W和Il2是整數(shù)。
在一些實(shí)施方案中，每個(gè)特征的中心位于具有預(yù)定網(wǎng)格常數(shù)的2維 網(wǎng)格如六邊形、矩形或正方形網(wǎng)格的網(wǎng)格點(diǎn)上。
在一些實(shí)施方案中，所有特征覆蓋這種網(wǎng)格的所有格點(diǎn)，而在另一 些實(shí)施方案中，下方網(wǎng)格的網(wǎng)格點(diǎn)沒(méi)有被全部覆蓋。例如，在一些實(shí)施 方案中，每隔一行的格點(diǎn)中，每隔一個(gè)格點(diǎn)可以被一個(gè)特征覆蓋。還有 另一些實(shí)施方案中，每隔一、二、三或更多行中，每隔一、二、三或更 多個(gè)格點(diǎn)保持空白。
在一些實(shí)施方案中，所述形態(tài)結(jié)構(gòu)可以包括多種不同特征，例如排 以規(guī)則例如周期性圖案排布的許多不同特征，例如二、三或更多種不同
特征交替排布的行。這些圖案的實(shí)例包括包含在交替行中排布具有正方 形截面特征和具有圓形截面特征的結(jié)構(gòu)。
在一些實(shí)施方案中，所述特征排成線和/或行。在一些實(shí)施方案中， 每行的特征具有相同的節(jié)距，而在另一些實(shí)施方案中，該節(jié)距可以在行 內(nèi)和/或行間變化。與之相似，所有行的行間距可以相同或行與行之間 有變化。在一些實(shí)施方案中， 一行中一些或全部結(jié)構(gòu)可以相對(duì)其同一行 中各自的相鄰結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)。在一些實(shí)施方案中， 一行中一些或全部結(jié)構(gòu)可 以相對(duì)其相鄰行中各自的相鄰結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)。
在一些實(shí)施方案中，所述特征在所有側(cè)向上的側(cè)向尺寸為1 jim和 約10 nm之間。這些特征的實(shí)例包括一般具有正方形或圓形截面的突 起。在另一些實(shí)施方案中，所述特征在一個(gè)方向上的側(cè)向尺寸為1 ]Lim和 約10nm之間，而在另一個(gè)方向上的側(cè)向尺寸更大。
這些特征的實(shí)例包括長(zhǎng)形脊、肋或孔。脊的側(cè)面可以基本光滑或者它 們可以包括其它特征，例如突起和/或凹槽的規(guī)則序列。因此，在一些實(shí)施 方案中，這些脊可以具有類似于成行的正方形或圓形等的外觀，它們與各 自的鄰居合并/互相連接而形成不間斷的脊。
特別地，在一些實(shí)施方案中，所述形態(tài)結(jié)構(gòu)包含在所有側(cè)向上側(cè)向尺
寸在l Hm和約10 nm之間的特征以及只在一個(gè)方向上側(cè)向尺寸在l nm和 約10 nm之間的特征。這些結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括排成行的一般為正方形和/或圓 形的特征，其中所述行被長(zhǎng)形脊分開(kāi)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案具有微結(jié)構(gòu)D2/4，其表面特征在于包含以 下的形態(tài)尺寸為2 nm x 2 nm的方形柱和節(jié)距為6 jtm的二維周期性結(jié)構(gòu) (圖7)。該方向性周期性結(jié)構(gòu)的深力高度大于0.6 nm,優(yōu)選其豎向尺寸 在1.2 jim和10.0 jim之間，更優(yōu)選至少豎向尺寸為至少1.2 nm、 1.6 fim、 2.0 jim、 3.0 jim、 5.0 fim、 10 nm，盡管更大的高度也是可能的，比如至少 20拜、50拜、100 ,或1000 ,。
圖12a~k顯示具有突^/柱形式的特征的形態(tài)結(jié)構(gòu)實(shí)例的頂視圖，所 述柱具有一般為圓形、正方形或矩形的截面。每個(gè)特征在至少一個(gè)方向具 有側(cè)向直徑X，而相鄰行和列中的特征之間的間隙距離-皮指定為Y。在圖 12a、 c、 e、 f和i中，Y等于任意特征和其最接近特征之間的間隙尺寸， 其對(duì)應(yīng)于節(jié)距X + Y。在圖12b、 d、 g、 h和j中，不同特征到最接近特征 的間隙距離不同，例如圖12b中的特征1201、 1202和1203。特征1201與 特征1202最接近；相應(yīng)地間隙尺寸為Y。但是，特征1203與其最接近特 征1201和1202之間具有稍微不同的間隙尺寸d。因此，在圖12b、 d、 g、 h和j中，行與行之間其節(jié)距不同。在包括特征1201的行中，節(jié)距為X十 Y，而包括特征1203的行中節(jié)距為2(X + Y)。
盡管也可以是其它高度，下文實(shí)施例中所用結(jié)構(gòu)具有1.6 jtm的特征高 度，除非另外提及。
在圖12的實(shí)例中，每個(gè)特征的中心位于具有網(wǎng)格常數(shù)a和b的2維矩 形網(wǎng)格的相應(yīng)格點(diǎn)上，如圖12a和b所示。但是，在圖12a e、 h i中， 實(shí)際上格點(diǎn)沒(méi)有被全部覆蓋，而在圖12f和k中全部格點(diǎn)都被特征覆蓋。 在圖12a、 c、 e、 f和i中，所述網(wǎng)格是網(wǎng)格常數(shù)a-b- (X + Y)的正方 形網(wǎng)格。在圖12b、 d、 g、 h和j中，所述網(wǎng)格是矩形網(wǎng)格，并且網(wǎng)格常數(shù) 為a-X十Y和b- (X + Y)/2。在圖12k中，網(wǎng)格常數(shù)為a = 2'X和b = 3.5'X。對(duì)于選定的X和Y值，晶片已經(jīng)才艮據(jù)圖12a h生產(chǎn)，其中以 計(jì)的(X，Y)選自(X，Y) = (1,1)、 (1,2)、 (1,4)、 (1,6)、 (2,1)、 (2,2)、 (2,4)、 (2,6)、 (4,1)、 (4,2)、 (4,4)、 (4,6)、 (6,1)、 (6,2)、 (6,4)、
(6,6)。對(duì)于選定的X和Y值，晶片已經(jīng)根據(jù)圖12k生產(chǎn)，其中以nm計(jì) 的X選自X = l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8。因此，對(duì)于圖12a、 c、 e、 f和 i中的正方形網(wǎng)格，底層網(wǎng)格的網(wǎng)格常數(shù)a和b為a = b = 2~12jim。對(duì)于 圖12b、 d、 g、 h和j中的矩形網(wǎng)格，沿方向a的網(wǎng)格常數(shù)為2 12jim之 間，而沿方向b的網(wǎng)格常數(shù)為1 6fim之間。對(duì)于圖12k中的網(wǎng)格，網(wǎng)格 常數(shù)b位于3.5 ~ 28 fim之間，而網(wǎng)格常數(shù)a位于2 ~ 16 之間。
為了識(shí)別X和Y各自不同值的上述結(jié)構(gòu)，圖12a中所示的結(jié)構(gòu)在本說(shuō) 明書(shū)中稱為AXr,其中X和Y表示上述尺寸X和Y。因此，結(jié)構(gòu)AXF 包括具有直徑Xnm的圓形截面的突起/柱。突起排布在平行的行中，其 中每隔一行中相鄰?fù)黄鹬g的間隙尺寸為Y pm，而其余行中突起之間 的間隙尺寸為(2Y + X) nm。相鄰行的突起之間的間隙尺寸為Ynm。 相鄰行中的突起之間相互對(duì)準(zhǔn)。
相似地，圖12b中所示的結(jié)構(gòu)^L稱為BXy。因此，結(jié)構(gòu)BXy包括具 有直徑Xnm的圓形截面的突起/柱。突起排布在平行的行中，其中每隔 一行中相鄰?fù)黄鹬g的間隙尺寸為Y nm,而其余行中突起之間的間隙 尺寸為(2Y + X)nm。相鄰行中突起之間的間隙尺寸為Yfim。間隙尺 寸為(2Y + X) jim的行中突起與其各自相鄰行的突起之間間隙的中心 對(duì)準(zhǔn)。
圖12c中所示的結(jié)構(gòu)4皮稱為CXK因此，結(jié)構(gòu)CXr包括具有線性尺 寸Xjim的正方形截面的突起/柱。突起排布在平行的行中，其中正方形 的邊對(duì)準(zhǔn)行的方向，并且其中每隔一行中相鄰?fù)黄鹬g的間隙尺寸為Y Hm，而其余行中突起之間的間隙尺寸為(2Y + X) nm。相鄰行的突起 之間的間隙尺寸為Ynm。相鄰行中突起之間相互對(duì)準(zhǔn)。
圖12d中所示的結(jié)構(gòu)被稱為DXR因此，結(jié)構(gòu)DXy包括具有線性尺 寸Xjrni的正方形截面的突起/柱。突起排布在平行的行中，其中正方形 的邊對(duì)準(zhǔn)行的方向，并且其中每隔一行中相鄰?fù)黄鹬g的間隙尺寸為Y Hm，而其余行中突起之間的間隙尺寸為(2Y + X) nm。相鄰行的突起 之間的間隙尺寸為Yjim。間隙尺寸為(2Y + X) jim的行中突起與其各 自相鄰行的突起之間間隙的中心對(duì)準(zhǔn)。
圖12e中所示的結(jié)構(gòu),皮稱為EXK因此，結(jié)構(gòu)EXF包括具有直徑 X nm的圓形截面的突起/柱以及具有線性尺寸X nm的正方形截面的突 起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行為圓形突起，而其 余行為正方形突起。具有圓形突起的行內(nèi)相鄰?fù)黄鹬g的間隙尺寸為Y jim，而其余行內(nèi)正方形突起之間的間隙尺寸為(2Y + X) nm。相鄰行 的突起之間的間隙尺寸為Ynm。相鄰行中突起之間相互對(duì)準(zhǔn)。
圖12f中所示的結(jié)構(gòu)4皮稱為FXK因此，結(jié)構(gòu)FXr包括具有直徑 X fim的圓形截面的突起/柱以及具有線性尺寸X jim的正方形截面的突 起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行為圓形突起，而其 余行為正方形突起。每行內(nèi)突起之間和相鄰行之間的間隙尺寸為Ynm。 相鄰行中突起之間相互對(duì)準(zhǔn)。
圖12g中所示的結(jié)構(gòu)被稱為GXK因此，結(jié)構(gòu)GXr包括具有直徑 X nm的圓形截面的突起/柱以及具有線性尺寸X fim的正方形截面的突 起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行為圓形突起，而其 余行為正方形突起。具有圓形突起的行內(nèi)相鄰?fù)黄鹬g的間隙尺寸為Y [im，而其余行內(nèi)正方形突起之間的間隙尺寸為(2Y + X) nm。相鄰行 的突起之間的間隙尺寸為Ynm。間隙尺寸為(2Y + X) nm的4亍中正方 形突起與其各自相鄰行的圓形突起之間間隙的中心對(duì)準(zhǔn)。
圖12h中所示的結(jié)構(gòu),皮稱為HXK因此，結(jié)構(gòu)HXy包括具有直徑 X jrni的圓形截面的突起/柱以及具有線性尺寸X jim的正方形截面的突 起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行為圓形突起，而其 余行為正方形突起。每行中突起之間和相鄰行之間的間隙尺寸為Yjim。 相鄰行中突起之間相互對(duì)準(zhǔn)。正方形突起與其各自相鄰行的圓形突起之 間間隙的中心對(duì)準(zhǔn)。
圖12i中所示的結(jié)構(gòu),皮稱為IXy。因此，結(jié)構(gòu)IX.r包括具有直徑X Hm的圓形截面的突起/柱以及具有線性尺寸Xjim的正方形截面的突起/ 柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行為圓形突起，而其余行 為正方形突起。具有正方形突起的行內(nèi)相鄰?fù)黄鹬g的間隙尺寸為Y Hm，而其余行內(nèi)圓形突起之間的間隙尺寸為(2Y + X) nm。相鄰4亍的 突起之間的間隙尺寸為Ynm。相鄰行中突起之間相互對(duì)準(zhǔn)。
圖12j中所示的結(jié)構(gòu),皮稱為JXr。因此，結(jié)構(gòu)JXy包括具有直徑X jim的圓形截面的突起/柱以及具有線性尺寸Xpm的正方形截面的突起/ 柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行為圓形突起，而其余行 為正方形突起。具有正方形突起的行內(nèi)相鄰?fù)黄鹬g的間隙尺寸為Y jim，而其余行內(nèi)圓形突起之間的間隙尺寸為(2Y + X) jim。相鄰行的
