專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶在體外診斷與體內(nèi)成像、診斷和治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及醫(yī)學(xué)、病原微生物學(xué)和成像技術(shù)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及有助于在個(gè)體的體內(nèi)成像過(guò)程中發(fā)現(xiàn)和定位致病菌的化合物與報(bào)告基因。相關(guān)的背景知識(shí)的描述很多細(xì)菌感染都能在全世界引發(fā)很高的發(fā)病率和死亡率，其中許多最重要的細(xì)菌都是內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性的，這種酶使它們對(duì)普通青霉素類(lèi)抗生素具有耐藥力。多數(shù)感染和青霉素耐藥性的診斷通常是困難的，而且要求在敏感性檢測(cè)前進(jìn)行大量的診斷實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。例如，目前肺結(jié)核感染了近三分之一的世界人口，仍然是公眾健康的嚴(yán)重威脅。當(dāng)人們意識(shí)到世界范圍內(nèi)持續(xù)出現(xiàn)難以治療的、具有多重耐藥性和廣泛耐藥性的菌株時(shí)，對(duì)肺結(jié)核的關(guān)注大大增加了。目前實(shí)驗(yàn)室中對(duì)結(jié)核分枝桿菌活性進(jìn)行定量和評(píng)估的方法是細(xì)胞培養(yǎng)，而在動(dòng)物模型和人感染期間現(xiàn)有方法僅限于集落形成單位(CFU)的檢測(cè)和/或組織與唾液的顯微鏡觀察。這些方法都非常費(fèi)時(shí)，往往難于解釋?zhuān)蚁鄬?duì)不敏感。大多數(shù)方法需要進(jìn)行介入性操作，對(duì)動(dòng)物和人而言這些操作必須在死亡后進(jìn)行。這些不足使得上述方法難以在動(dòng)物模型和患者體內(nèi)跟蹤疾病的發(fā)展，評(píng)價(jià)疫苗效力和治療結(jié)果。光學(xué)成像技術(shù)可以直接觀察到感染期間結(jié)核分枝桿菌的活性，能夠以非介入方式在患病活體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)治療效果并定位致病菌。因此，有必要改進(jìn)對(duì)細(xì)菌性疾病成像的方法。更具體地說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)在敏感性上存在不足，而特異性的內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌實(shí)時(shí)光學(xué)成像方法能夠用于體外和活體個(gè)體的診斷與定位細(xì)菌感染，還可用于新型治療藥物的快速篩選和新藥物靶位的驗(yàn)證。本發(fā)明滿(mǎn)足了本領(lǐng)域中長(zhǎng)期存在的需要和愿望。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種實(shí)時(shí)檢測(cè)個(gè)體體內(nèi)致病菌的方法。該方法包括向個(gè)體體內(nèi)或其生物樣品中引入致病菌的β -內(nèi)酰胺酶的熒光、發(fā)光或顯色底物，以及通過(guò)β -內(nèi)酰胺酶作用于底物而生成的產(chǎn)物對(duì)個(gè)體或其樣品成像。因此，通過(guò)內(nèi)酰胺酶產(chǎn)物所發(fā)出的波長(zhǎng)信號(hào)可以檢測(cè)個(gè)體體內(nèi)的致病菌。本發(fā)明涉及另一種相關(guān)方法，其方法包括通過(guò)內(nèi)酰胺酶產(chǎn)物所發(fā)出信號(hào)的三維重建來(lái)測(cè)定個(gè)體體內(nèi)致病菌的位置。本發(fā)明還涉及另一種相關(guān)方法，其方法包括與致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)的實(shí)時(shí)診斷，該方法基于發(fā)出信號(hào)的強(qiáng)度大
6于測(cè)量的對(duì)照信號(hào)的強(qiáng)度。本發(fā)明也涉及一種診斷與個(gè)體體內(nèi)致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)的方法。該方法包括對(duì)個(gè)體給藥或使其生物樣品與致病菌β -內(nèi)酰胺酶的熒光底物相接觸，以及通過(guò)β -內(nèi)酰胺酶作用于底物而生成的產(chǎn)物對(duì)個(gè)體成像。在發(fā)射波長(zhǎng)上實(shí)時(shí)檢測(cè)這些產(chǎn)物所發(fā)出的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)的強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)物所發(fā)出的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)的強(qiáng)度大于對(duì)照組的信號(hào)強(qiáng)度，因此可與病理生理狀態(tài)的診斷相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還涉及一種相關(guān)方法，該方法包括通過(guò)信號(hào)的三維重建來(lái)測(cè)定病原微生物的位置。本發(fā)明涉及另一種相關(guān)方法，其方法包括注射一種或多種治療化合物以有效治療其病理生理狀態(tài)。本發(fā)明還涉及另一種相關(guān)方法，其方法包括對(duì)個(gè)體再次注射熒光化合物，并對(duì)個(gè)體進(jìn)行再次成像或使其生物樣品接觸該熒光底物；對(duì)個(gè)體或該生物樣品成像以監(jiān)測(cè)治療化合物的功效，若發(fā)現(xiàn)發(fā)射信號(hào)與診斷時(shí)信號(hào)相比有所降低，則表明所注射治療化合物對(duì)病理生理狀態(tài)具有治療作用。本發(fā)明還涉及一種方法，其方法包括對(duì)能夠有效治療與個(gè)體中致病菌相關(guān)病理生理狀態(tài)的治療化合物的篩選。該方法包括選擇適于致病菌潛在的治療化合物，使細(xì)菌細(xì)胞與熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑相接觸，以及使細(xì)菌細(xì)胞與潛在的治療化合物相接觸。在潛在治療化合物存在或不存在下檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞所產(chǎn)生的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)，與治療化合物不存在時(shí)的信號(hào)相比較，若發(fā)現(xiàn)注射治療化合物存在下信號(hào)下降，則表明該化合物具有抗致病菌的治療作用。本發(fā)明還涉及另一種對(duì)致病菌成像的方法。該方法包括使致病菌與β -內(nèi)酰胺酶的熒光底物接觸，向致病菌施加內(nèi)酰胺酶作用生成產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)，然后得到上述產(chǎn)物所發(fā)出的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)。從而通過(guò)所獲得信號(hào)的三維重建對(duì)致病菌成像。本發(fā)明還涉及一種細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶的熒光底物，該熒光底物為CNIR-7或 CNIR7-TAT。本發(fā)明還涉及另一種實(shí)時(shí)檢測(cè)個(gè)體中致病菌的方法。該方法包括在個(gè)體體內(nèi)引入一種以Y射線發(fā)射相關(guān)同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記的底物，該底物是致病菌特異的內(nèi)酰胺酶或是其它酶或蛋白的底物。在酶作用于底物的過(guò)程中，放射性標(biāo)記底物發(fā)射Y射線，采集發(fā)出的Y射線產(chǎn)生的信號(hào)，從而對(duì)個(gè)體成像?；赮射線生成信號(hào)的強(qiáng)度對(duì)個(gè)體體內(nèi)的放射性標(biāo)記物濃度進(jìn)行三維重建，從而檢測(cè)致病菌。本發(fā)明還涉及一種相關(guān)方法，其包括基于上述檢測(cè)方法實(shí)時(shí)診斷致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)。本發(fā)明還涉及另一種相關(guān)方法， 其包括注射一種或多種能夠有效治療病理生理狀態(tài)的治療化合物。發(fā)明還涉及另一種相關(guān)方法，包括對(duì)個(gè)體再次注射放射性標(biāo)記底物，并對(duì)個(gè)體再次成像，以監(jiān)測(cè)治療化合物的功效；若此時(shí)Y射線發(fā)射與診斷時(shí)相比有所下降，則表明該治療化合物對(duì)病理生理狀態(tài)具有治療作用。本發(fā)明還涉及另一種細(xì)菌β -內(nèi)酰胺酶的放射性標(biāo)記底物，該放射性標(biāo)記底物適用于本文所描述的PET或SPET成像。本發(fā)明其他以及更進(jìn)一步的目的、特征和優(yōu)勢(shì)將在以下以公開(kāi)為目的的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中逐漸明顯。


