專利名稱：利用懸浮培養(yǎng)葡萄細(xì)胞生產(chǎn)¹³C標(biāo)記反式白藜蘆醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體地說是一種通過添加1V標(biāo)記前體生產(chǎn)1V標(biāo)記反式白藜蘆醇的方法。
背景技術(shù)：
反式白藜蘆醇(trans-resveratrol)是一種類黃酮類多酚化合物，化學(xué)名為3，5,4'-三羥基-反-二苯代乙烯)。天然的白藜蘆醇存在于葡萄皮、花生及傳統(tǒng)中藥虎杖等植物體中，它屬于一種植物抗毒素，在惡劣環(huán)境或是植物受到霉菌感染時(shí)產(chǎn)生(M. Jang,L. Cai, G. Udeani, K. Slowing, C. Thomas, C. Beecher, H. Fong, N. Farnsworth, A. Kinghorn,R. Mehta, Cancer chemopreventive activity of resveratrol, anatural productderived from grapes, Science, 1997，275 :218)。大量研究表明，反式白藜蘆醇能夠阻止低密度脂蛋白的氧化，具有抗菌、抗脂質(zhì)過氧化、防治心臟病、抗癌、抗血小板凝集與血管松弛、降低血脂和抗誘變等多種藥理作用，被確認(rèn)為抗腫瘤劑和治療心血管疾病的有效成分(Donnez, D.，et al.，Bioproduction of resveratrol and stilbene derivativesby plant cells and microorganisms. Trends in biotechnology,2009.27 (12)p. 706-713.)。隨著反式白藜蘆醇藥理作用的闡明和研究，反式白藜蘆醇正成為人們研究和開發(fā)的熱點(diǎn)，在1990年到2000年的十年間共報(bào)道有170多篇白藜蘆醇的研究工作，而在2000年到2002年的兩年時(shí)間里白藜蘆醇的研究文獻(xiàn)驟然上升到238篇(P. Jeandet,A. C. Douillet-Breuil, R. Bessis, S. Debord, M. Sbaghi, M. Adrian, Phytoalexins fromthe Vitaceae :Biosynthesis, Phytoalexin Gene Expression in Transgenic Plants,Antifungal Activity, and Metabolism, Journal of Agriculture and Food Chemistry,2002,50 :2731-2741)。而同位素11標(biāo)記反式白藜蘆醇作為研究反式白藜蘆醇在人和動(dòng)物中代謝吸收的一個(gè)重要工具，其重要性越來越受到人們的關(guān)注。目前，市場上并沒有專門供應(yīng)"C標(biāo)記反式白藜蘆醇的公司，國外一些反式白藜蘆醇藥代動(dòng)力學(xué)研究機(jī)構(gòu)中的"C標(biāo)記反式白藜蘆醇的應(yīng)用也主要來源于化學(xué)合成。但是，化學(xué)合成除了造價(jià)昂貴之外，其生產(chǎn)過程毒性較大也成為制約了這種方式生產(chǎn)的1V標(biāo)記反式白藜蘆醇在臨床研究中的應(yīng)用。葡萄細(xì)胞培養(yǎng)作為生產(chǎn)"C標(biāo)記反式白藜蘆醇的替代方法已受到關(guān)注(Krisa，S.，et al.，Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures :methyl jasmonateinduction and 13C biolabeling. J. Nat. Prod, 1999. 62 (12) :p. 1688-1690 ；Aumont, V.,et al. ， Production of highly C_13_labeled polyphenols in Vitis vinifera cellbioreactor cultures. Journal of Biotechnology,2004. 109(3) :p.287—294)。目前國際上通過誘導(dǎo)劑及吸附劑聯(lián)合誘導(dǎo)調(diào)控同時(shí)添加"C標(biāo)記前體來高產(chǎn)量生產(chǎn)13C標(biāo)記反式白藜蘆醇的方法還未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用葡萄(Vitis vinifera)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，以一種或多種誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)并與吸附劑添加相結(jié)合，同時(shí)添加1Y標(biāo)記前體的聯(lián)合調(diào)控手段來生產(chǎn)"C標(biāo)記反式白藜蘆醇的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為將葡萄細(xì)胞置于液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為50 200g/L濕重，在細(xì)胞接種時(shí)每升培養(yǎng)基中加入50 200g的無菌吸附劑；在細(xì)胞指數(shù)生長初期，于每升培養(yǎng)基中加入濃度分別為5 1000 μ M的誘導(dǎo)劑，同時(shí)添加"C標(biāo)記前體。所述誘導(dǎo)劑為非生物誘導(dǎo)劑，所述前體為"C標(biāo)記苯丙氨酸或酪氨酸。所述非生物誘導(dǎo)劑為硝酸銀、水楊酸或茉莉酸及其衍生物，所述前體為"C標(biāo)記苯