突起之間的間隙尺寸為Yjim。間隙尺寸為(2Y + X) nm的行中圓形突 起與其各自相鄰行的正方形突起之間間隙的中心對(duì)準(zhǔn)。
因此，在上述實(shí)施例中，最鄰近特征之間的最小間隙尺寸為Y Jim, 而最鄰近特征之間的最小中心-中心距離為X +Ynm。
圖12k中所示的結(jié)構(gòu)被稱為結(jié)構(gòu)KAT。結(jié)構(gòu)KAT包含成組的矩形截 面的長(zhǎng)形突^/脊。該脊具有不同的長(zhǎng)度，并排布為相互平行。每組的脊排 布為形成矩形(？)，使得每組包括最長(zhǎng)的脊作為中心脊。中心脊的每側(cè)排 布有一系列逐漸變短而到中心脊的距離逐漸增加的脊。因此，矩形KAT包 括長(zhǎng)度為Xnm、 2Xnm、 3X拜、4Xnm、 3X阿、2X阿、X阿的脊 的序列。脊的寬度為Xjim。脊之間的距離為Xnm。脊的組以預(yù)定的圖案 排布，4吏得脊排成行，其中每行包括兩個(gè)交替長(zhǎng)度的脊第一種類型的行 包括長(zhǎng)度X nm和4X nm的交替的脊，第二種類型的行包括長(zhǎng)度2X 和3Xnm的交替的脊。脊的整體圖案類似于篁魚(yú)皮結(jié)構(gòu)。
下面將結(jié)合實(shí)例說(shuō)明另 一些優(yōu)選結(jié)構(gòu)。
IV.包含本發(fā)明生物相容性材料的植入物
根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于骨組織^等的醫(yī)用^物，其中 該^物的至少一部分表面的特征在于本發(fā)明的生物相容性材料，其表面 的特征在于與骨形成細(xì)胞生物相容的確定的周期性微米尺度形態(tài)結(jié)構(gòu)，并
且其形態(tài)結(jié)構(gòu)在上述n節(jié)和實(shí)施例中描述。本發(fā)明的醫(yī)用tiuv物包括牙科
^V物、整形假體/^物、脊髓^v物、骨替代物，預(yù)期其可用于治療骨
折、退行性疾病、創(chuàng)傷和癌癥。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，植入物的整個(gè)暴露表面區(qū)或用于制造植
料上構(gòu)成。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，所逸暴露表面區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)部 分作為本發(fā)明具有增強(qiáng)骨形成細(xì)胞礦化的生物相容性材料而被構(gòu)成。因此， 通過(guò)選擇性提供具有合適表面的裝置，其可以被控制，所a面的哪部分 應(yīng)該以某一方式執(zhí)4亍(例如礦化)。^v物的其它部分可以由能夠增強(qiáng)例如 軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞的生物相容性的其它類型的結(jié)構(gòu)形成，在這些細(xì)胞處 植入物將與交替的組織類型相接觸。也可以包括排斥細(xì)菌生長(zhǎng)的表面。例
如可以考慮牙科植入物。該植入物將由5種不同的表面構(gòu)成，以便滿足交 替環(huán)境的要求1.對(duì)礦化/骨形成/向內(nèi)生長(zhǎng)最佳，2.對(duì)結(jié)締組織(成纖維 細(xì)胞)最佳的生物相容性，3.對(duì)上皮(上皮細(xì)胞)最佳的生物相容性，4.排
斥細(xì)菌的表面，和最后5.對(duì)添加人工牙最佳的表面。
V.在植入物的成型的(contoured) 3D表面上合成本發(fā)明的生物相容性的 形態(tài)修飾表面的方法
一種植入物表面對(duì)骨形成細(xì)胞是生物相容的且增強(qiáng)骨形成細(xì)胞的礦 化，其可以通過(guò)許多生產(chǎn)方法制造，例如下列技術(shù)中的一種或多種
-模壓印(die imprinting):通過(guò)使用硬模(例如SiC或SiN模)可 以直接在例如^v金屬等其它石^t材料上通過(guò)壓印直接產(chǎn)生圖案。 該母才莫(master die)通常通過(guò)電子束光刻和活性離子蝕刻聯(lián)合生 產(chǎn)。已經(jīng)證明，寬度低至40nm的納米結(jié)構(gòu)的大陣列可以被印在例 如Al等軟金屬上(S. W. Pang， T. Tamamura, M. Nakao, A. Ozawa, H. Masuda, J. Vac. Sci. Technology B 16(3) (1998) 1145 )。更為具 體地，期望在壓印在其它硬質(zhì)基底如Al、 Ti、鈦合金、不銹鋼、 Ta等時(shí)在如SiC或SiN等非常硬的材料中生產(chǎn)模具圖案一一否 則該模具將會(huì)受損或甚至毀壞。當(dāng)然，模壓印也可以用于如聚合 物等較軟的材料。由于如SiC或SiN等材料難于干法蝕刻，因此 期望制造由如Cr構(gòu)成的蝕刻掩膜，而不是僅有光刻膠。該掩膜 可以下列方式生產(chǎn)通過(guò)電子束光刻在光刻膠(resist)中產(chǎn)生側(cè) 向圖案，然后通常在例如醋酸鹽等有機(jī)溶劑中顯影。這在表面留 下光刻膠圖案。通過(guò)PVD覆蓋光刻膠圖案——沉積約100 nm Cr 層，最后通過(guò)利用光刻膠去除劑溶解光刻膠而完成。硬質(zhì)模具材 料的干法蝕刻可以在活性離子蝕刻系統(tǒng)中實(shí)施。結(jié)構(gòu)的深度通過(guò) 離子蝕刻的時(shí)間控制。最后Cr掩膜可以在硝酸鈰的水溶液中除 去。現(xiàn)在，硬質(zhì)模已經(jīng)準(zhǔn)備好用于壓印入表面合成生物相容的形 態(tài)修飾表面。通過(guò)水壓所述模具進(jìn)入表面的選定區(qū)域，該模可以 在生物材料的選定區(qū)域內(nèi)壓印微米和納米圖案。施加的壓力通常 為幾噸，持續(xù)10~30秒?？梢酝ㄟ^(guò)使模尺寸的一些區(qū)域連續(xù)圖 案化而在幾個(gè)區(qū)域形成圖案。模具尺寸通常為10x10 1111112到40 x40 mm2。這種微米或納米壓印法非常適于在由例如Ti、鈦合 金、鉭或不銹鋼生產(chǎn)的成型3D植入物的選定區(qū)域形成圖案。但 是其當(dāng)然也可用于例如聚合物材料/涂層等硬度較低的材料。
-通過(guò)滾動(dòng)模具壓印。該方法基本與模壓印相同，但是此處的模具不 是平的，而通常是圓柱。該壓模輥通過(guò)上述用于模壓印的光刻或電
子束光刻/活性離子蝕刻形成微米和納米結(jié)構(gòu)。該裝置需要凈皮改進(jìn)， 以便考慮曲面?，F(xiàn)在該模壓輥可以通過(guò)7JC壓該模輥到植入物表面上 而壓到生物材料的選定區(qū)域并滾動(dòng)，從而壓印微米和/或納米結(jié)構(gòu)。
此處的^物材料也可以是，但不必是例如Ti、 Ti合金、鉭或不銹 鋼等硬材料，以便該方法也適用于例如聚合物等。
-通過(guò)膠體光刻形成圖案此處，可以通過(guò)沉積膠體顆粒(例如聚苯 乙烯或蛋白質(zhì)鐵蛋白)形成組裝為短程有序圖案的納米圖案表面。 這些顆粒例如可用作制備柱的蝕刻掩膜、制^^表面突起的形態(tài)才莫 板或例如納米金屬簇的沉積(例如通過(guò)鐵蛋白的金屬中心)。
-通過(guò)超短激光脈沖激光圖案化該技術(shù)可用于高精度圖案化。特別 地，燒蝕工藝的高度非線性導(dǎo)致對(duì)材料去除的明確閾值，而且這已 經(jīng)用于證實(shí)形成甚至在衍射極限以下的結(jié)構(gòu)(P. P. Pronko, S. K. Dutta， J. Squier， J. V. Rudd， D. Du， G. Mou函Optical Communication 114， (1995) 106 )。
-通過(guò)超短激光脈沖的激光圖案化也可與石英球的預(yù)沉積聯(lián)合使用 (K. Vestentoft, J. A. Olesen, B. H. Christensen, P. Balling: Appl. Phys A 80, (2005) 493 )，以形成納米級(jí)孔的大陣列。更具體地，石 英球?qū)映练e在表面上，通常但是不必然形成緊密堆積的陣列。通過(guò) 超短脈沖的未聚焦激光束掃描具有石英球的表面，可以產(chǎn)生大面積 的平行結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗銮虺洚?dāng)聚焦激光束的單個(gè)透鏡。
-激光掃描束干涉光刻這種低成本方法可用于在大表面區(qū)域上制造 周期性和準(zhǔn)周期性和空間相干的圖案。該方法利用兩個(gè)或多個(gè)相干 的平面波陣面之間的干涉(S. Kuiper, H. van Wolferen, G. van Rijn， Journal of Micromechanics and Microengineering 11(1)， (2001) 33 )。
VI. —種用于培養(yǎng)組織或細(xì)胞的裝置，其包含具有微尺度表面結(jié)構(gòu)的暴露表面。
圖30示意性顯示具有微尺度結(jié)構(gòu)暴露表面的組織培一的截面視 圖。該皿301包含向上開(kāi)口的接收器，其具有底部303和側(cè)壁302。在使 用中，上表面304被暴露于細(xì)胞培養(yǎng)或組織，從而提供用于培養(yǎng)的微環(huán)境。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，暴露表面304具有微尺度的形態(tài)結(jié)構(gòu)，其被 選擇為促進(jìn)此處所述的預(yù)定細(xì)胞功能。通過(guò)熱壓印或注射成型或者通過(guò)本
領(lǐng)域已知和/或本文所述的任何其它合適方法，可以用例如聚合物來(lái)大量制 造這種表面，所述聚合物例如聚苯乙烯，不同類型的聚已酸內(nèi)酯，聚(甲 基丙烯酸甲酯，硅酮包括聚二甲基硅氧烷，聚(甲基丙烯酸羥乙酯)，聚(甲
基丙烯酸乙酯)，聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)，聚乙烯，聚碳酸酯，聚乙 烯醇，基于透明質(zhì)酸的聚合物，聚(氧化乙烯)，聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)， 甲基丙烯酰氧乙基磷itja堿，mr-IT85， mr-I7030，聚(雙(三氟乙氧基) 膦腈)，天然聚合物包括改性多糖，例如淀粉、纖維素和殼聚糖，和上述物 質(zhì)的混合物和共聚物。表面304可以是底部303的上表面或置于該亞底部 303上的獨(dú)立元件例如圓盤的上表面。例如，這種組織培養(yǎng)JDV瓶或選擇用 于支持未分化狀態(tài)下胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的任何表面可用于大量生長(zhǎng)胚胎干細(xì) 胞，其在隨后發(fā)育中可被誘導(dǎo)分化成期望的細(xì)胞類型。 一旦分化成特定細(xì) 胞類型，這些特定細(xì)胞類型可用于藥物篩選和/或細(xì)胞替代治療。
表面304也可以分離的組織培養(yǎng)塑料的形式來(lái)提供，其已經(jīng)被修飾 成在其表面上顯示選定結(jié)構(gòu)或這些結(jié)構(gòu)的藍(lán)圖。例如，分離的組織培養(yǎng)塑 料可以可取出方式插入培養(yǎng)亞301中。在這方面，術(shù)語(yǔ)組織培養(yǎng)塑料意思 包括可用于產(chǎn)生能夠用于體外細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)的表面的任何聚合物/ 金屬涂層/材料。
實(shí)施例
實(shí)施例1
包含60個(gè)測(cè)試區(qū)域的4英寸BSSA晶片的制造
厚度為525士25微米的單面拋光的硅晶片(4英寸)為生物相容材 料的制造提供了基層。該晶片是一種電阻率為1-20歐姆厘米的n-型晶 片。根據(jù)以下方案，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的光刻技術(shù)和在SF6/02中放電的活性離子 蝕刻，將微米尺寸的圖案印在硅晶片的拋光面上。