因此，結(jié)合以上對(duì)本發(fā)明的簡(jiǎn)要闡述，并參見(jiàn)附圖中解釋的某些實(shí)施例，本發(fā)明的上述特征、優(yōu)勢(shì)和目的，以及會(huì)變得更清晰的其他方面，將會(huì)更易于理解。這些附圖是本發(fā)明的一部分。然而，應(yīng)當(dāng)了解，附圖是對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的解釋?zhuān)虼瞬粦?yīng)認(rèn)為是將本發(fā)明限制在其范圍內(nèi)。圖IA至圖IC是CCl和CC2 (圖1A)，以及CHPQ(圖1B)禾Π CR2 (圖1C)被β -內(nèi)酰胺酶水解前和水解后的結(jié)構(gòu)圖。圖2Α至圖2Β是COTRl、CNIR2, CNIR3, CNIR4及其被β -內(nèi)酰胺酶水解后的結(jié)構(gòu)圖(圖2Α)，以及CNIR9和CNIRlO的結(jié)構(gòu)圖(圖2Β)。圖3Α至圖3C是制備近紅外底物CNIR5的合成路線圖(圖3Α)，在β -內(nèi)酰胺酶存在或不存在下CNIR5的熒光強(qiáng)度-波長(zhǎng)圖(圖2Β)，以及COTR5-QSY22的結(jié)構(gòu)圖(圖1C)。圖4Α至圖4D是QSY 21 (圖4Α)、QSY21 二磺酸鹽(圖4B)和QSY22 二磺酸鹽(圖 4C)的結(jié)構(gòu)圖，以及QSY22 二磺酸鹽的化學(xué)合成圖(圖4D)。圖5A至圖5B是CNIR7的結(jié)構(gòu)圖(圖5A)及其化學(xué)合成路線圖(圖5B)。圖6A至圖6B是Bluco的化學(xué)合成路線圖(圖6A)，以及Bluco在β -內(nèi)酰胺酶的順序報(bào)告基因生物發(fā)光法(SREL)成像中作用的示意圖(圖6Β)。圖7是以CNIR5檢測(cè)大腸桿菌中Bla活性的示意圖。對(duì)照組包含LB培養(yǎng)基和 CNIR5,未加入轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。圖 8Α 至圖 8D 是 CNIR4 (圖 8Α)、CNIR5 (圖 8Β)、CNIR9 (圖 8C)和 CNIRlO (圖 8D) 被Bla分解前和分解后10分鐘時(shí)的發(fā)射光譜圖。圖9Α至圖9Β是大腸桿菌TEM-I型β -內(nèi)酰胺酶和結(jié)核桿菌Bla-C型β -內(nèi)酰胺酶以CNIR4(圖9A)和圖9B)為底物的動(dòng)力學(xué)圖。圖IOA至圖IOH是結(jié)核分枝桿菌單獨(dú)培養(yǎng)在含有CNIR4(圖10A、圖10E)、COTR5(圖 10B、圖10F)、CNIR9 (圖10C、圖10G)或CNIRlO (圖10D、圖10H)的培養(yǎng)基中的熒光摻入率 (圖IOA至圖10D)與熒光分配率的動(dòng)力學(xué)圖(圖IOE至圖10H)。圖IlA至圖IlH是結(jié)核分枝桿菌在CMR4(圖11A、圖11E)、CNIR5(圖11B、圖11F)、 CNIR9(圖11C、圖11G)或COTRlO (圖11D、圖11H)存在條件下感染巨噬細(xì)胞的熒光混合率 (圖IlA至圖11D)與熒光分配率的動(dòng)力學(xué)圖(圖IlE至圖11H)。圖12是CNIR4在細(xì)胞內(nèi)摻入感染巨噬細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌的熒光共聚焦顯微圖像。DAPI染色(藍(lán)色)的是感染細(xì)胞的核，綠色熒光來(lái)自標(biāo)記結(jié)核桿菌的GFP，紅色熒光來(lái)自分解的CNIR4。圖 13 是皮下接種 CNIR4(圖 13A)、CNIR5(圖 13B) ,CNIR9(圖 13C)或 CNIRlO (圖 13D)并感染結(jié)核傳分枝桿菌的小鼠的熒光圖像，接種濃度分別為108(每只鼠的左下方)、 107(左上方)和106(右上方)。圖13E是用于感染各個(gè)化合物在不同濃度下的信噪比圖。圖14A至圖14E是通過(guò)噴霧接種、肺臟已感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠的熒光圖和 CNIR4(圖 14A)、CNIR5 (圖 14B)、CNIR9 (圖 14C)和 CNIRlO (圖 14D)的熒光信號(hào)圖。在圖 8A至圖8D中，每一排左邊的小鼠都是未感染的，左側(cè)第二個(gè)小鼠感染的是含有突變blaC基因的菌株，而每一排右側(cè)的兩個(gè)小鼠感染的是野生型的結(jié)核桿菌。成像前M小時(shí)，每一排右側(cè)的三個(gè)小鼠靜脈注射CNIR4、CNIR5, CNIR9或CmRlO。圖14E是背部圖像的肺臟區(qū)域中各個(gè)化合物的信噪比圖。圖15A至圖15F是在1小時(shí)(圖15A)、18小時(shí)(圖15B)、24小時(shí)(圖15C)和48
8小時(shí)(圖15D)以底物CNIR5對(duì)噴霧感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠成像獲得的熒光圖。每一排的背部、腹部、右側(cè)或左側(cè)視圖中，左側(cè)的小鼠是未感染的，右側(cè)的小鼠是感染的。在上述時(shí)間點(diǎn)成像前所有小鼠靜脈注射COTR5。圖15F是對(duì)圖15A最上排圈出的感興趣區(qū)域的熒光信號(hào)進(jìn)行定量測(cè)定獲得的熒光信號(hào)比圖。圖16A至圖16B是噴霧感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠(圖16A)和未感染小鼠(圖16B) 的熒光圖，采用透射法而不是反射法成像，以降低背景信號(hào)。圖17A至圖17D是對(duì)表達(dá)CNIR5 (7nmol)的、左側(cè)肩部異種移植野生型C6膠質(zhì)瘤、 右側(cè)肩部異種移植cmv-bla穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C6膠質(zhì)瘤的裸鼠體內(nèi)的Bla成像獲得的圖像。圖 17A是圖示時(shí)間點(diǎn)時(shí)的熒光圖和明場(chǎng)圖。圖17B是各個(gè)腫瘤平均密度-時(shí)間曲線圖。圖17C 是切除的腫瘤和器官的圖像。圖17D是對(duì)兩種腫瘤提取物中Bla進(jìn)行CCl檢測(cè)的結(jié)果。圖18A至圖18C是對(duì)表達(dá)CNIR6 (7nmol)的、左側(cè)肩部異種移植野生型C6膠質(zhì)瘤、 右側(cè)肩部異種移植cmv-bla穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C6膠質(zhì)瘤的裸鼠體內(nèi)的Bla成像獲得的圖像。圖 18A是CNIR6的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。圖18B是圖示時(shí)間點(diǎn)時(shí)的熒光圖和明場(chǎng)圖。圖18C是各個(gè)腫瘤平均密度-時(shí)間曲線圖。圖19A至圖19B是4小時(shí)(圖19A)和24小時(shí)(圖19B)后7. 5nmol的CNIR5在不同組織內(nèi)的生物分布。圖20A至圖20B是以靜脈注射的CNIR5作為顯像劑對(duì)感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠 (圖20A)和未感染的對(duì)照組小鼠(圖20B)體內(nèi)成像獲得的圖像。圖21A至圖21C是COTR探針用于SREL方法檢測(cè)閾的示意圖。圖21A是柱狀圖，該圖表明β -內(nèi)酰胺酶COTR探針用于SREL成像方法能夠檢測(cè)到少于100個(gè)的細(xì)菌。圖21Β 至圖21C是對(duì)未感染的活體小鼠(圖21Β)和感染結(jié)核分枝桿菌的活體小鼠(圖21C)體外成像獲得的圖像。圖22是IRDye800系列熒光團(tuán)的結(jié)構(gòu)圖。圖23是頭孢哌酮和擬合成的COTR探針的結(jié)構(gòu)圖。