丙氨酸或酪氨酸。葡萄細(xì)胞的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為20 30°C，暗培養(yǎng)；培養(yǎng)周期為5 20天， 每隔5 10天傳代一次；所述細(xì)胞指數(shù)生長初期是指細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后的第2 6天， 即兩種誘導(dǎo)子及前體的添加時(shí)間。所述吸附劑為經(jīng)處理對白藜蘆醇有較強(qiáng)吸附能力并對細(xì)胞無毒的多孔材料，如各種大孔吸附樹脂。葡萄細(xì)胞的液體培養(yǎng)基組成為于B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0. 1 0. 4mg/L激動(dòng)素， 0. 05 0.3萘乙酸，0. 1 lg/L酶解酪蛋白及10 40g/L蔗糖，pH值為5. 5 6. 5。本發(fā)明方法原理在添加多種誘導(dǎo)劑的同時(shí)添加特定種類和濃度的吸附劑能顯著提高反式白藜蘆醇產(chǎn)量，同時(shí)添加1V標(biāo)記前體可使得部分同位素標(biāo)記前體轉(zhuǎn)化為％標(biāo)記反式白藜蘆醇，其主要原理有以下四方面1、誘導(dǎo)劑能有效刺激植物細(xì)胞次生代謝能力， 促進(jìn)白藜蘆醇生物合成生產(chǎn)；2、多種誘導(dǎo)劑能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)共同促進(jìn)白藜蘆醇生物合成生產(chǎn)；3、通過特定吸附劑的加入使細(xì)胞中的白藜蘆醇苷以白藜蘆醇的形式外泌到細(xì)胞外，從而合成了價(jià)格昂貴的白藜蘆醇并解除了產(chǎn)物的反饋抑制，避免了白藜蘆醇苷存在于胞內(nèi)對細(xì)胞生長的傷害及對進(jìn)一步生產(chǎn)的阻礙，同時(shí)也避免了白藜蘆醇苷在胞內(nèi)的降解；4、由于標(biāo)記前體為反式白藜蘆醇生物合成步驟中必須的底物，因此1V標(biāo)記前體的添加可以使得生產(chǎn)的部分反式白藜蘆醇被標(biāo)記。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種誘導(dǎo)劑和吸附劑同時(shí)添加1V標(biāo)記前體來在葡萄細(xì)胞中生產(chǎn)13C標(biāo)記反式白藜蘆醇，獲得的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的最高值。Krisa等人的報(bào)道中稱總芪的產(chǎn)量達(dá)770 μ mol/L (主要產(chǎn)物為白藜蘆醇苷，折合"C標(biāo)記白藜蘆醇的產(chǎn)量為 300mg/L) (Krisa, S. , et al. , Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures :methyl jasmonate induction and 13C biolabeling. J. Nat. Prod, 1999. 62(12) :p. 1688-1690)。之后，Aumont 等人在 2L 生物反應(yīng)器中獲得 360mg/L 的 13C 標(biāo)記白藜蘆醇苷(折合210mg/L13C標(biāo)記白藜蘆醇)，本發(fā)明中生產(chǎn)"C標(biāo)記反式白藜蘆醇 (白藜蘆醇分為正式和反式，反式白藜蘆醇為其活性構(gòu)型)產(chǎn)量可達(dá)1000 1200mg/L.2、本發(fā)明使得反式白藜蘆醇95%以上外泌，被吸附到吸附劑上。大大簡化了提取分離純化的操作，降低了成本，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供了很大的可能性(在國內(nèi)的文獻(xiàn)中反式白藜蘆醇的生產(chǎn)大都通過對生產(chǎn)得到反式白藜蘆醇苷進(jìn)行酶解而獲得)。3、％標(biāo)記前體的添加使得生產(chǎn)的反式白藜蘆醇被標(biāo)記，標(biāo)記率最高可達(dá)到30% 40%，這種生產(chǎn)方法代替了常規(guī)的化學(xué)合成的生產(chǎn)方法，生產(chǎn)過程無毒，大大降低了生產(chǎn)的成本和對環(huán)境的污染。


圖1顯示反式白藜蘆醇的"(標(biāo)記位置；圖2為13C標(biāo)記反式白藜蘆醇的二維核磁的譜圖；圖3為不同樹脂促進(jìn)反式白藜蘆醇生產(chǎn)的效果比較。