1 、所述晶片用緩沖的氫氟酸(BHF: BHF是一種溶液，其中濃HF( 49% )、 水、和緩沖鹽NH4F的比例約為1:6:4)預(yù)蝕刻30秒，然后在N2氣流 下干燥，以及
2、 然后在該晶片上旋涂一層1.5微米厚的光刻膠AZ5214, Hoechst Celanese Corporation, NJ, US(其化學(xué)組成可參見(jiàn)由Hoechst Celanese Corporation提供的材料安全數(shù)據(jù)表(MSDS))，并在約卯。C下預(yù)烘 焙120秒，以及
3、 涂覆有光刻膠的晶片在AL6-2型EVC光刻機(jī)中通過(guò)合適的掩膜用紫 外光(UV)曝光5秒，顯影50-60秒，然后在120°C下后烘焙1分鐘， 以及
4、 然后涂覆有光刻膠的晶片用BHF短暫地蝕刻約30秒而被圖案化，接 著在約0.30微米/分鐘的速率下接受活性離子蝕刻處理(RIE)，用丙 酮?jiǎng)冸x光刻膠，隨后RCA清洗。該RCA清洗過(guò)程有三個(gè)依次應(yīng)用的 主要步驟用5:1:1的H20:H202:NH4OH溶液(SC1)去除不溶性有 機(jī)污染物；用稀釋的50:1的H20:HF溶液去除二氧化硅薄層，在該薄 層中可能積累了作為(I)之結(jié)果的金屬污染物；以及用6:1:1的 H20:H202:HC1溶液(SC2 )去除離子或重金屬原子污染物。
5、 圖案化的晶片然后通過(guò)干法氧化具有20納米Si02層而鈍化，其在 1000°C下熱生長(zhǎng)15分鐘。
6、 通過(guò)濺射沉積在圖案化晶片上沉積250納米的鉭層。
圖3顯示如上制備的一個(gè)晶片的頂視圖。該晶片包括60個(gè)尺寸為 10mmxl0mm的測(cè)試區(qū)域，其中每個(gè)區(qū)域具有根據(jù)實(shí)施例1制備的特定 側(cè)向形態(tài)。每個(gè)晶片包括4個(gè)具有平坦表面的對(duì)照測(cè)試區(qū)域2，以及14 種不同側(cè)向形態(tài)中每一種的4個(gè)復(fù)本。根據(jù)這些定義的參數(shù)制備了一系 列晶片，其中側(cè)向形態(tài)的深度分別限定為0.07微米、0.25微米、0.60 微米、1.20微米、1.60微米。
每種特定的側(cè)向結(jié)構(gòu)重復(fù)4次。圖3中，每個(gè)測(cè)試區(qū)域都^t標(biāo)記 以指示其形態(tài)表面結(jié)構(gòu)，其中所述標(biāo)記指示如下結(jié)構(gòu)
"BL，，無(wú)結(jié)構(gòu)，即基本上平坦的表面。
"AX/Y":圖4所示的線結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包括寬度為X (微米)的槽41 和寬度為Y (微米)的脊42。因此，圖4的線結(jié)構(gòu)具有僅一維的微米 尺度特征。在實(shí)施例1中，區(qū)域A2/2包括具有寬度2微米的槽和寬度 2微米的脊的線結(jié)構(gòu)，區(qū)域A4/4包括具有寬度4微米的槽和寬度4微 米的脊的線結(jié)構(gòu)，區(qū)域A10/10包括具有寬度10微米的槽和寬度10微 米的脊的線結(jié)構(gòu)，區(qū)域A4/2包括具有寬度4微米的槽和寬度2微米的 脊的線結(jié)構(gòu)，以及區(qū)域A10/2包括具有寬度10微米的槽和寬度2微米 的脊的線結(jié)構(gòu)。
"BX/Y":圖5所示的方形孔結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包括尺寸為X (微米)xx
(微米)的方形孑U凹陷51，且節(jié)距為X+Y，即脊52的網(wǎng)的寬度為Y。 因此，圖5的結(jié)構(gòu)在測(cè)試區(qū)域的表面平面中的兩個(gè)維度上都具有微米 尺度特征。在實(shí)施例1中，區(qū)域B4/4包括尺寸為4微米x4微米和8 微米節(jié)距的方形孔，區(qū)域B10/4包括尺寸為10微米xl0微米和14微 米節(jié)距的方形孔，以及區(qū)域B15/4包括尺寸為15微米xl5微米和19 微米節(jié)距的方形孔。
"KX/Y":圖6所示的包含4皮脊分隔開(kāi)的矩形孔/凹陷的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu) 包括被寬度為X (微米)的脊62分隔開(kāi)的尺寸為X (微米)xY (微 米)的矩形孔61。因此，區(qū)域K10/110包括被寬度為10微米的脊分 隔開(kāi)的尺寸為10孩i米xll0孩i:米的矩形孔。
"DX/Y":圖7所示的包含突^/柱的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包括具有尺寸為X
(微米)xx (微米)的方形橫截面和節(jié)距X+Y的突^/柱71。因此， 區(qū)域D2/4包括具有柱尺寸為2微米x2微米的方形柱結(jié)構(gòu)且節(jié)距為6 微米，以及區(qū)域D2/10包括具有柱尺寸為2微米x2微米的方形柱結(jié)構(gòu) 且節(jié)距為12微米。
"CX":圖8所示的方形孔/柱結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)外，見(jiàn)4,盤，具有孔81和 突^/柱82,并且二者均是尺寸為X (微米)xx (微米)的方形形狀。 因此，區(qū)域CIO包括方形的孔/柱結(jié)構(gòu)，且孔和柱的尺寸均為10孩4:米xl0 微米；區(qū)域C40包括方形的孑L/柱結(jié)構(gòu)，且孔和柱的尺寸均為40微米x40 微米；以及區(qū)域C90包括方形的孔/柱結(jié)構(gòu)，且孔和柱的尺寸均為卯 孩史米x卯微米。
應(yīng)當(dāng)理解，上述制備方法也可以用于具有其他形式和尺寸的測(cè)試 區(qū)域以及其他結(jié)構(gòu)類型的晶片上。同樣的生產(chǎn)方法可用于各種不同的晶 片，其中測(cè)試區(qū)域的布局和具體表面結(jié)構(gòu)可通過(guò)晶片曝光時(shí)所用的掩膜 來(lái)確定。
實(shí)施例2
篩選BSSA晶片，鑒定用于小鼠成骨細(xì)胞礦化的生物相容性材料
許多晶片結(jié)合實(shí)施例1中所述的方法來(lái)生產(chǎn)。每個(gè)晶片都置于P15 皿中(NUNC, Biotech line)并先后用70。/。乙醇和PBS ( 6.8g NaCl， 0.43g KH2P04， 0.978g Na2HP04*2H20溶于1升雙蒸水中， pH7.4 )清
洗。MC3T3國(guó)E1鼠成骨細(xì)胞系(Sudo， H et al. 1983， J Cell Biol 96(1):191-98)的細(xì)胞以濃度20000細(xì)胞/cm2接種于所述晶片。細(xì)胞在 常規(guī)培養(yǎng)基(a-最小基本培養(yǎng)基[a-MEMl， 10。/。胎牛血清[FCS，100U/ml 青霉素，和100微克/毫升鏈霉素(Gibco， Invitrogen提供))中培養(yǎng)4 天。細(xì)胞在增濕的培養(yǎng)箱中維持(5%(:02/95%空氣氣氛，37。C),隨后 在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入284 fiM抗壞血酸(Wako Chemicals，DE )和10mM P-甘油磷酸(Sigma-Aldrich， DK)。每周兩次更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞3 周。
(a) 體外礦化培養(yǎng)3周后，通過(guò)用PBS清洗晶片和用70。/。乙醇在-20。C 固定晶片上的細(xì)胞l小時(shí)來(lái)測(cè)試每個(gè)培養(yǎng)皿中晶片上的礦化程度。然 后細(xì)胞用雙蒸水漂洗，接著用pH調(diào)節(jié)至4.2的40mM茜素紅S
(Sigma-Aldrich ， DK)室溫(約20-25。C )染色10分鐘。晶片用H20 進(jìn)行后漂洗并在PBS中孵育15分鐘以減少非特異性染色。
(b) 可與鈣結(jié)合的萏素紅微弱地染色了所有的測(cè)試區(qū)域，但強(qiáng)烈地染色了 具有微結(jié)構(gòu)D2/4的測(cè)試區(qū)域，這已被幾個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中晶片上的細(xì)胞生 長(zhǎng)所確認(rèn)。D2/4具有二維的周期性結(jié)構(gòu)，具有尺寸為2微米x2微米和 6 #:米節(jié)距的方形柱(如圖7所示)。
(c) 通過(guò)比較具有不同側(cè)向形態(tài)深度的晶片上的礦化，揭示出細(xì)胞培養(yǎng)中 礦化過(guò)程具有顯著的豎向尺寸依賴性。與其他測(cè)試區(qū)域相比，在測(cè)試 區(qū)域D2/4上增強(qiáng)了的礦化僅當(dāng)D2/4的側(cè)向形態(tài)的豎向尺寸大于0.6 微米時(shí)被檢測(cè)到。在具有豎向尺寸為1.2微米和1.6微米的測(cè)試區(qū)域顯 示了礦化。
圖9 ~ 11顯示在BSSA晶片測(cè)試區(qū)域上骨發(fā)生MC3T3細(xì)胞的篩選 結(jié)果圖9a顯示玻璃上的MC3T3細(xì)胞，而圖9b顯示BSSA晶片的參 考表面上的MC3T3細(xì)胞。圖10顯示具有"D2/4"表面結(jié)構(gòu)(IW600 nm ) 的測(cè)試區(qū)域上的MC3T3細(xì)胞。圖11顯示具有"D2/10"表面結(jié)構(gòu)(1600 nm)的測(cè)試區(qū)域上的MC3T3細(xì)胞。接種細(xì)胞后48小時(shí)，圖9 ~ 11中 顯示的MC3T3細(xì)胞被固定并用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色。鬼筆環(huán)肽 標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白纖維?？梢钥闯?，細(xì)胞的細(xì)胞骨架受表面形態(tài)的 不同影響。對(duì)于鉭和金屬上的參考結(jié)構(gòu)，可以看出長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白纖維跨 越整個(gè)細(xì)胞直徑。對(duì)非礦化結(jié)構(gòu)D2/10觀察到類似的結(jié)果，盡管該結(jié)構(gòu) 的單個(gè)點(diǎn)偶爾被肌動(dòng)蛋白纖維增強(qiáng)。對(duì)于礦化結(jié)構(gòu)D2/4,其圖案明顯不
同。細(xì)胞的形狀受細(xì)胞表面上圖案的影響，似乎細(xì)胞將點(diǎn)與點(diǎn)連接起來(lái)， 而且由于實(shí)際上肌動(dòng)蛋白骨架看起來(lái)包裹在單個(gè)點(diǎn)周圍，所述結(jié)構(gòu)觀察
得非常清楚。
細(xì)胞和植入物表面之間的接觸點(diǎn)是粘著斑的點(diǎn)，在此細(xì)胞蛋白如整
聯(lián)蛋白與沉積于表面上的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中的肽序列如RGD相接觸。、整
白(vinculin)、樁蛋白(paxillin)和粘著斑激酶(FAK)相結(jié)合。這些蛋 白質(zhì)通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞應(yīng)答，其被預(yù)期影響細(xì)胞介導(dǎo)的 礦化過(guò)程。預(yù)期肌動(dòng)蛋白骨架的細(xì)胞內(nèi)分布影響礦化的另一種途徑是通過(guò) 細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。已知肌動(dòng)蛋白骨架確定例如纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋 白。據(jù)觀察，纖連蛋白沿肌動(dòng)蛋白纖維沉積(例如見(jiàn)Molecular Biology of the Cell, Fourth Edition, by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter, fig. 19-54 )。因此， 其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白例如I型膠原蛋白有可能受到肌動(dòng)蛋白骨架的影響。I