圖M是建立Bluco底物小型偏倚文庫(kù)的示意圖。圖25是包含一個(gè)連接在3’ -位的烯丙基鍵的新型指針的結(jié)構(gòu)圖。圖沈是包含一個(gè)連接在3’ -位的氨基甲酸酯的新型指針的結(jié)構(gòu)圖。發(fā)明詳述本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所使用的“一”或“一個(gè)”指一或多。本發(fā)明權(quán)利要求中所使用的 “一”或“一個(gè)”，當(dāng)其與“包括”連接使用時(shí)，指一或一以上。此處所使用的“另一個(gè)”或“另外一個(gè)”指其中至少還有第二個(gè)或多個(gè)相同或不同的權(quán)利要求或組分。此外，除非上下文另有規(guī)定，本說(shuō)明書(shū)中所使用的單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)意義，反之亦然。盡管本公開(kāi)文本支持僅指另一個(gè)和“和/或”的釋義，但除非明確指出其僅指另一個(gè)或是指互斥的另一個(gè)，此處所使用的術(shù)語(yǔ)“或”指“和/或”。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“接觸”指能夠使適于PET或SPECT成像方法的熒光化合物，熒光、發(fā)光或顯色蛋白及放射性標(biāo)記底物與致病菌(例如但不限于結(jié)核分枝桿菌(Mbt)和牛型結(jié)核桿菌(M.bovis))接觸的合適方法。在體外或離體的條件下，這要通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基內(nèi)暴露于熒光化合物，熒光、發(fā)光或顯色蛋白下實(shí)現(xiàn)。細(xì)菌細(xì)胞在由個(gè)體獲得的樣品中。上述樣品包括但不限于胸膜液和其他可能含有細(xì)菌的體液(包括血
9液、唾液、尿液和糞便)。如本文所描述，對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，任何已知的注射熒光化合物，熒光、 發(fā)光或顯色蛋白及放射性標(biāo)記底物的方法均是適用。此處所使用的“熒光底物”一詞指適宜酶存在下，能夠生成合適波長(zhǎng)激發(fā)下發(fā)出或產(chǎn)生熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)的產(chǎn)物的化合物、蛋白、肽或其他生物活性分子。例如且不限于 β -內(nèi)酰胺酶或熒光素酶存在下能夠生成熒光、發(fā)光或顯色產(chǎn)物的熒光底物。此處所使用的“放射性標(biāo)記底物”一詞指以附著、連接或其他方式與短壽命放射性同位素相連的，能夠在正電子發(fā)射斷層顯像(PET)或γ射線單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像 (SPECT)中發(fā)射正電子的化合物、蛋白、肽或其他生物活性分子。此處所使用的“ β -內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌”一詞指在發(fā)病過(guò)程中天然分泌β -內(nèi)酰胺酶或能夠獲取β -內(nèi)酰胺酶的致病菌。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”指治療的任何對(duì)象。該個(gè)體最好是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選的是?；蛉?。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案給出了一種在個(gè)體體內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)致病菌的方法，其包括在個(gè)體體內(nèi)或其生物樣品中引入致病菌內(nèi)酰胺酶的熒光、發(fā)光或顯色底物；以?xún)?nèi)酰胺酶作用于底物生成產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)個(gè)體或其樣品成像；并采集內(nèi)酰胺酶產(chǎn)物發(fā)射波長(zhǎng)上的信號(hào)；從而檢測(cè)個(gè)體體內(nèi)的致病菌。進(jìn)一步，該實(shí)施方案中的方法包括建立發(fā)射信號(hào)的三維重建以檢測(cè)致病菌在個(gè)體體內(nèi)的位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其給出的方法包括基于發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度大于測(cè)量的對(duì)照組信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)診斷致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)。病理生理狀態(tài)的一個(gè)例子是肺結(jié)核。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，熒光底物指熒光底物。其中，熒光底物的例子有 CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR7-TAT、籠狀熒光素、 顯色試劑或其衍生物。并且，一些實(shí)施方案中的成像波長(zhǎng)為約MOnm至約730nm。此外，發(fā)射信號(hào)為約300nm至約900nm。所有實(shí)施方案中的成像波長(zhǎng)為約300nm至約900nm。在一些實(shí)施方案中，顯色指示指可通過(guò)人眼視覺(jué)識(shí)別的顏色變化，或可通過(guò)儀器測(cè)量，以測(cè)定指定的數(shù)值。此外，致病菌包括擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、 嗜血桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、分枝桿菌屬、埃希氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬或李斯特菌屬其中的菌種。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案給出了診斷與個(gè)體體內(nèi)致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)的方法，其包括向個(gè)體注射致病菌β-內(nèi)酰胺酶的熒光底物；在β -內(nèi)酰胺酶作用生成的底物的激發(fā)波長(zhǎng)上對(duì)個(gè)體或其樣品成像；并實(shí)時(shí)檢測(cè)其產(chǎn)物發(fā)射波長(zhǎng)上的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)；其中，熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)強(qiáng)度要大于病理生理狀態(tài)診斷相關(guān)測(cè)量的對(duì)照信號(hào)。進(jìn)一步，該實(shí)施方案的方法包括建立信號(hào)的三維重建以檢測(cè)病原微生物的位置。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，其方法包括注射一種或多種能夠有效治療病理生理狀態(tài)的治療化合物。該方法還包括向個(gè)體再次注射熒光底物；并對(duì)個(gè)體再次成像以監(jiān)測(cè)治療化合物的功效； 其中，若發(fā)射信號(hào)與診斷時(shí)相比有下降，則表明治療化合物對(duì)病理生理狀態(tài)有治療作用。所有實(shí)施方案中的病理生理狀態(tài)、致病菌、熒光底物以及激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)均如前所述。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案給出了診斷與個(gè)體體內(nèi)致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)的方法，其包括使由上述個(gè)體獲得的樣品與致病菌的內(nèi)酰胺酶的顯色底物相接觸；其中， β -內(nèi)酰胺酶作用于底物而生成的產(chǎn)物能夠引起裸眼可見(jiàn)的顏色變化，從而指示診斷結(jié)果。底物可以放置在紙帶、棉簽、背景或其他目視指示器上。這種顏色變化是裸眼可見(jiàn)、可識(shí)別的，無(wú)須任何設(shè)備確認(rèn)或外部能量源的激發(fā)。