具體實(shí)施例方式以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明的有關(guān)內(nèi)容作進(jìn)一步說明。一種利用葡萄細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生白藜蘆醇的方法，包括以下步驟(1)葡萄細(xì)胞的培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株為市購獲得，也可通過對葡萄(Vitis vinifera)的種子按照常規(guī)方法誘導(dǎo)獲得(Cormier, F. , et al. , Development of process strategies foranthocyanin-based food colorant using Vitis vinifera cell cultures. Plant cellcultures secondary metabolism toward industrial application, ed.F. Dicosmo andM. Misawa. 1996，New York :CRC Press)。采用常用培養(yǎng)基 B5 培養(yǎng)基(Gamborg, 0. L.，R. A. Miller,and K. Ojima,Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells. Experimental Cell Research, 1968. 50(1) 151),添力口 0. 1 0. 4mg/L激動(dòng)素，0. 05 0. 3萘乙酸，0. 1 lg/L酶解酪蛋白及10 40g/L蔗糖，pH值為5. 5 6. 5。每隔7天傳代一次，使用旋轉(zhuǎn)式搖床時(shí)轉(zhuǎn)速為60 200rpm，培養(yǎng)溫度為20 30°C，暗培養(yǎng)。(2)1 標(biāo)記反式白藜蘆醇的聯(lián)合誘導(dǎo)生產(chǎn)；將步驟(1)所獲得的葡萄細(xì)胞置于含上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為50 200g/L濕重。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為20 30°C，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)周期為5 20天。在細(xì)胞接種時(shí)每升培養(yǎng)基中加入50 200g的無菌吸附劑，在細(xì)胞指數(shù)生長初期同時(shí)添加一種或多種誘導(dǎo)劑和13C標(biāo)記前體，于每升培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)子濃度為5 1000 μ Μ,前體濃度為0. 1 2mMo從由獲得的培養(yǎng)物分離得到的吸附劑部分中提取反式白藜蘆醇。反式白藜蘆醇最高產(chǎn)量可達(dá)1000 1200mg/L。(3)1 標(biāo)記反式白藜蘆醇含量的測定取Ig吸附劑，加入20ml的甲醇，搖床上過夜提?。蝗√崛∫?4，OOOg離心，備做HPLC0HPLC采用AgilentllOO高效液相色譜儀，檢測波長為307nm。色譜柱采用購買的美國菲羅門公司生產(chǎn)的Luna柱(100mmX 4. 6mm, 5 μ m),流動(dòng)相分別為20 %的乙腈和85 %的乙腈。流速O.^il/min，進(jìn)樣量10yL。用提前制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算反式白藜蘆醇含量。0)1 標(biāo)記反式白藜蘆醇的純化吸附劑的甲醇提取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后溶于5mL的甲醇中，然后用反相C18柱分離純化，包含反式白藜蘆醇的部分濃縮后用硅膠柱進(jìn)一步純化，最后在SEP-PAKCw半制備柱中純化后過濾得到白色粉末即為反式白藜蘆醇純品。
(5) 13C標(biāo)記反式白藜蘆醇的鑒定及13C標(biāo)記率的測定1V標(biāo)記反式白藜蘆醇的標(biāo)記位置通過二維核磁(Varian INOVA 400 MNMR)來確定，1V 標(biāo)記率通過 EA-IRMS (Flash EA 1112HT, Finnigan MAT DeltaV advantage)測定。實(shí)施例1培養(yǎng)條件IOOml搖瓶懸浮培養(yǎng)，采用B5培養(yǎng)基，另添加0. 2mg/L激動(dòng)素和0. Img/ L萘乙酸，0. 25g酶解酪蛋白和30g/L蔗糖，pH為6. 0。將過濾得到的2g提前培養(yǎng)的濕葡萄細(xì)胞接種到含有20ml上述培養(yǎng)基的搖瓶中，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速100rpm，25°C培養(yǎng)。第0天添加200g/L的HP2MGL，第4天添加茉莉酸和水楊酸至終濃度分別為10 μ M 和500 μ M同時(shí)添加ImM的[1_13C]_L_苯丙氨酸。繼續(xù)培養(yǎng)至第10天收獲。1V標(biāo)記反式白藜蘆醇在第10天產(chǎn)量達(dá)到最大(1144. lmg/L)，此時(shí)反式白藜蘆醇的標(biāo)記率為20.8%， 1V標(biāo)記反式白藜蘆醇在第5天標(biāo)記率最大達(dá)到35. 7%，此時(shí)"C標(biāo)記反式白藜蘆醇產(chǎn)量為 746. 2mg/L。