型膠原蛋白已經(jīng)與骨和成骨細(xì)胞的礦化高度相關(guān)。膠原纖維內(nèi)的溝槽祐:認(rèn) 為充當(dāng)羥基磷灰石結(jié)晶初始種子的成核位點(diǎn)。我們預(yù)期植入物表面形態(tài)之 內(nèi)的變化將導(dǎo)致細(xì)胞骨架內(nèi)的變化，從而影響上述過(guò)程。
實(shí)施例3
鑒定用于骨發(fā)生MG3T3細(xì)胞礦化的生物相容性材料
制備包含測(cè)試方塊的BSSA晶片，所述測(cè)試方塊具有選自圖12 中所鑒定結(jié)構(gòu)或從圖12所鑒定結(jié)構(gòu)中修飾而來(lái)結(jié)構(gòu)中的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
晶片包含具有圖12a k所示形態(tài)結(jié)構(gòu)或其修飾結(jié)構(gòu)的測(cè)試區(qū)域， 在其上接種MC3T3細(xì)胞、培養(yǎng)，然后利用茜素紅測(cè)試進(jìn)行礦化染色， 如實(shí)施例2中所述，然后基于目視檢查評(píng)價(jià)礦化的水平。所發(fā)現(xiàn)尤其有 利于礦化并因此顯示對(duì)骨形成細(xì)胞生物相容的表面結(jié)構(gòu)的圖像示于圖 13。圖13a ~g中每個(gè)顯示一張表，其中每行對(duì)應(yīng)于一種所述已鑒定結(jié) 構(gòu)。第一列(最左邊)包括各自結(jié)構(gòu)的識(shí)別碼，第二列顯示具有通過(guò)茜 素紅礦化染色的細(xì)胞的晶片上測(cè)試區(qū)域的各自一部分，而第三行(最右 邊)顯示不含細(xì)胞的相應(yīng)測(cè)試區(qū)域。在顯示包含細(xì)胞區(qū)域的圖像中顯示 出各測(cè)試方塊的邊緣，以允許和非結(jié)構(gòu)化表面進(jìn)行比較。所述已鑒定的 表面結(jié)構(gòu)為(下列結(jié)構(gòu)通過(guò)根據(jù)圖13的代碼來(lái)識(shí)別)
B4.1:只包含圖12b和13b中第二行所示圓的結(jié)構(gòu)。B4.1包括每 隔一行中直徑X = 4 jirn和節(jié)距X+Y = 5 pm的圓柱結(jié)構(gòu)(即Y - 1 jim )。 其余行包括直徑X-4fim和節(jié)距2 (X+Y) -lOjim的圓柱結(jié)構(gòu)。行之 間節(jié)距為5 nm。節(jié)距10 fim的行中的柱與節(jié)距為5 nm的行中的柱之間 間隙的中心對(duì)準(zhǔn)。
C4.1:只包含圖12c和13a中第一行所示正方形的結(jié)構(gòu)。C4.1包 括每隔一行中柱尺寸4 fim x 4 nm (即X = 4 pm)和節(jié)距X+Y = 5 fim的 方柱結(jié)構(gòu)(即Y = 1 nm )。其余行包括柱尺寸4 jim x 4 pm和節(jié)距10 的方柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為5 jim。所有行的正方形也按列對(duì)準(zhǔn)，即相鄰 行的正方形位于彼此上方。
C4.2:只包含圖12c和13c中第三行所示正方形的結(jié)構(gòu)。C4.2包 括每隔一行中柱尺寸4 nm x 4 nm (即X = 4 pm)和節(jié)距X+Y = 6 的 方柱結(jié)構(gòu)(即Y = 2 nm )。其余行包括柱尺寸4 x 4 jim和節(jié)距12 的方柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為6 nm。所有行的正方形按列對(duì)準(zhǔn)，即相鄰行 的正方形位于彼此上方。
E6.1:包含圖12e和13a中第四行所示相對(duì)量為1:2的正方形和 圓的結(jié)構(gòu)。E6.1包括每隔一行中柱尺寸6nmx6nm和節(jié)距14 fim的方 柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括直徑6fim和節(jié)距7ftm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié) if巨為7 fim (即X = 6 fim， Y = 1 )。《亍內(nèi)的柱位于彼此上方。
E6.2:包含圖12e和13b中第一行所示相對(duì)量為1:2的正方形和 圓的結(jié)構(gòu)。E6.2包括每隔一行中柱尺寸6nmx6nm和節(jié)距16fim的方 柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括直徑6nm和節(jié)距8nm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié) 多巨為8jim (即X-6nm， Y = 2 pm )。 4亍內(nèi)的柱位于彼》匕上方。
E6.4:包含圖12e和13e中第四行所示相對(duì)量為1:2的正方形和 圓的結(jié)構(gòu)。E6.4包括每隔一行中柱尺寸6 nm x 6 fun和節(jié)距20 fim的方 柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括直徑6nm和節(jié)距10jtm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間 節(jié)距為lOfim (即X-6jim， Y = 4 jim )。行內(nèi)的柱位于彼此上方。
E6.6:包含圖12e和13f中第一行所示相對(duì)量為1:2的正方形和圓 的結(jié)構(gòu)。E6.6包括每隔一行中柱尺寸6 nm x 6 nm和節(jié)距24 jim的方柱 結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括直徑6ftm和節(jié)距12nm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)
距為12 nm (即X = 6 nm， Y = 6 jim )。 4亍內(nèi)的柱位于彼此上方。
F4.2:包含圖12f和13d中第一行所示相對(duì)量為1:1的正方形和圓 的結(jié)構(gòu)。F4.2包括每隔一行中柱尺寸4 nmx4 和節(jié)距6 jim的方柱 結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括直徑4nm和節(jié)距6nm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距 為6nm(即X-4nm, Y = 2 nm )。 4亍內(nèi)的柱位于彼此上方。
F4.4:包含圖12f和13d中第二行所示相對(duì)量為1:1的正方形和圓 的結(jié)構(gòu)。F4.4包括每隔一行中柱尺寸4 nm x 4 nm和節(jié)距8 nm的方柱 結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括直徑化m和節(jié)距8nm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距 為8nm(即X-4nm， Y = 4 nm )。 -f亍內(nèi)的柱位于彼》匕上方。
G4.1:包含圖12g和13d中第三行所示相對(duì)量為1:2的正方形和 圓的結(jié)構(gòu)。G4.1包括每隔一行中柱尺寸4 nm x 4 nm和節(jié)距10 (im的具 有修飾/粗化邊緣的方柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括直徑4jim和節(jié)距5 fim 的具有修飾/粗化邊緣的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為5 pm (即X = 4 nm, Y =lnm)。行內(nèi)的正方形位于相互之間，即對(duì)準(zhǔn)相鄰行的圓柱之間的間 隙。
H4.4:源自圖12h的結(jié)構(gòu)且包含具有相對(duì)量為1:1的修飾/粗化邊 緣正方形和圓的結(jié)構(gòu)，如圖13f第四行中所示。H4.4包括每隔一行中柱 尺寸4 nmx4 jim和節(jié)距8 pm的正方柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一4亍包括直徑 4nm和節(jié)距8nm (即X-4nm， Y = 4 fim )的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為8 Hm。行內(nèi)的柱位于相互之間。在該實(shí)例中，具有粗化邊緣的正方形具 有基本正方形的截面，其中正方形的邊緣由曲線而非直線形成，從而產(chǎn) 生具有褶邊的正方形。
14.4:源自圖12i的結(jié)構(gòu)且包含具有相對(duì)量為2:1的修飾/粗化邊緣 正方形和圓的結(jié)構(gòu)，如圖13g第二行中所示。14.4包括每隔一行中柱尺 寸4 nm x 4 pm和節(jié)距8 fim的正方柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括柱直徑4 Hm和節(jié)距16nm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為8fim。行內(nèi)的柱位于彼此上 方。
J6.2:包含圖12j和13e中第一行所示相對(duì)量為2:1的正方形和圓 的結(jié)構(gòu)。J6.2包括每隔一行中柱尺寸6 fim x 6 nm和節(jié)距8 jim的方柱 結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括柱直徑6pm和節(jié)距16nm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間
節(jié)距為8pm (即X-6jim， Y = 2nm)。行內(nèi)的柱位于彼此之間。
D2.1'(修改)圖13b第三行中顯示的結(jié)構(gòu)，其源自圖12d中的 結(jié)構(gòu)，只包含正方形但是相比圖12d中所示結(jié)構(gòu)具有45。旋轉(zhuǎn)。D2.1' 每隔一行包括方柱結(jié)構(gòu)，其中正方形具有彎曲/圓化的邊緣，并具有柱 尺寸2 nm x 2 nm和節(jié)距3 nm。另夕卜每隔一4亍包括柱尺寸2 x 2 和節(jié)距6 nm (即X = 2 nm， Y = 1 jim )的方柱結(jié)構(gòu)。；f亍間節(jié)距為3 nm。 行被移位以使正方形位于彼此之間。
D2.2'(修改)圖13a第三行中顯示的結(jié)構(gòu)，其源自圖12d的結(jié) 構(gòu)，只包含正方形但是相比圖12d中所示結(jié)構(gòu)具有45。旋轉(zhuǎn)。D2.2，每隔 一行包括柱尺寸2 nm x 2 nm和節(jié)距4 pm的具有粗化邊沿的方柱結(jié)構(gòu)。 另外每隔一行包括柱尺寸2 nmx2 jim和節(jié)距8 的方柱結(jié)構(gòu)。行間 節(jié)距為4 nm (即X = 2 nm, Y = 2 nm )。行被移位以4吏正方形位于彼此 之間。
E2.1'(修改)圖13c第四行中顯示的結(jié)構(gòu)，其源自圖12e的結(jié)構(gòu)， 包含相對(duì)量為1:2的正方形和圓但是相比圖12e中所示結(jié)構(gòu)其正方形具 有45°旋轉(zhuǎn)。E2.1'包括每隔一行中柱尺寸2 nm x 2 nm和節(jié)距6 nm的方 柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括柱直徑2jim和節(jié)距3nm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間 節(jié)距為3 nm (即X = 2 nm， Y = 1 nm )。行被移位以使柱位于彼此之間。