本發(fā)明的又一實(shí)施方案給出了篩選能夠有效治療與個(gè)體體內(nèi)致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)的治療化合物的方法，其包括選擇適用于致病菌的潛在治療化合物；使細(xì)菌細(xì)胞與熒光檢測(cè)試劑、發(fā)光檢測(cè)試劑或顯色檢測(cè)試劑相接觸；使細(xì)菌細(xì)胞與潛在治療化合物相接觸；并測(cè)量潛在治療化合物存在和不存在下細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)；其中，治療化合物存在時(shí)與治療化合物不存在時(shí)相比較，若信號(hào)下降，則表明該化合物有抗致病菌的治療作用。該實(shí)施方案中的病理生理狀態(tài)和致病菌均如前所述。在該實(shí)施方案中的一方面中，致病菌可能是重組菌，其中使細(xì)菌與熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑相接觸的步驟包括以包含熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生菌。在該方面，熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑包括熒光蛋白。熒光蛋白的例子有mPlunumKeima、 Mcherry和tdTomato。并且，在該方面中，表達(dá)載體包含β -半乳糖苷酶基因，其中所述方法進(jìn)一步包括使重組菌細(xì)胞與有效熒光團(tuán)相接觸，在半乳糖苷酶存在下發(fā)出熒光信號(hào)。 熒光團(tuán)的例子有C2FDG、C12RG和DDA0G。此外，在該方面中，表達(dá)載體包含熒光素酶基因， 其中所述方法進(jìn)一步包括使重組菌細(xì)胞與D-熒光素相接觸。熒光素酶的例子有螢火蟲(chóng)螢光素酶、叩頭蟲(chóng)紅色熒光素酶和rLucS。在該實(shí)施方案的另一方面中，熒光檢測(cè)試劑指細(xì)菌β -內(nèi)酰胺酶的熒光底物。在一個(gè)實(shí)施例中，致病菌在體內(nèi)與熒光底物CmR2、CmR3、CNIR4、COTR5、CmR5-QSY22、CmR7、 CNIR9、COTR10、CNIR-TAT、籠狀熒光素、顯色試劑或其衍生物相接觸。在另一個(gè)實(shí)施例中，致病菌在體外與熒光底物CC1、CC2、CHPQ, CR2、CNIRl或CNIR6相接觸。本發(fā)明的又一實(shí)施方案給出了對(duì)致病菌成像的方法，其包括使致病菌與內(nèi)酰胺酶的熒光底物相接觸；向致病菌施加β -內(nèi)酰胺酶作用于底物而生成的產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)；采集生成產(chǎn)物發(fā)出的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)；并建立采集信號(hào)的三維重建，從而對(duì)致病菌成像。如上所述，在該實(shí)施方案的各個(gè)方面中，致病菌能夠在體內(nèi)或體外與熒光或發(fā)光底物相接觸。并且，該實(shí)施方案所有方面中的致病菌以及激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)均如上所述。本發(fā)明的又一實(shí)施方案給出了細(xì)菌β -內(nèi)酰胺酶的熒光底物，即CNIR-7或 CNIR7-TAT。本發(fā)明的又一實(shí)施方案給出了在個(gè)體體內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)致病菌的方法，其包括向個(gè)體體內(nèi)引入以Y射線同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記的底物；其中所使用的底物是致病菌特異的
內(nèi)酰胺酶、其他酶或蛋白的底物；以放射性標(biāo)記底物在酶作用過(guò)程中發(fā)出的Y射線對(duì)個(gè)體成像；采集發(fā)出的Y射線產(chǎn)生的信號(hào)；并基于Y射線產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)個(gè)體體內(nèi)的放射性標(biāo)記濃度進(jìn)行三維重建；從而檢測(cè)致病菌。進(jìn)一步，該實(shí)施方案的方法包括基于其檢測(cè)對(duì)與致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)診斷。在又一實(shí)施方案中，其方法包括注射一種或多種能夠有效治療病理生理狀態(tài)的治療化合物。在又一實(shí)施方案中，其方法包括向個(gè)體再次注射放射性標(biāo)記底物；并對(duì)個(gè)體再次成像以監(jiān)測(cè)治療化合物的功效；若與診斷時(shí)相比Y發(fā)射下降，則表明治療化合物對(duì)病理生理狀態(tài)有治療作用。在這些實(shí)施方案中，病理生理狀態(tài)指肺結(jié)核。在所有這些實(shí)施方案的一個(gè)方面中，放射性標(biāo)記指正電子同位素，且其能夠通過(guò)正電子發(fā)射斷層顯像(PET)成像。在另一個(gè)方面中，放射性標(biāo)記指直接發(fā)射Y射線的同位
11素，且其能夠通過(guò)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(SPECT)成像。上述實(shí)施方案所有方面中的其他酶或蛋白指內(nèi)酰胺酶類(lèi)酶或青霉素結(jié)合蛋白。并且，所有實(shí)施方案中的細(xì)菌菌種均如上所述。本發(fā)明的又一實(shí)施方案給出了適宜PET或SPECT成像的β -內(nèi)酰胺酶的放射性標(biāo)記底物。在該實(shí)施方案中，放射性標(biāo)記物指氟-18、氮-13、氧-18、碳-11、锝-99m、碘-123 或銦-111。此處給出的是優(yōu)選的對(duì)細(xì)菌性疾病和/或感染成像的系統(tǒng)或方法。這些系統(tǒng)和方法是對(duì)患病期間的細(xì)菌定量和定位以及實(shí)時(shí)體內(nèi)分析抗菌藥物療效的非常靈敏的工具。應(yīng)考慮到，這些系統(tǒng)對(duì)于在單細(xì)胞水平檢測(cè)致病菌是有效的。這些體內(nèi)成像(IVI)系統(tǒng)和方法能夠在臨床環(huán)境中直接應(yīng)用于患者。此處的系統(tǒng)和方法適用于天然具有或獲得β -內(nèi)酰胺酶活性的細(xì)菌菌種。不限于此，內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性的細(xì)菌菌種的例子有擬桿菌、梭狀芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、假單胞菌、軍團(tuán)菌、分枝桿菌、嗜血桿菌、埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和李斯特菌。尤其要考慮的是對(duì)分枝桿菌屬(如結(jié)核分枝桿菌和牛型分枝桿菌)的診斷、定位和定量。盡管此處所描述的系統(tǒng)和方法的優(yōu)勢(shì)是不需要對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行基因改造以使其能夠被檢測(cè)，但應(yīng)考慮到，提高β -內(nèi)酰胺酶的表達(dá)水平、活性和/或分泌均能夠提高檢測(cè)的靈敏度。正因如此， 應(yīng)考慮到，通過(guò)合適的方法向感興趣的細(xì)菌菌種中引入內(nèi)酰胺酶使其能夠被檢測(cè)，其采用的方法應(yīng)能夠使內(nèi)酰胺酶的表達(dá)和分泌水平足夠達(dá)到檢測(cè)方法的靈敏度。這可以通過(guò)在體外或體內(nèi)使用已知或標(biāo)準(zhǔn)的傳送方法來(lái)完成，包括使用適宜傳送到哺乳動(dòng)物體內(nèi)的噬菌體等傳輸體。本發(fā)明的體內(nèi)成像系統(tǒng)能夠檢測(cè)作為β -內(nèi)酰胺酶活性底物的化合物或報(bào)告基因產(chǎn)生的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)。成像系統(tǒng)在本技術(shù)領(lǐng)域已為人們所熟知，而且已商品化。 例如，順序報(bào)告基因-酶聯(lián)熒光(SREF)系統(tǒng)、順序報(bào)告基因-酶聯(lián)發(fā)光(SREL)系統(tǒng)或生物發(fā)光系統(tǒng)均可以用于檢測(cè)內(nèi)酰胺酶活性的產(chǎn)物。。此外，采集的信號(hào)能夠用于建立三維重建，以定位病原菌。對(duì)于這些系統(tǒng)，成像技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠根據(jù)使用的化合物和/ 或報(bào)告基因以及檢測(cè)的信號(hào)類(lèi)型來(lái)選擇激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。