權(quán)利要求
1.利用懸浮培養(yǎng)葡萄細(xì)胞生產(chǎn)1V標(biāo)記反式白藜蘆醇的方法，其利用懸浮培養(yǎng)葡萄細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)，添加吸附劑和添加1V標(biāo)記前體產(chǎn)生1V標(biāo)記反式白藜蘆醇，其特征在于將葡萄細(xì)胞置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為50 200g/L濕重，在細(xì)胞接種時(shí)每升培養(yǎng)基中加入50-200g的無菌吸附劑；在細(xì)胞指數(shù)生長初期，于每升培養(yǎng)基中加入濃度分別為5 1000 μ M的單一誘導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑組合，同時(shí)添加1 IOmM1V標(biāo)記前體；所述誘導(dǎo)劑為非生物誘導(dǎo)劑或真菌誘導(dǎo)子。
2.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述非生物誘導(dǎo)劑為硝酸銀、水楊酸或茉莉酸及其衍生物。
3.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述葡萄細(xì)胞的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為20 30°C，暗培養(yǎng)；培養(yǎng)周期為5 20天，每隔5 14天傳代一次。
4.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述細(xì)胞指數(shù)生長初期是指細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后的第4 10天，即誘導(dǎo)劑的添加時(shí)間。
5.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述吸附劑為大孔吸附樹脂或?qū)Π邹继J醇及其他植物酚類和黃酮類化合物有優(yōu)良吸附作用的樹脂。
6.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述"C標(biāo)記前體為"C標(biāo)記苯丙氨酸或酪氨酸。
7.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述葡萄細(xì)胞的培養(yǎng)基組成為，于B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0. 1 1.0mg/La-萘乙酸，0. 2 lmg/L激動(dòng)素，0. 2 2g/L酶解酪蛋白及10 60g/L蔗糖，pH值為5. 5 6. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體地說是一種利用葡萄懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)13C標(biāo)記反式白藜蘆醇的方法，將葡萄細(xì)胞置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為50～200g/L濕重，在細(xì)胞接種時(shí)每升培養(yǎng)基中加入50～200g的無菌吸附劑；在細(xì)胞指數(shù)生長初期，于每升培養(yǎng)基中加入濃度分別為5～1000μM的單一誘導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑組合，同時(shí)添加濃度為1～10mM的13C標(biāo)記前體；所述誘導(dǎo)劑為非生物誘導(dǎo)劑或真菌誘導(dǎo)子。本發(fā)明中，因絕大部分13C標(biāo)記反式白藜蘆醇外泌到胞外且被吸附到吸附劑上，因而大大簡化了提取分離純化的操作，從而降低了成本，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。同位素標(biāo)記反式白藜蘆醇在心腦血管疾病和癌癥的治療研究中被廣泛應(yīng)用，因此該技術(shù)有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P7/22GK102382862SQ20101026885
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者岳向國, 張衛(wèi) 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所