F2.2'(修改)圖13c第二行中顯示的結(jié)構(gòu)，其源自圖12f的結(jié)構(gòu)， 包含相對(duì)量為1:1的正方形和圓但是相比圖12f中所示結(jié)構(gòu)其正方形具 有45°旋轉(zhuǎn)。F2.2'包括每隔一行中柱尺寸2 nm x 2 nm和節(jié)距4 nm的方 柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括柱直徑2jim和節(jié)距4nm的圓柱結(jié)構(gòu)。行間 節(jié)距為4 jim (即X = 2 nm， Y = 2 )。行被移位以使柱位于彼此上方。
H4.2'(修改)圖13f第三行中顯示的結(jié)構(gòu)，其源自圖12h的結(jié) 構(gòu)，包含相對(duì)量為1:1的正方形和圓但是相比圖12h中所示結(jié)構(gòu)具有修 改為具有像花形狀的正方形。H4.2，包括每隔一行中柱尺寸4 jim x 4 fim 和節(jié)距6 jim的花柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括柱直徑4 nm和節(jié)距6 nm 的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為6nm (即X-4jim, Y = 2 pm )。行-故移位以 使柱位于彼此之間。
14.2，(修改)圖13g第一行中顯示的結(jié)構(gòu)，其源自圖12i的結(jié)構(gòu)，
包含相對(duì)量為2:1的正方形和圓但是相比圖12i中所示結(jié)構(gòu)具有修改為 具有像花形狀的正方形。14.2'包括每隔一行中柱尺寸4 Jim x 4 jim和節(jié) 距6 nm的花形柱結(jié)構(gòu)。另外每隔一行包括柱直徑4 jim和節(jié)距12 jim 的圓柱結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為6nm (即X-4jim, Y = 2 )。行被移位以 使柱位于彼此之上。
源自C6.1:圖13e第三行中顯示的結(jié)構(gòu)，其源自圖12c的結(jié)構(gòu)， 包含初始源自圖12c中所示結(jié)構(gòu)的水平和豎直脊的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包括直 徑在3 6nm之間和最大節(jié)距為14nm (即X-6jim, Y - 1 nm )的交 叉線。所述脊具有包括由多個(gè)邊/角形成的側(cè)向突起的側(cè)面。
源自D4.1:圖13a第二行中顯示的結(jié)構(gòu)，其包含初始源自圖12d 中所示結(jié)構(gòu)的正方形和線。該結(jié)構(gòu)包括每隔一行中柱尺寸4 nmx4 nm 和節(jié)距10 jim的方柱結(jié)構(gòu)。如圖13a第二行中所示該正方形看來(lái)具有的 切角。另外每隔一行包括具有多個(gè)角和1~4 jim寬度的線/脊結(jié)構(gòu)。行 間節(jié)距為5 nm (即X = 4 nm， Y = 1 )。
源自H4.1:圖13f第二行中顯示的結(jié)構(gòu)，其包含初始源自圖12h 中所示結(jié)構(gòu)的圓和線/脊。該結(jié)構(gòu)包括每隔一行中柱直徑4 nm和節(jié)距5 Hm的圓柱結(jié)構(gòu)。如圖13f第二行中所示該圓看來(lái)具有修飾/粗化的邊。 另外每隔一行包括具有多個(gè)角和l 4nm直徑的線結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為5 Hm (即X = 4拜，Y = 1阿)。
源自H6.1:圖13b第四行中顯示的結(jié)構(gòu)，其包含初始源自圖12h 中所示H結(jié)構(gòu)的圓和線。該結(jié)構(gòu)包括每隔一行中柱直徑6 nm和節(jié)距7 Hm的圓柱結(jié)構(gòu)。如圖13b第四行中所示該圓看來(lái)具有粗化邊沿。另外 每隔一行包括具有多個(gè)角和直徑3~6 nm的線結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為7 nm (即X-6fim， Y-l拜)。
源自16.1:圖13d第四行中顯示的結(jié)構(gòu)，其包含初始源自圖12i 中所示結(jié)構(gòu)的圓和線。該結(jié)構(gòu)包括每隔一行中柱直徑6 nm和節(jié)距14 nm 的圓柱結(jié)構(gòu)。如圖13d第四行中所示該圓看來(lái)具有粗糙邊沿。另外每隔 一行包括具有多個(gè)角和4~6 nm直徑的線結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為7 jim (即 X = 6 jim, Y = 1 pm )。
源自J6.1:圖13g第三行中顯示的結(jié)構(gòu)，其包含初始源自圖12j中所示結(jié)構(gòu)的圓和線。該結(jié)構(gòu)包括每隔一行中柱直徑6jim和節(jié)距14 nm 的圓柱結(jié)構(gòu)。如圖13g第三行中所示該圓看來(lái)具有粗糙邊沿。另外每隔 一行包括具有多個(gè)角和4~6 fim直徑的線結(jié)構(gòu)。行間節(jié)距為7 nm (即 X = 6jim， Y = 1 fim )。
源自K:圖13c第一行中顯示的結(jié)構(gòu)，其包含每組6個(gè)線/矩形的 組，其中每組線被排布為形成矩形。該結(jié)構(gòu)源自圖12k中所示的結(jié)構(gòu)。 該矩形包括尺寸x、 2x、 3x、 3x、 2x、 x的線，其中線性尺寸為x~ 1.8 jim， 寬度為~ 1 jim。線之間的距離為~ 1 nm。行被移位以使矩形位于彼此之 間。
源自K':圖13e第二行中顯示的結(jié)構(gòu)，其包含每組7個(gè)線/矩形的 組，其中每組線被排布為形成矩形。該結(jié)構(gòu)源自圖12k中所示的結(jié)構(gòu)。 該矩形包括尺寸x、 3x、 5x、 7x、 5x、 3x、 x的線，其中線性尺寸為x 2.8jim，寬度為 lnm。線之間的距離為 lnm。行被移位以使矩形位 于彼jHi之間。
總之，從所有這些數(shù)據(jù)可以看出，與參照結(jié)構(gòu)(平面結(jié)構(gòu))相比， 所述給定結(jié)構(gòu)使染色強(qiáng)度高度增加。特別地，礦化看起來(lái)位于角內(nèi)和結(jié) 構(gòu)周圍附近。
圖16顯示BSSA晶片一部分^L圖的兩個(gè)實(shí)例，其顯示出四個(gè)測(cè)試 方塊的一部分。構(gòu)建具有4x4 mm測(cè)試方塊的四英寸晶片。圖16a ~ b 分別顯示四個(gè)這種測(cè)試方塊的一部分。MC3T3細(xì)胞被接種到晶片上， 并如實(shí)施例1和2中所述^i秀導(dǎo)礦化。然后，如對(duì)10 mm晶片所述， 晶片利用茜素紅對(duì)Ca染色。測(cè)試方塊的表面結(jié)構(gòu)如下測(cè)試方塊1601: E6.1(即圖12e中所示的結(jié)構(gòu)，X = 6, Y = 1);測(cè)試方塊1602: E6.2 (即 圖12e中所示的結(jié)構(gòu)，X = 6， Y = 2);測(cè)試方塊1603: F2.4(即圖12f 中所示的結(jié)構(gòu)，X = 2， Y = 4);測(cè)試方塊1604:空白(沒(méi)有結(jié)構(gòu))；測(cè) 試方塊1605: G4.1 (即圖12g中所示的結(jié)構(gòu)，X = 4， Y=l);測(cè)試方塊 1606: G4.2 (即圖12g中所示的結(jié)構(gòu)，X = 4, Y = 2);測(cè)試方塊1607: H4.6(即圖12h中所示的結(jié)構(gòu)，X = 4， Y = 6);測(cè)試方塊1608: H6.1 (即圖12h中所示的結(jié)構(gòu)，X = 6， Y = l)。
這兩個(gè)實(shí)施例清楚表明不同結(jié)構(gòu)的礦化能力的差異。首先，可以看出礦化染色受結(jié)構(gòu)邊界限制，證明了所述結(jié)構(gòu)的重要性。其次，觀察
到染色強(qiáng)度的差異，例如1604和1607的礦化能力不及例如1601和1608 濃。
實(shí)施例4:結(jié)合礦化誘導(dǎo)基因的基因誘導(dǎo)測(cè)試
下面參照?qǐng)D14所述的基因誘導(dǎo)測(cè)試可與礦化誘導(dǎo)基因結(jié)合使用。 基因誘導(dǎo)測(cè)試的這個(gè)實(shí)例使用源自敲入小鼠的原代細(xì)胞。對(duì)于活細(xì)胞， 使用EGFP的報(bào)告基因系統(tǒng)或其它表達(dá)熒光蛋白的報(bào)告基因系統(tǒng)可用 于構(gòu)建報(bào)告基因構(gòu)建體，以代替天然存在的基因。在ES細(xì)胞中同源重 組以后，產(chǎn)生敲入小鼠，例如在K. Wertz和EM.Fuchtbauer，DevDyn 1998 Jun;212(2):229-41中"Dmd(mdx-beta geo): a new allele for the mouse dystrophin gene"中所述。從這些小鼠中分離相應(yīng)的原代細(xì)胞。 當(dāng)目標(biāo)基因被誘導(dǎo)時(shí)，源自這些小鼠的細(xì)胞表達(dá)EGFP構(gòu)建體。圖14 顯示作為骨誘導(dǎo)表面篩選實(shí)例的BSSA晶片的4個(gè)測(cè)試區(qū)域。測(cè)試區(qū)域 1501包含骨誘導(dǎo)表面，而測(cè)試區(qū)域1502包含非骨誘導(dǎo)表面?？梢岳斫?， 其它多種報(bào)告基因系統(tǒng)可用于此處。 一個(gè)實(shí)例是表達(dá)(5半乳糖苷酶的敲 入小鼠。利用這種表達(dá)系統(tǒng)存在超過(guò)6000種不同敲入小鼠的集合，例 如下述Hansen J， Floss T, Van Sloun P, Fuchtbauer EM, Vauti F, Arnold HH, Schnutgen F, Wurst W， von Melchner H, Ruiz P， "A large-scale, gene-driven mutagenesis approach for the functional analysis of the mouse genome", Proc Natl Acad Sci U S A， 2003 Aug 19;100(17):9918-22. Epub 2003 Aug 6。
實(shí)施例5:異位骨形成
異位(ectopic)骨形成可按如下分析在6mmx6mm的生物相 容性材料結(jié)構(gòu)D2/4上在包括加入50微克/ml抗壞血酸和10 mM |3-甘油 褲酸酯的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)500,000個(gè)MC3T3-E1細(xì)胞/cm2。培養(yǎng)1周 后，將所述生物相容性材料結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到用于異位骨形成的皮下小鼠模型 中。在小鼠背側(cè)面皮下制作兩個(gè)嚢。在手術(shù)期間，用異氟烷麻醉動(dòng)物， 在每個(gè)嚢中放入一個(gè)結(jié)構(gòu)并用外科縫合封閉。小鼠保留8周后斷頸處死。 取出所述結(jié)構(gòu)，塑料包埋入聚甲基丙烯酸曱酯(PMMA)中，切片，并 染色，用于骨檢測(cè)(例如堿性品紅/亮綠或萏素紅S )。 實(shí)施例6:綿羊中骨形成測(cè)試
下文所述的體內(nèi)綿羊模型可用于測(cè)試生物相容性材料誘導(dǎo)骨形成
/向內(nèi)生長(zhǎng)的能力