一個(gè)例子是激發(fā)信號(hào)范圍為約 540nm至約730nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為約650nm至約800nm。應(yīng)當(dāng)考慮到，本發(fā)明的體內(nèi)成像系統(tǒng)也能夠檢測(cè)其他信號(hào)，如幅射所產(chǎn)生的信號(hào)以及內(nèi)酰胺酶作用于適宜底物或其他檢測(cè)試劑所產(chǎn)生的可檢測(cè)的或可讀取的信號(hào)。本發(fā)明中的β-內(nèi)酰胺酶底物指化學(xué)物質(zhì)或量子點(diǎn)物質(zhì)。例如，通過(guò)SREL或SREF 成像的底物指熒光團(tuán)、籠狀熒光素及其他熒光、發(fā)光或顯色化合物、報(bào)告基因或其他能夠給出應(yīng)用所需最佳信號(hào)的檢測(cè)試劑。該底物在充分滲透到組織中并產(chǎn)生高信噪比時(shí)毒性較低或無(wú)毒性。該信號(hào)指近紅外、紅外或紅光信號(hào)，例如約650nm至約800nm。例如，底物指能夠在體外或體內(nèi)經(jīng)β -內(nèi)酰胺酶分解產(chǎn)生信號(hào)的熒光底物或量子點(diǎn)物質(zhì)。熒光底物包括FRET供體，例如吲哚花青綠染料，如Cy5、Cy5. 5或Cy7 ；FRET淬滅劑，如淬滅基團(tuán)QSY21、QSY21 二磺酸鹽、QSY22或QSY22 二磺酸鹽。此外，熒光底物還包括為提高細(xì)胞滲透性和/或使其可以連接到小肽上的全乙?；腄-葡糖胺，例如但不限于 TAT0此外，底物可以被修飾以提高其信號(hào)強(qiáng)度、組織滲透能力以及在所有組織中均勻分布的特異性或性能。此外，應(yīng)考慮到，其他對(duì)組織、細(xì)胞或化合物的標(biāo)記方法與這些底物相結(jié)合有助于提高對(duì)致病菌的檢測(cè)靈敏度。具體地說(shuō)，熒光底物能夠檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基或體外單個(gè)培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中的 β -內(nèi)酰胺酶活性?；瘜W(xué)熒光底物的例子有CCl、CC2、CHPQ, CR2、CNIRl和CNIR6。對(duì)于體內(nèi)成像的應(yīng)用，可替換的熒光底物可以是CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、 CNIR9、COTRlO或CNIR-TAT。這些熒光底物均可用于順序報(bào)告基因-酶聯(lián)熒光(SREF)系統(tǒng)中。應(yīng)考慮到，β-內(nèi)酰胺酶的底物能夠在體外或體內(nèi)有效檢測(cè)單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。對(duì)β -內(nèi)酰胺酶的體內(nèi)檢測(cè)而言，熒光底物的另一個(gè)例子是籠狀熒光素，例如但不限于Bluco，Bluco2和Bluco3。這種底物包括D-熒光素、螢火蟲(chóng)熒光素酶底物(Flue)、 β-內(nèi)酰胺和β-內(nèi)酰胺酶底物。β-內(nèi)酰胺經(jīng)酶分解釋放出D-熒光素，D-熒光素經(jīng)Fluc 氧化發(fā)光?；\狀熒光素可用于順序報(bào)告基因生物發(fā)光(SREL)系統(tǒng)或其他生物發(fā)光成像系統(tǒng)。熒光蛋白也可以用于致病菌的體內(nèi)或體外檢測(cè)。熒光蛋白(FP)，例如mPlum、 mKeimiMcherry和tcTTomato，均可克隆到表達(dá)載體中。以熒光蛋白構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化我們感興趣的病原菌(如結(jié)核分枝桿菌)。通過(guò)細(xì)菌表達(dá)熒光蛋白以產(chǎn)生成像時(shí)可檢測(cè)的信號(hào)。其他成像系統(tǒng)能夠利用轉(zhuǎn)化的重組菌來(lái)分泌其他酶，例如半乳糖苷酶，在有熒光團(tuán)(如 C2FDG、C12RG和DDA0G)存在的條件下會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。另一些成像系統(tǒng)還能夠利用其他重組系統(tǒng)來(lái)表達(dá)其他熒光素酶，例如叩頭蟲(chóng)紅色熒光素酶和rLucS，它們?cè)谟蠨-熒光素的存在條件下會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。另一個(gè)選擇是使用正電子發(fā)射斷層顯像(PET)或單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像 (SPECT)成像系統(tǒng)。探針包括此處描述的致病菌的β -內(nèi)酰胺酶、β -內(nèi)酰胺酶類(lèi)酶或其它類(lèi)似酶或蛋白。PET與SPECT成像技術(shù)在本領(lǐng)域?yàn)槿藗兯熘?。?duì)PET成像而言，底物探針是正電子放射性同位素標(biāo)記的，例如但不限于氟-18、氧-18、碳-11或氮-13。對(duì)SPECT成像而言，底物探針是Y射線放射性同位素標(biāo)記的，例如但不限于锝-99m、碘-123或銦-111。 PET和SPECT探針使用眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)和放射化學(xué)合成技術(shù)合成和標(biāo)記。應(yīng)考慮到，通過(guò)使用小分子(如頭孢哌酮)模擬β -內(nèi)酰胺酶的酶口袋能夠最大化探針的設(shè)計(jì)和特異性。因此，使用這種高通量小分子系統(tǒng)設(shè)計(jì)的底物對(duì)診斷目的最為敏感，適于產(chǎn)生能夠從現(xiàn)有成像設(shè)備可以檢測(cè)到的深層組織中有效滲透出來(lái)的信號(hào)，并防止與其他細(xì)菌菌種的交叉反應(yīng)。并且，這些靈敏且特異的底物探針在單個(gè)細(xì)菌水平上也是有效的，能夠把采集的信號(hào)的量放大100至1000倍。除此之外，應(yīng)考慮到，結(jié)核分枝桿菌中的 β -內(nèi)酰胺酶類(lèi)酶和青霉素結(jié)合蛋白(而不是β -內(nèi)酰胺酶)能夠用于提高探針的特異性。此處描述的系統(tǒng)和方法可以有效地實(shí)時(shí)檢測(cè)、定位、定量并確定致病菌的活性。體外成像在細(xì)胞培養(yǎng)基或單細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行，臨床樣品或切片的離體成像通過(guò)SREL或SREF 進(jìn)行，個(gè)體的體內(nèi)成像通過(guò)已公開(kāi)的成像系統(tǒng)進(jìn)行。體外試驗(yàn)中所使用的樣品包括但不限于切片、胸膜液和其他可能包含細(xì)菌的體液，包括血液、唾液尿液和糞便。因此，此處給出的系統(tǒng)和方法能夠有效診斷與細(xì)菌病原體相關(guān)的病理生理狀態(tài)，例如病癥或感染。由于能夠檢測(cè)包括單個(gè)細(xì)菌的很少量的細(xì)菌，所以比當(dāng)前診斷方法能及時(shí)診斷并發(fā)現(xiàn)早期感染。此處所描述的系統(tǒng)和方法能夠用于有細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)的醫(yī)護(hù)工作者的檢測(cè)和定期檢查。此外， 該系統(tǒng)和方法也能夠用于設(shè)備、用具、工具、工作臺(tái)表面、工作服和人員污染的檢查和檢測(cè)。 由于廣泛耐藥性結(jié)核O(DR-TB)工作人員感染現(xiàn)在已經(jīng)達(dá)到醫(yī)護(hù)工作者的40%，而主要感
13染部位是鼻腔、手掌上過(guò)度清洗造成的創(chuàng)口，所以本發(fā)明可作為醫(yī)療中心和醫(yī)護(hù)工作者的檢查致病菌的方法。如需要，這些系統(tǒng)和方法也可以用于農(nóng)業(yè)和動(dòng)物學(xué)中對(duì)內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。并且，在當(dāng)前成像技術(shù)范圍內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)菌量的相關(guān)性良好。因此，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控化合物、藥物、藥物組合或其他治療試劑的功效。因而此處描述的系統(tǒng)和方法給出了抗菌藥物的高通量篩選系統(tǒng)。由于對(duì)內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)要求細(xì)菌具有活性，所以在一種或多種治療試劑存在的條件下酶的水平提供了一種抗菌活性的測(cè)量手段。使用適合特定細(xì)菌的底物能夠快速測(cè)量?jī)?nèi)酰胺酶水平的變化，并幾乎立即確定治療試劑的有效性。該系統(tǒng)能夠檢測(cè)單個(gè)樣品，也能夠一次檢測(cè)微孔板中的數(shù)千個(gè)樣品。以下給出的實(shí)施例是為了解釋本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，而不是以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1以對(duì)數(shù)早期的全細(xì)胞和全細(xì)胞裂解液檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌中的Bla，對(duì)適合該方法的潛在化合物和已知化合物(包括頭孢硝噻吩(Calbiochem)、CENTA Bla底物 (Calbiochem)、Fluorocillin Green (Molecular Probes)、CCF2-AM (Invitrogen)禾口 CCF4-AM(Invitrogen))進(jìn)行比較。檢測(cè)所有樣品的稀釋液以測(cè)定發(fā)出顯著信號(hào)的最小細(xì)菌數(shù)量或裂解液體積。在對(duì)完整細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)前后及裂解前，對(duì)其進(jìn)行滴度測(cè)定以檢測(cè)實(shí)際使用的CFU。將96孔板孵育在37°C的細(xì)菌培養(yǎng)基中15-120min，用分光光度法測(cè)量四次以評(píng)價(jià)其靈敏性和重復(fù)性。開(kāi)始時(shí)，以生產(chǎn)商推薦的濃度使用化合物，例如，CNIR5在體內(nèi)成像中的推薦濃度為2nM。在培養(yǎng)基中，對(duì)大部分靈敏的、可重復(fù)的化合物的不同濃度進(jìn)行評(píng)價(jià)，以測(cè)定獲得最大信號(hào)所需要的最小濃度。上述實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組包括陽(yáng)性對(duì)照，恥垢分枝桿菌和商用的Bla(Sigma)；以及陰性對(duì)照，Bla缺失的Mtb blaC突變體(羅切斯特大學(xué)的 M. Pavelka博士提供的PM638) (1)。對(duì)BCG的Bla產(chǎn)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，因?yàn)槟承┣闆r下BCG會(huì)被用BL2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的IVI，該實(shí)驗(yàn)室中有各種可供使用的成像設(shè)備。評(píng)價(jià)blaC突變型結(jié)核分枝桿菌和野生型結(jié)核分枝桿菌中的重組Bla構(gòu)建載體利用兩個(gè)多拷貝載體與兩個(gè)單拷貝載體在結(jié)核分枝桿菌中表達(dá)Bla。多拷貝載體基于攜帶PMM62來(lái)源的hsp60啟動(dòng)子(Phsp60)的pJDC89，已經(jīng)證明，pMM62可中等量表達(dá)基因。該載體還攜帶潮霉素抗性，包含Wisp60下游的一個(gè)多接頭、一個(gè)大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)和分枝桿菌PAL5000的復(fù)制起始位點(diǎn)。為了增加該載體的表達(dá)量，用L5啟動(dòng)子(PL5) 替代W!sp60，其表達(dá)基因較Wisp60高50-100倍。兩種啟動(dòng)子都是相對(duì)保守的，并且能夠在大部分細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)。除非明確提到，大部分克隆都是采用^-Fusion 2.0 PCR克隆系統(tǒng)(Clontech)進(jìn)行的，該系統(tǒng)允許利用感興趣區(qū)域PCR所用引物的15bp最小同源區(qū)域直接克隆基因片段到線性構(gòu)建載體中。通過(guò)克隆包含ccdB基因及啟動(dòng)子下游左右兩側(cè)Gateway重組序列的PCR片段， 將兩種構(gòu)建載體改進(jìn)為(Gateway arwitrogen)供體載體。攜帶該區(qū)域的載體必須保存在允許ccdB區(qū)域存活的ccdB存活菌株里；而在其他大腸桿菌中該區(qū)域是致死的，在克隆期間這一性質(zhì)被用來(lái)阻止非重組載體的存活。將上述啟動(dòng)子和相關(guān)的Gateway區(qū)域克隆到 PYUB412載體中，PYUB412載體具有潮霉素抗性，包含大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)、L5噬菌體結(jié)合位點(diǎn)(attP)和L5重組酶，因此該菌株可以整合到結(jié)核分枝桿菌染色體的attB位點(diǎn)，以單拷貝存在于結(jié)核分枝桿菌中。利用攜帶(Gateway重組序列的引物，通過(guò)(Gateway BP反應(yīng) (Invitrogen)將Mtb的Bla基因克隆到上述載體中。如前所述，通過(guò)電穿孔法將上述載體轉(zhuǎn)化到Mtb和blaC突變體中。利用所述內(nèi)源Bla體外檢測(cè)法對(duì)得到的Mtb菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)， 將其信號(hào)強(qiáng)度與陰性對(duì)照blaC突變體和僅攜帶適宜的載體主干部分的野生型菌株的信號(hào)強(qiáng)度相比較。盡管CNIR5是高度膜透性的，但是通過(guò)將Bla定位到較細(xì)菌本身具有更大表面積的宿主細(xì)胞膜上從而有助于報(bào)告基因與化合物接觸，提高信號(hào)強(qiáng)度。由于結(jié)核分枝桿菌的吞噬小體不是靜止的，其與幾種脂和受體循環(huán)通路相互作用，也有幾種標(biāo)記物出現(xiàn)在循環(huán)溶酶體中的，所以合適的靶向蛋白應(yīng)該可以通過(guò)分枝桿菌吞噬小體進(jìn)入宿主細(xì)胞中。Mtb的 Bla借助其氨基端的TAT信號(hào)從細(xì)菌中分泌出來(lái)，而添加的羧基端標(biāo)簽使其定位于細(xì)胞膜上。磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白，如能夠在巨噬細(xì)胞表面很好地表達(dá)的CD14，通過(guò)羧基端信號(hào)序列定位于細(xì)胞膜上。構(gòu)建含有⑶14的GPI錨定蛋白信號(hào)序列羧基端M個(gè)氨基酸和Mtb來(lái)源的Bla的融合蛋白(Bla::GPI)。利用Gateway系統(tǒng)將融合蛋白克隆到Mtb的四種表達(dá)系統(tǒng)中，并轉(zhuǎn)化到野生型Mtb和blaC突變體中。得到的菌株能夠表達(dá)Bla: :GPI融合蛋白，以blaC突變體作為陰性對(duì)照，利用胞內(nèi)檢測(cè)法評(píng)價(jià)原始Bla和感染的巨噬細(xì)胞表面的Bla水平。對(duì)完整的感染巨噬細(xì)胞和以0. I^Wtriton裂解的巨噬細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。底物水解前后的熒光光譜在Iml濃度為1 μ M的PBS中采集底物的激發(fā)和發(fā)射光譜。向溶液中加入IOnM 純化的Bla，再次采集其激發(fā)和發(fā)射光譜，直至光譜不再變化為止。通過(guò)比較發(fā)射波長(zhǎng)峰值 690nm處的發(fā)射強(qiáng)度來(lái)估計(jì)Bla水解后探針熒光信號(hào)的增強(qiáng)。以探針作為Bla底物的體外酶動(dòng)力學(xué)以在約690nm處熒光強(qiáng)度的增長(zhǎng)率(ν)表示探針的水解速率。在Mtb的Bla濃度為InM的條件下，分別測(cè)定探針濃度為5、10、20、50、80μΜ時(shí)的水解速率(ν)。以底物水解速率(1Λ)對(duì)底物濃度(1/[探針])作雙倒數(shù)圖來(lái)計(jì)算Bla水解探針的k。at和Km。底物的生物穩(wěn)定性以約690nm處熒光強(qiáng)度的增長(zhǎng)率來(lái)估計(jì)底物在生理?xiàng)l件下自發(fā)水解的速率。因此，室溫孵育1小時(shí)后對(duì)其進(jìn)行熒光定量，以評(píng)價(jià)底物在水溶液和血清中的穩(wěn)定性。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的Bla成像以Bla(CmV-bla)轉(zhuǎn)染的和野生型的人外周血白血病T細(xì)胞系Jurkat和C6小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系對(duì)底物進(jìn)行測(cè)試，使用已發(fā)表的成像條件(3)以熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行成像。mRNA與NIRF信號(hào)的線性相關(guān)野生型的和cmv-bla轉(zhuǎn)染的人外周血白血病T細(xì)胞Jurkat以不同比例混合 (cmv-bla轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例分別為10%、20%、40%、60%和80% )，細(xì)胞密度為5X105/ml。在細(xì)胞混合物中加入5 μ M底物，孵育30分鐘，所有樣品以預(yù)冷PBS洗滌，離心并裂解。對(duì)最終上清液進(jìn)行熒光檢測(cè)。以northern分析對(duì)mRNA水平和Bla表達(dá)水平進(jìn)行定量。mRNA濃度_Cy5. 5熒光強(qiáng)度曲線反映了二者之間是否存在線性關(guān)系。