在6 mm x 6 mm硅晶片方塊基底上產(chǎn)生相關(guān)生物相容性材料和對(duì) 照如平面鉭的樣品。樣品分別命名為"活性"和"對(duì)照"，并成對(duì)應(yīng)用 以降低由動(dòng)物差異引起的結(jié)果偏差。樣品用生物相容性膠水(例如 Loctite431)膠合在樣品保持器上得到植入物。
用于綿羊體內(nèi)骨形成測(cè)試的樣品保持器在圖15中示出。特別地， 圖15a顯示樣品保持器的底部視圖，圖15b顯示樣品保持器的側(cè)視圖， 圖15c顯示樣品保持器的頂視圖，圖15d顯示樣品保持器的透視圖，而 圖15e顯示樣品保持器的截面視圖。所述樣品保持器包含方形凹槽 1501，適于接收其生物相容性表面被暴露的樣品。該方形凹槽位于圓柱 件1502的底面中。樣品保持器的頂面中包含螺紋孔1503，其有助于將 樣品保持器放入骨內(nèi)或從骨中取出。
手術(shù)前，給纟帛羊2.5mlRompunvet.和2ml阿托品。20分鐘后， 用15ml異丙酚麻醉動(dòng)物。在每個(gè)內(nèi)側(cè)股骨髁中鉆一個(gè)深6mm和直徑 llmm的孔。這在生物相容性表面和骨之間留下0.5 mm的間隙，用于 檢測(cè)骨的向內(nèi)生長(zhǎng)。將植入物壓入孔內(nèi)，并用外科縫合封閉切口。綿羊 在四周后處死。取出植入物并包埋入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中。 骨向內(nèi)生長(zhǎng)的程度通過(guò)nCT-掃描進(jìn)行初步檢查，然后切開(kāi)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn) 組織學(xué)檢查骨容積和骨朝向植入物的向內(nèi)生長(zhǎng)。
實(shí)施例7
小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞
ES細(xì)胞(KH2 cells )被接種到BSSA晶片上并擴(kuò)增一代。細(xì)胞以 1.3 5xl()6細(xì)胞/pl0培養(yǎng)皿的密度接種。培養(yǎng)條件為5% C02、 90%空 氣濕度和37。C。細(xì)胞在補(bǔ)充有15% FCS、 2mM谷氨酰胺、50 U/ml青 霉素、50 jig/ml鏈霉素、非必需氨基酸、100 nM p-巰基乙醇和核苷的 DMEM中生長(zhǎng)。此外，ES細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加1000 U/ml的白血病 抑制性生長(zhǎng)因子(LIF)，以維持ES細(xì)胞的未分化表型。細(xì)胞染色其堿
性磷酸酶(AP)活性(藍(lán))。未分化小鼠ES細(xì)胞中AP的水平高。傳 統(tǒng)上ES細(xì)胞生長(zhǎng)在飼養(yǎng)層細(xì)胞上，并且每?jī)商靷鞔淮?。這種情況下 細(xì)胞傳代三天然后固定，但是不用飼養(yǎng)層。
圖17顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其表明與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比，選定結(jié)構(gòu)如何增加 細(xì)胞培養(yǎng)中特征性胚胎干細(xì)胞集落的數(shù)目。圖17a顯示結(jié)構(gòu)D1.2(如圖 12d中所述)上染色ES的照片，圖17b顯示對(duì)照表面(沒(méi)有結(jié)構(gòu))上 染色ES的照片，而圖17c顯示結(jié)構(gòu)H1.2 (如圖12h中所述)上染色 ES的照片。
與對(duì)照表面相比，選定結(jié)構(gòu)D1.2和H1.2增加了特征性ES細(xì)胞 集落的數(shù)量(它們看起來(lái)被高AP活性引起的強(qiáng)染色包圍)。
圖18顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其表明與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比，類似篁魚(yú)皮的選定 結(jié)構(gòu)如何指導(dǎo)分化。圖18a和c顯示結(jié)構(gòu)K2 (如圖12k中所述)上的 ES,而圖18b和d顯示對(duì)照表面(沒(méi)有結(jié)構(gòu))上的ES。在圖18a和b 中，沒(méi)有加入LIF，而在圖18c和d中加入LIF。獲得LIF的細(xì)胞具有 一天的LIF，接著兩天使用不含LIF的培養(yǎng)基。因此，與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比， 結(jié)構(gòu)K2指導(dǎo)分化。還可看出，結(jié)構(gòu)化表面上的細(xì)胞密度高于未結(jié)構(gòu)化 表面上的細(xì)胞密度。
圖19顯示定量結(jié)果，其表明與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比，選定尺寸范圍內(nèi)的 結(jié)構(gòu)如何增加細(xì)胞培養(yǎng)中特征性胚胎干細(xì)胞集落的數(shù)目。特別地，圖19 顯示X和Y值不同的一系列結(jié)構(gòu)GXy (如圖12g所述)的定量結(jié)果。 從圖19可以看出，直徑l微米和間隙尺寸1~6微米之間、更具體地2~ 6微米之間的結(jié)構(gòu)(用附圖標(biāo)記l卯l表示)增加所形成ES集落的數(shù)目。 標(biāo)記為0,0 (附圖標(biāo)記1902)的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)未結(jié)構(gòu)化的參照。
圖20顯示定量結(jié)果，其表明與對(duì)照結(jié)構(gòu)相比， 一些選定結(jié)構(gòu)如何 增加細(xì)胞培養(yǎng)中特征性胚胎干細(xì)胞集落的數(shù)目。特別地，圖20顯示結(jié) 構(gòu)D1.2 ( 2001 )、 E1.2 ( 2002 )上、未結(jié)構(gòu)化表面(2003 )上、結(jié)構(gòu)F4.1 (2004)上和結(jié)構(gòu)K5 (2005)上ES細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果。因此，許多獨(dú)立 實(shí)驗(yàn)表明，相比未結(jié)構(gòu)化表面(2003 )以及相比其它結(jié)構(gòu)(2004、 2005), 一些結(jié)構(gòu)(D1.2、 E1.2)增加ES集落的形成。集落數(shù)已經(jīng)根據(jù)未結(jié)構(gòu) 化參考表面進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖21顯示定量結(jié)果，其表明一些結(jié)構(gòu)如何在胚胎干細(xì)胞集落的表 型外觀方面(更圓更小)提高胚胎干細(xì)胞集落的質(zhì)量，而另一些結(jié)構(gòu)則 引導(dǎo)胚胎干細(xì)胞走向分化途徑。數(shù)據(jù)已經(jīng)根據(jù)對(duì)照結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)化。ES細(xì) 胞在晶片上用LIF生長(zhǎng)三天，但不進(jìn)行傳代。
總之，上述結(jié)果表明， 一些結(jié)構(gòu)在不包含飼養(yǎng)細(xì)胞層條件下(飼 養(yǎng)層非依賴的)支持未分化小鼠ES細(xì)胞的生長(zhǎng)。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)D1.2、 E1.2、 H1.2有這種作用。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有約l微米特征直徑并且 相鄰/最近鄰特征之間最小間隙在2 ~ 6微米之間的結(jié)構(gòu)一般具有這種作 用。另一方面，與復(fù)雜K結(jié)構(gòu)相似，其它類型的結(jié)構(gòu)驅(qū)使ES細(xì)胞走向 分化途徑(例如K2)。
實(shí)施例8
胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)元分化
小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞KH2利用朝向谷氨酸能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化 的方案分化為神經(jīng)元，所述方案《務(wù)改自(Bibd 2004, Nat. Neurosci. 7(9), p 1003 ): ES細(xì)胞在白血病抑制性因子(LIF)存在下擴(kuò)增后，將細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到不含LIF的非粘附皿中以誘導(dǎo)胚體(EB)的形成。四天后加入 視黃酸，EB再繼續(xù)生長(zhǎng)四天。然后解離EB，將單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到在N2培 養(yǎng)基(DMEM:F12 (1:1 )，添加N2補(bǔ)充劑)中用多聚-D-賴氨酸包^皮的 BSSA晶片上。兩天后，培養(yǎng)基被換成含B27補(bǔ)充劑的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 細(xì)胞再生長(zhǎng)3到14天。圖22~26顯示細(xì)胞照片，其中使細(xì)胞在B27培 養(yǎng)基中分化14天，固定并分別用抗p-微管蛋白III的抗體(神經(jīng)元標(biāo) 志物，紅色)(圖22a、 23a、 24a、 25a、 26a)和DAPI (染色細(xì)胞核， 藍(lán)色)(圖22b、 23b、 24b、 25b、 26b )。
圖22顯示對(duì)照表面(沒(méi)有結(jié)構(gòu))上的細(xì)胞。圖23顯示結(jié)構(gòu)A1.4 上(如圖12a中所述)的細(xì)胞。圖24顯示結(jié)構(gòu)A2.1上(如圖12a中所 述)的細(xì)胞。圖25顯示結(jié)構(gòu)B1.4上(如圖12b中所述)的細(xì)胞。圖26 顯示結(jié)構(gòu)B2.1上(如圖12b中所述)的細(xì)胞。
大部分細(xì)胞對(duì)(5-微管蛋白亞型III呈陽(yáng)性，這表明它們是神經(jīng)元 (例如見(jiàn)圖22)。在多數(shù)結(jié)構(gòu)和對(duì)照上具有不被抗p-微管蛋白III染色 或染色很弱的高密度細(xì)胞的區(qū)域，這表明它們不是神經(jīng)元(圖22、圖 24和圖26)。特別地，圖22顯示，在未結(jié)構(gòu)化的表面上，細(xì)胞密度高， 但是有很多細(xì)胞"空斑"，這些細(xì)胞不被抗p-微管蛋白III染色(圖22b 中黑箭頭所指)或染色很弱(圖22b中黑箭頭所指)。
與此相反，在一些結(jié)構(gòu)上(例如A1.4和B1.4,分別見(jiàn)圖23和圖 25)，沒(méi)有看見(jiàn)這種非神經(jīng)元細(xì)胞的空斑，而更高比例的細(xì)胞已經(jīng)變成 神經(jīng)元。
為定量神經(jīng)元分化的比例，測(cè)定染紅色和染藍(lán)色的面積，并且用 染紅色的面積除以染藍(lán)色的面積，從而獲得神經(jīng)元分化的量度。不同結(jié) 構(gòu)種類和不同結(jié)構(gòu)尺寸的這些測(cè)量結(jié)果示于圖27中。對(duì)于從A到J系 列的所有結(jié)構(gòu)(如圖12a j所示)，具有尺寸1，4 (附圖標(biāo)記2701 )和 1，6 (附圖標(biāo)記2702)和某種程度上1,2 (附圖標(biāo)記2703)的結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn) 較高的神經(jīng)元分化比例，其表明特征/柱的尺寸和節(jié)距都重要。在這些 測(cè)試結(jié)構(gòu)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約1微米的特征截面尺寸和4~6微米之間的相 鄰/最鄰近特征之間最小特征間節(jié)距尤其有利。當(dāng)這些結(jié)果根據(jù)結(jié)構(gòu)尺 寸匯集時(shí)，如圖28所示，可以看出，神經(jīng)元分化顯著受尺寸為1，4 (附 圖標(biāo)記2801 )和1,6 (附圖標(biāo)記2802 )的結(jié)構(gòu)刺激。與之相比，K結(jié)構(gòu) (篁魚(yú)皮)比包括對(duì)照表面在內(nèi)的所有其它結(jié)構(gòu)(匯集所有K結(jié)構(gòu))具 有明顯更低比例的神經(jīng)元細(xì)胞(p-微管蛋白III陽(yáng)性細(xì)胞)。