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培養(yǎng)基中結(jié)核分枝桿菌β-內(nèi)酰胺酶的定位與調(diào)控Mtb接種時(shí)O.D.為0.05，在整個(gè)生長(zhǎng)曲線以qRT-PCR檢測(cè)Bla的轉(zhuǎn)錄，直至平臺(tái)期(O.D. =2)。通過(guò)每天從培養(yǎng)基中分離RNA以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄其水平，且所有培養(yǎng)物均有三個(gè)重復(fù)。如前所述進(jìn)行RNA分離以及使用STOR Green的qRT-PCR(5)。在生長(zhǎng)曲線的一個(gè)或兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)以Northern雜交確認(rèn)RNA水平。將上述數(shù)據(jù)與相同條件下對(duì)全細(xì)胞和全細(xì)胞裂解液進(jìn)行的、以頭孢硝基噻吩進(jìn)行的Bla活檢測(cè)相比較。檢測(cè)β -內(nèi)酰胺誘導(dǎo)blaC的能力。在β -內(nèi)酰胺存在和不存在下，在整個(gè)生長(zhǎng)曲線以相同方式對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析。羧芐青霉素可以殺死Bla陰性的Mtb。將50、250和 500 μ g/ml的羧芐青霉素與對(duì)數(shù)早期的Mtb共孵育2小時(shí)，并對(duì)BlaC的轉(zhuǎn)錄水平和全細(xì)胞和全細(xì)胞裂解液中的Bla活性進(jìn)行檢測(cè)。使用商用的Bla(Sigma)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以對(duì)Bla 表達(dá)水平進(jìn)行定量，以相同方法培養(yǎng)的Mtb的blaC突變體作為Bla活性檢測(cè)的陰性對(duì)照。巨噬細(xì)胞中Bla的檢測(cè)基本上，將小鼠巨噬細(xì)胞株J774A. 1以1 X IO4細(xì)胞/孔接種在96孔平底培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。向?qū)?shù)早期的Mtb單細(xì)胞懸液加入不同感染比率(1000至0.001個(gè)細(xì)菌每細(xì)胞)的細(xì)菌，37°C孵育30分鐘。然后以PBS洗滌孔兩次，加入含有200 μ g/ml的丁胺卡那霉素的新鮮培養(yǎng)基，37°C孵育2小時(shí)以殺死胞外細(xì)菌。再以PBS洗滌孔，在分光光度計(jì)檢測(cè)信號(hào)前在含有不同濃度的試驗(yàn)化合物的新鮮培養(yǎng)基中孵育60-180分鐘。在加入化合物以評(píng)價(jià)宿主細(xì)胞透性在檢測(cè)方法中的作用前，向復(fù)孔加入0. 的Triton X-100裂解細(xì)胞。在所有時(shí)間點(diǎn)，對(duì)四個(gè)未處理的孔進(jìn)行檢測(cè)以測(cè)定與細(xì)胞相關(guān)的CFU數(shù)值。通過(guò)熒光顯微鏡確認(rèn)最有效化合物的信號(hào)的定位。以相似方式對(duì)其進(jìn)行顯微鏡分析，但使用八孔腔室培養(yǎng)玻片來(lái)定位信號(hào)，通過(guò)陽(yáng)性信號(hào)測(cè)定細(xì)菌的百分比并評(píng)價(jià)已定位的信號(hào)的強(qiáng)度。生物測(cè)試及藥代動(dòng)力學(xué)研究注射后(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)注射三只小鼠)，在不同時(shí)間間隔(30分鐘、240分鐘、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí))以頸椎脫臼法處死麻醉小鼠。心臟穿刺采集血樣，并迅速摘取組織(腫瘤、心臟、腎臟、肝臟、膀胱、胃、大腦、胰腺、小腸、大腸、肺臟和脾臟)用熒光儀測(cè)量近紅外熒光。數(shù)據(jù)以每克組織的熒光單位爾扔[ "&組織)]表示。g -內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定異種移植腫瘤中Bla的酶濃度按照以下操作流程測(cè)定以預(yù)冷PBS洗滌摘取的腫瘤組織兩次；加入Promega的裂解緩沖液(％il/g組織)，并勻質(zhì)組織溶液；將組織勻漿凍融三次，然后離心收集上清；用熒光底物CCl測(cè)定Bla活性。根據(jù)Qiagen Inc.的RNA提取流程對(duì)cmv-bla轉(zhuǎn)染的腫瘤中Bla的mRNA進(jìn)行確認(rèn)并進(jìn)行RT-PCR分析。cmv-bla轉(zhuǎn)染的腫瘤中觀察到的近紅外信號(hào)與Bla活性相關(guān)，說(shuō)明上述測(cè)量方法是有效的。檢測(cè)體內(nèi)Bla的RNA表達(dá)根據(jù)結(jié)核分枝桿菌RNA標(biāo)準(zhǔn)提取方案(6)提取體內(nèi)表達(dá)的Bla RNA，并運(yùn)行以組成型rRNA基因?yàn)閷?duì)照的qRT-PCR。上述檢測(cè)提供了評(píng)價(jià)Bla在所有組織中表達(dá)水平的一種方法，其獲得的結(jié)果可與觀察到的IVI信號(hào)水平相比較。收集的RNA水平應(yīng)該低于RT-PCR 檢測(cè)到的水平，否則組織中還存在可定量的CFU。RT-PCR前用以線性高保真度擴(kuò)增DNA的phU9聚合酶(Fidelity Systems)擴(kuò)增cDNA，以使擴(kuò)增后的模板水平能夠被定量。體內(nèi)Bla菌株的表汰、穩(wěn)定件和毒力八組Balb/c小鼠(每組4只)以lOO-lOOOcfu/肺進(jìn)行噴霧感染。將細(xì)菌菌株從_80°C貯存解凍，通過(guò)27G注射針頭h產(chǎn)生單細(xì)胞懸液用于噴霧感染。噴霧感染在威斯康星大學(xué)構(gòu)建的可以向肺泡腔內(nèi)直接傳送飛沫核(7-10)的“Madison”室中進(jìn)行。使用設(shè)計(jì)用來(lái)處理毒性結(jié)核桿菌菌株的ABSL3工具實(shí)施Mtb感染。解剖前，感染的小鼠置于比較醫(yī)學(xué)中心的ABSL3容器中飼養(yǎng)。在所有時(shí)間點(diǎn)(1、14、觀和72天)，對(duì)每種菌株(blaC和 WT)感染的一組小鼠(每組4只)進(jìn)行解剖以測(cè)定肺臟和脾臟中的CFU、blaC的RNA水平和Bla活性。如此處所述，以頭孢硝基噻吩測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄水平和Bla活性。對(duì)兩種有望用于IVI的重組菌株在體內(nèi)表達(dá)的重組Bla的穩(wěn)定性及對(duì)毒力的影響進(jìn)行檢測(cè)。如上所述，以lOO-lOOOcfu/肺的噴霧感染12組Balb/c小鼠(每組4只)。在所有時(shí)間點(diǎn)(1、14、觀和72天)，將每種細(xì)菌菌株(野生型、構(gòu)建載體1和構(gòu)建載體2) — 組小鼠(每組4只)進(jìn)行解剖以測(cè)定肺臟和脾臟中的CFU，對(duì)其進(jìn)行組織病理學(xué)研究，并檢測(cè)相應(yīng)構(gòu)建載體的存在及Bla活性。在CFU滴度板上對(duì)至少20個(gè)單個(gè)菌落進(jìn)行Bla檢測(cè)以測(cè)定攜帶構(gòu)建載體的細(xì)菌數(shù)量百分比。