實(shí)施例9
神經(jīng)突的指導(dǎo)生長(zhǎng)
在BSSA晶片上建立了源自18日齡大鼠胚胎皮層的原代神經(jīng)元培 養(yǎng)物，并且體外7天后，細(xì)胞被固定并用神經(jīng)元特異性抗P-微管蛋白III 的抗體染色。
圖29顯示如圖12所示不同結(jié)構(gòu)上用抗-p-微管蛋白III抗體染色 的原代神經(jīng)元培養(yǎng)物的照片。特別地，圖29a顯示結(jié)構(gòu)C1.2,圖29b 顯示結(jié)構(gòu)C6.4,圖29c顯示對(duì)照表面(無(wú)結(jié)構(gòu))，圖29d顯示結(jié)構(gòu)C4.2, 而圖29e顯示結(jié)構(gòu)F1.2。
從圖29可以看出，一些結(jié)構(gòu)清楚地引導(dǎo)神經(jīng)突在確定方向上向外 生長(zhǎng)。也發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)的尺寸傾向于比實(shí)際的結(jié)構(gòu)圖案更重要。 一般來(lái)說(shuō)，
結(jié)構(gòu)引導(dǎo)神經(jīng)突的程度可用以下表示1，1<1,2>1,4; 2,1<2，2~2,4; 4,2~4，4; 6，2<6,4>6，6。與之相比，具有大柱和小間距或者具有小柱 和大間距的結(jié)構(gòu)沒(méi)有引導(dǎo)向外生長(zhǎng)的作用。
實(shí)施例10
人間充質(zhì)干細(xì)胞在BSSA晶片F(xiàn)H001上的礦化
從后上髂棘中抽取骨髓樣品。用Lymphoprep⑧的梯度離心分離低 密度的單個(gè)核細(xì)胞?；旌显醋?個(gè)供體的純化細(xì)胞，并在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng) 2代，隨后第3代以18，000細(xì)胞/cn^的濃度接種到BSSA晶片上。第二 天加入新鮮培養(yǎng)基(不含酚紅的(MEM) [Earles，含有10%胎牛血清 [FCS、100 U/ml青霉素和100微克/ml鏈霉素)。 一周后加入含有284 HM抗壞血酸、10 mM p-甘油磷酸酯和10 nM地塞米松的培養(yǎng)基以刺激 細(xì)胞。培養(yǎng)基每周更換一次。4"2周后晶片用茜素紅染色。
下列結(jié)構(gòu)顯示礦化增加(按范圍分為1~4,強(qiáng)度遞減)
范圍1: F4.2; E6.2;
范圍2: Hl.l; Dl.l; B2.1。
范圍3: 11.1; Gl.l; Kl; K2; K4; K5; K6。
范圍4: K3、 K7、 K8、 J2.1。
因此， 一般來(lái)說(shuō)，具有不同截面幾何形狀之特征的結(jié)構(gòu)(如EXP， FJVT.F; HXF; LY.F; JXF)和/或其中格點(diǎn)沒(méi)有全部填有突起而形成突 起包圍的六邊形區(qū)域的結(jié)構(gòu)(如BJVT.r; DXF; GXP， JXlO和/或"鯊 魚(yú)皮"結(jié)構(gòu)(K結(jié)構(gòu))和/或特征截面尺寸約為lnm (X=l)且相鄰特 征之間中心間距約2~3 nm (X + Y在2和3之間)的結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種生物相容性材料，其中所述生物相容性材料的至少一部分表面的特點(diǎn)在于包含排布成規(guī)則圖案之多個(gè)特征的納米或微米尺度形態(tài)結(jié)構(gòu)，其中選擇所述結(jié)構(gòu)以促進(jìn)預(yù)定的細(xì)胞功能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的生物相容性材料，其中每個(gè)特征具有約0.1 jim 至約20jim之間、約l 10nm之間、約10 ~ 20 nm之間的至少一個(gè) 側(cè)向尺寸(X)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的生物相容性材料，其中所述側(cè)向尺寸(X)選自 下列區(qū)間之一約1 nm ~ 2 jim之間；約2 jim ~ 4 jim之間；約4 nm ~ 6jim之間；約6nm 8fim之間；約8jim 10nm之間；約10 ~ 12 jim之間；約12 ~ 14 fim之間；約14 ~ 16 ^im之間；約16 ~ 18 nm 之間；約18~20 nm之間。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中每個(gè)特征具 有截面區(qū)，使得從所述截面區(qū)內(nèi)任一點(diǎn)到所述截面區(qū)邊緣的最短距離 不超過(guò)10 jim。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中一個(gè)或多個(gè) 特征的所述側(cè)向截面具有由周界和/或幾何圖形所限定的形狀，所述形 狀選自以下之一圓環(huán)、圓形、星形、正方形、矩形、六邊形和多邊 形或其組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中一個(gè)或多個(gè) 特征具有一般正方形的截面。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的生物相容性材料，其中一個(gè)或多個(gè)特征具有一般 圓形的截面，而一個(gè)或多個(gè)特征具有一般正方形的截面。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中任何特征和 其最鄰近特征之間最大間隙的側(cè)向尺寸(d;Y)在以下至少一個(gè)區(qū)間 內(nèi)約0.5 nm ~ 1.0 fim之間，約1 fim ~ 2 pm之間，約2之間，約4[im-6nm之間，約8nm 10nm之間，約10 jim ~ 12nm之間，約12 nm~ 14 nm之間，約14 fim ~ 16 之間。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述材料表 面的特點(diǎn)在于周期性^t米尺度形態(tài)結(jié)構(gòu)，其沿任何側(cè)向尺寸的側(cè)向節(jié) 3巨選自以下至少一個(gè)區(qū)間約lnm 2nm之間；約2 fim ~ 4 jim之 間，約4 nm ~ 6 nm之間，約6 nm ~ 10 nm之間，約10 ~ 16 nm 之間，約16nm 20nm之間，約20 pm ~ 24 jim之間。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1 ~9中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述形態(tài)結(jié) 構(gòu)的每個(gè)所述特征具有選自以下至少一個(gè)區(qū)間的豎向高t深度尺寸 約1 nm ~ 0.1 pm之間，約0.1 jim ~ 0.5 jim之間，約0.07 pm ~ 1.6 jim 之間，約1.6 nm~3.0 nm之間，約3 jun ~ 10 jim之間。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述周期 性形態(tài)結(jié)構(gòu)的特征的中心位于網(wǎng)格常數(shù)為a和b的2維矩形網(wǎng)格的格 點(diǎn)上，并且其中a. 所述網(wǎng)格為正方形網(wǎng)格，其中每個(gè)方向的所述網(wǎng)格常數(shù)(a = b) 在2 ~ 12 ,之間，或b. 所述網(wǎng)格為矩形，其沿第一方向的網(wǎng)格常數(shù)(a )在2 ~ 12 pm 之間，而沿第二方向的網(wǎng)格常數(shù)(b)在l 6nm之間，約6 Hm ~ 10 nm之間，約10 nm ~ 16 jim之間，約16 nm ~ 20 nm 之間，約20nm~24 nm之間。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述表面 的至少 一部分包#皮有鉭和/或鈦。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1 ~ 12中任一項(xiàng)的生物相容性材料，還包含選自以 下的吸附化合物多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、 糖蛋白、脂蛋白、DNA、 RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合 物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的生物相容性材料，其中所述生長(zhǎng)激素選自 BMP、 EGF樣、TGF-(5。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中至少一些 所述特征具有帶有納米尺度形態(tài)結(jié)構(gòu)的頂表面。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述結(jié)構(gòu) 包含排布成規(guī)則圖案的多個(gè)突起，其中所述突起具有最小截面直徑不 大于2jim、優(yōu)選不大于1.5jim的截面，并且其中所述截面的直徑大 于10 nm， t匕如大于50 nm， t匕:fi口大于100 nm, t匕:ft口在0.1 jim和2 jim 之間，比如在0.5 jim和2 nm之間，比如在0.1 jim和1.5 fim之間， 比如在0.5 nm和1.5 nm之間。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16或17的生物相容性材料，其中所述截面的最大 截面直4圣不大于2nm，優(yōu)選在0.01 nm和2 fim之間，優(yōu)選在0.1 [im 和2 jim之間，優(yōu)選在0.5 jim和2 jim之間，比如0.1 Jim和1.5間，比:ft口 0.5 nm和1.5 jim之間。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16~18中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述突起 位于規(guī)則二維網(wǎng)格的格點(diǎn)上，其中沿至少一個(gè)維度在相鄰格點(diǎn)之間的 距離不大于7nm。
19. 根據(jù)權(quán)利要求19的生物相容性材料，其中沿至少一個(gè)維度在相鄰 格點(diǎn)之間的距離小于4 nm，比如在0.01 nm和4 nm之間，優(yōu)選0.1 nm 和4 之間,Jt優(yōu)選0.5 nm和3.5 pm之間，例如1 [im和3 jim之間。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的生物相容性材料，其中沿所述兩個(gè)維度 在相鄰格點(diǎn)之間的距離不大于4 nm，優(yōu)選在0.01 nm和4 jim之間， 優(yōu)選0.1 [im和4 fim之間，更優(yōu)選0.5 jim和3.5 nm之間,比如1 jim 和3阿之間。
21. 根據(jù)權(quán)利要求16~21中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述結(jié)構(gòu)包括具有至少兩種不同截面幾何形狀的突起。
22. 根據(jù)權(quán)利要求22的生物相容性材料，其中所述截面幾何形狀不同 的突起以交替模式排布成二維規(guī)則網(wǎng)格。
23. 根據(jù)權(quán)利要求16~23中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述結(jié)構(gòu) 包括具有不同截面區(qū)域的突起。
24. 根據(jù)權(quán)利要求24的生物相容性材料，其中所述突起為具有不同長(zhǎng) 度的長(zhǎng)形脊。
25. 根據(jù)權(quán)利要求25的生物相容性材料,其中每個(gè)所述長(zhǎng)形脊具有0.1 jim和2 nm之間、優(yōu)選0.5 jim和1.5 jim之間的寬度。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25或26的生物相容性材料，其中相鄰長(zhǎng)形脊之間 的3巨離小于2 fim,優(yōu)選在0.1 jim和2 fim之間，優(yōu)選在0.5 Jim和 1.5 nm之間。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25~27中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述長(zhǎng)形 脊各自的長(zhǎng)度小于20 nm，優(yōu)選小于10 nm，比如在0.5 和10 nm 之間。
28. 根據(jù)權(quán)利要求16~28中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述突起 位于二維規(guī)則網(wǎng)格的格點(diǎn)上，使得只有一部分格點(diǎn)被突M蓋。
29. 根據(jù)權(quán)利要求16~29中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述突起 排布成平行的行中，其中相鄰?fù)黄鹬g的中心-中心距離在相鄰行中 不同。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中選擇所述 結(jié)構(gòu)以促進(jìn)骨形成細(xì)胞的礦化。
31. 根據(jù)權(quán)利要求31的生物相容性材料，其中所述周期性形態(tài)結(jié)構(gòu)的 特征具有結(jié)構(gòu)(D2/4)，其包含a.方柱的二維周期性結(jié)構(gòu)，每個(gè)方柱具有約2nm的側(cè)向尺寸(X)，所述方柱具有約6nm的節(jié)距(X + Y)，和 b.每個(gè)柱具有大于0.6 nm的豎向尺寸(H )。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中選擇所述 結(jié)構(gòu)以促進(jìn)未分化胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中選擇所述 結(jié)構(gòu)以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)元分化。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33或34的生物相容性材料，其中任一個(gè)所述特征 的至少一個(gè)側(cè)向尺寸在約0.5 nm和約2 pm之間，優(yōu)選約0.8 nm和約 1.2nm之間，更優(yōu)選約0.9nm和約1.1 nm之間，例如約1 nm。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33~35中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述特征 排布成規(guī)則圖案，其相鄰特征之間的最小間隙尺寸在約1 jim和約7 jrni之間，優(yōu)選約2jim和約6 之間。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34~36中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中所述特征 包括規(guī)則排布的突起，以產(chǎn)生各自的多個(gè)突起排布為包圍無(wú)突起的 相應(yīng)區(qū)域的圖案，所述無(wú)突起的區(qū)域具有大于所述特征間最小間隙 尺寸、優(yōu)選大于所述特征間最小間隙尺寸2倍的線性尺寸。
37. 根據(jù)權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中選擇所述 結(jié)構(gòu)以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的分化。
38. 根據(jù)權(quán)利要求38的生物相容性材料，其中所述結(jié)構(gòu)包括排布成規(guī) 則圖案的多個(gè)長(zhǎng)形脊。
39. 根據(jù)權(quán)利要求39的生物相容性材料，其中所述長(zhǎng)形脊具有不同的 長(zhǎng)度，并排布成規(guī)則圖案。
40. 根據(jù)權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)的生物相容性材料，其中選擇所述 結(jié)構(gòu)以促進(jìn)源自原代神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)突沿限定方向向外生長(zhǎng)。
41. 根據(jù)權(quán)利要求41的生物相容性材料，其中所述特征排布成規(guī)則圖案，其相鄰特征之間的最小間隙尺寸在約lnm和約5nm之間，優(yōu)選 約2nm和約4jim之間。
42. 根據(jù)權(quán)利要求42的生物相容性材料，其中任一個(gè)所述特征的至少 一個(gè)側(cè)向尺寸在約0.5 jim和約1.5 [im之間，而相鄰特征之間的最小 間隙尺寸在約1 fim和約6 jim之間。
43. 根據(jù)權(quán)利要求43的生物相容性材料，其中任一個(gè)所述特征的至少 一個(gè)側(cè)向尺寸在約1.5 [im和約2.5 nm之間，而相鄰特征之間的最小 間隙尺寸在約1 jim和約4 jim之間。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43的生物相容性材料，其中任一個(gè)所述特征的至少 一個(gè)側(cè)向尺寸在約3.5 nm和約4.5 nm之間，而相鄰特征之間的最小 間隙尺寸在約1.5 nm和約4.5 nm之間。
45. 根據(jù)權(quán)利要求43的生物相容性材料，其中任一個(gè)所述特征的至少 一個(gè)側(cè)向尺寸在約5.5 Jim和約6.5 nm之間，而相鄰特征之間的最小 間隙尺寸在約2 nm和約6 jim之間。
46. —種用于培養(yǎng)細(xì)胞或組織培養(yǎng)物的裝置，所述裝置包括在^f吏用中 與細(xì)胞或組織培養(yǎng)物接觸的暴露表面，其中所述暴露表面由根據(jù)權(quán)利 要求1 ~ 46中任一項(xiàng)的生物相容性材料制成。
47. —種用于制造醫(yī)用裝置的印模或掩模，所述醫(yī)用裝置至少部分由 生物相容性材料制造，所述印模適于將權(quán)利要求1 ~ 46中任一項(xiàng)所定 義的形態(tài)表面結(jié)構(gòu)壓印或賦予入所述生物相容性材料的表面。
48. —種模具，用于生產(chǎn)具有如權(quán)利要求1~46中任一項(xiàng)所定義之表 面結(jié)構(gòu)的生物相容性材料。
49. 一種培養(yǎng)細(xì)胞或組織的方法，所述方法包括使細(xì)胞或組織接觸根 據(jù)權(quán)利要求1 ~46中任一項(xiàng)的生物相容性材料。
50. —種用于骨組織^的醫(yī)用植入物，其包含表面，其中至少一部 分所述表面由如權(quán)利要求1 ~ 32中任一項(xiàng)所限定的生物相容性材料來(lái)限定。
51. 根據(jù)權(quán)利要求51的醫(yī)用M物，還包含選自以下的吸附化合物 多肽、碳7K化合物、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、 DNA、 RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物。
52. 根據(jù)權(quán)利要求52的醫(yī)用植入物，其中所述生長(zhǎng)激素選自BMP、 EGF樣、TGF誦p。
53. 根據(jù)權(quán)利要求51~53中任一項(xiàng)的醫(yī)用^物，其中所述^物為 牙科^物。
54. 根據(jù)權(quán)利要求51~53中任一項(xiàng)的醫(yī)用^物，其中所述^JV物為 整形^yV物。
55. 根據(jù)權(quán)利要求51~55中任一項(xiàng)的醫(yī)用植入物，其用于人或動(dòng)物的 外科治療。
56. 根據(jù)權(quán)利要求54的醫(yī)用#^物，其用于人或動(dòng)物牙病的治療。
57. 根據(jù)權(quán)利要求55之醫(yī)用植入物的用途，其用于人或動(dòng)物的整形疾 病的治療。
58. —種用于制造與骨形成細(xì)胞生物相容的醫(yī)用植入物的生物相容性 涂料，其中所述生物相容性涂料包含根據(jù)權(quán)利要求1 ~32中任一項(xiàng)的 生物相容性材料。
59. 根據(jù)權(quán)利要求1~32中任一項(xiàng)的生物相容性材料在制備醫(yī)用^JV 物中的用途。
60. —種促進(jìn)骨形成細(xì)胞礦化的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸 根據(jù)權(quán)利要求1 ~32中任一項(xiàng)的生物相容性材料。
61. —種促進(jìn)未分化胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括使所述細(xì) 胞接觸根據(jù)權(quán)利要求33 ~ 37中任一項(xiàng)的生物相容性材料。
62. —種促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)元分化的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸根據(jù)權(quán)利要求34 ~ 37中任一項(xiàng)的生物相容性材料。
63. —種促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸 根據(jù)權(quán)利要求38~40中任一項(xiàng)的生物相容性材料。
64. —種促進(jìn)源自原代神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)突沿限定方向向外生長(zhǎng)的方 法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸根據(jù)權(quán)利要求41 ~ 46中任一項(xiàng)的生 物相容性材料。
全文摘要
一種生物相容性材料，其中該生物相容性材料的至少一部分表面的特征在于包含多種特征的微米或納米尺度形態(tài)結(jié)構(gòu)，其中選擇該結(jié)構(gòu)以促進(jìn)在細(xì)胞或組織培養(yǎng)中體內(nèi)或離體的預(yù)定細(xì)胞功能。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101193666SQ200680020564
公開(kāi)日2008年6月4日 申請(qǐng)日期2006年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者弗萊明·貝森巴赫, 拉爾斯·克朗貝特·安德森, 洛特·馬克特, 特里內(nèi)·埃爾凱·拉森·克羅瓦托, 珍妮特·霍夫曼·弗里?！ぶ焖固厣? 芬恩·斯科·彼得森, 莫恩斯·呂特高·杜赫, 莫藤·福斯 申請(qǐng)人:奧胡斯大學(xué)