檢測(cè)組織勻漿的Bla活性以評(píng)價(jià)剩余Bla的總水平。如此處所述，以頭孢硝基噻吩測(cè)定Bla活性。實(shí)施例2# _胞遍卿臓本H Wl膽去將全能受體Tr、⑶8+ T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞移植到感染BCG的同系小鼠體內(nèi)，采用體內(nèi)發(fā)光成像法(BLI)和圖像引導(dǎo)的活體顯微術(shù)(IVM)對(duì)上述細(xì)胞隨時(shí)間的分布成像。一種體內(nèi)以肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子產(chǎn)生熒光素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠提供了能夠在非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)發(fā)光的組織和細(xì)胞的來(lái)源(11-12)。這種小鼠品系(L2G80具有較強(qiáng)的螢火蟲(chóng)熒光素酶(Fluc)生物發(fā)光，但GFP熒光較弱，所以將其與另一個(gè)淋巴細(xì)胞中有較高GFP表達(dá)和較強(qiáng)GFP熒光的小鼠品系交配。因此，當(dāng)受體體內(nèi)全能細(xì)胞干細(xì)胞和其他細(xì)胞擴(kuò)散、重新分布或清除時(shí)，我們采用BLI對(duì)其空間分布進(jìn)行跟蹤，并且隨后能夠利用GFP 通過(guò)IVM使檢測(cè)到的細(xì)胞可視化。在FVB背景下構(gòu)建L2G85小鼠，所以以FVB/NJ(Jackson實(shí)驗(yàn)室)野生型小鼠作為 L2G85細(xì)胞的受體，以預(yù)防移植細(xì)胞的排斥反應(yīng)。80只FVB/NJ小鼠以含有IO4CFU的BCG的 20μ1生理鹽水滴鼻感染。M小時(shí)時(shí)處死4只小鼠，以測(cè)定感染后肺臟中的初始CFU。感染后14天后再處死4只小鼠進(jìn)行組織病理學(xué)研究以測(cè)定肺臟和脾臟中的CFU。感染后14天時(shí)將剩余的72只小鼠分為4只一組，分別經(jīng)尾靜脈注射L2G85 Tr細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，未注射細(xì)胞的小鼠作為對(duì)照組。在觀天、42天和56天時(shí)按照所述方法(12)在D-熒光素存在下對(duì)包括對(duì)照組在內(nèi)的六組小鼠(每組4只)成像。成像后，利用光纖共焦顯微鏡(Cell-ViZi0，Mauna Kea)通過(guò)活體顯微術(shù)(IVM)對(duì)明顯病變進(jìn)行更詳細(xì)的檢查。IVM使用由成千上萬(wàn)條光纖組成的柔性微探頭。實(shí)施全身麻醉，然后通過(guò)能夠快速愈合的小切口探測(cè)該部位，以避免手術(shù)后需要處死動(dòng)物，并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平上的可視化。成像后處死對(duì)照組小鼠，以測(cè)定注射細(xì)胞的小鼠體內(nèi)觀察到信號(hào)的肺臟和其他器官中的CFU。采集背部、腹部和兩側(cè)圖像以更好地測(cè)定光子發(fā)射的來(lái)源。通過(guò)解剖組織、在
17D-熒光素中孵育新鮮組織并在沒(méi)有重疊組織的條件下對(duì)其成像，上述結(jié)果在另一組動(dòng)物中得到進(jìn)一步的確認(rèn)。通過(guò)熒光顯微鏡觀察表達(dá)GFP的移植細(xì)胞，并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和抗酸染色以鑒定組織中的細(xì)菌和細(xì)胞，以對(duì)所有明顯感染的組織進(jìn)行詳細(xì)的組織病理學(xué)研究。棚中M成遍耐免■龍胞甚·臓象在移植模型下，選用兩種使肉芽腫形成可視化的最佳的細(xì)胞類(lèi)型在活體小鼠中觀察細(xì)菌和宿主細(xì)胞。選取三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別是病變剛好可見(jiàn)、病變完全形成以及能觀察到移植細(xì)胞信號(hào)的最晚時(shí)間點(diǎn)。32只FVB/NJ小鼠以含有IO4CFU的表達(dá)IVI報(bào)告基因(如 tdTomato)的BCG的20 μ 1生理鹽水滴鼻感染。另一組4只對(duì)照小鼠是未感染的。M小時(shí)時(shí)處死4只實(shí)驗(yàn)小鼠，以測(cè)定感染后肺臟中的初始CFU。感染后14天時(shí)再處死4只實(shí)驗(yàn)小鼠，進(jìn)行組織病理學(xué)研究以測(cè)定肺臟和脾臟中的CFU。感染后14天時(shí)將剩余的對(duì)只小鼠分為4只一組，其中12只小鼠經(jīng)由尾靜脈注射能使肉芽腫形成可視化的L2G85細(xì)胞，另外未注射細(xì)胞的12只小鼠作為對(duì)照。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)所述該當(dāng)(12)，在D-熒光素存在下， 對(duì)兩組(每組4只)小鼠(注射細(xì)胞的與未注射細(xì)胞的)成像。成像后，利用光纖共聚焦顯微鏡(Cell-viZic^Maima Kea)通過(guò)活體顯微術(shù)(IVM) 對(duì)明顯病變進(jìn)行更詳細(xì)的檢查。實(shí)施全身麻醉，并通過(guò)小切口探測(cè)該部位。成像后處死對(duì)照組小鼠，以測(cè)定注射細(xì)胞的小鼠體內(nèi)觀察到信號(hào)的肺臟和其他器官中的CFU。通過(guò)解剖組織、在D-熒光素中孵育新鮮組織并在沒(méi)有重疊組織的條件下對(duì)其成像，上述結(jié)果在另一組動(dòng)物中得到進(jìn)一步的確認(rèn)。濾波片組用于檢測(cè)組織中移植細(xì)胞和細(xì)菌報(bào)告基因的信號(hào)。通過(guò)熒光顯微鏡觀察表達(dá)GFP的移植細(xì)胞，并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和抗酸染色以鑒定組織中的細(xì)菌和細(xì)胞，以對(duì)所有明顯感染的組織進(jìn)行詳細(xì)的組織病理學(xué)研究。成像分析利用Xenogen Inc的商用軟件——Living Image——在PC計(jì)算機(jī)上處理采集到的圖像。在全身熒光圖像的腫瘤上標(biāo)出了感興趣區(qū)(ROI)。IVIS成像系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵特征是該系統(tǒng)以美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(National Institute of Standards and Technology, NIST)的可追蹤光譜輻射源進(jìn)行標(biāo)定。通過(guò)考慮通過(guò)光學(xué)器件和光圈(f/ stop)的衰減、成像時(shí)間和像素合并，這種標(biāo)定提供了將CCD攝像機(jī)計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化為個(gè)體表面的輻射的方法。因此，所得到的圖像以表面輻射的物理單位(photons/sec/cmVsr)表示。對(duì)感染小鼠、對(duì)照小鼠和正常組織的ROI綜合信號(hào)(在lphotons/sec單位)進(jìn)行比較(感染小鼠對(duì)照小鼠正常組織的比率)。利用GraphPad Prism 3. 0 (GraphPad Software, San Diego, CA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平設(shè)為P < 0. 05。實(shí)施例3β -內(nèi)酰胺酶熒光底物的檢測(cè)CC1、CC2、CHPQ 禾口 CR2熒光化合物CC1、CC2、CHPQ和CR2對(duì)于在體外的或單個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)Bla活性是有效的。這些探針在被Bla水解前不發(fā)出熒光，在Bla反應(yīng)后發(fā)出熒光(圖1A-1B)。根據(jù)需要，一系列不同的熒光發(fā)射可以選擇用于檢測(cè)Bla =CCl和CC2的藍(lán)色、CHPQ的綠色以及CR2的紅色。這些新型熒光底物比CCF2小，易于制備，使用簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)Bla活性具有高靈敏度，且利于不同的生物樣品中Bla活性的檢測(cè)。
在內(nèi)酰胺的3’碳原子和離去基團(tuán)之間插入烯烴基團(tuán)有助于提高Bla水解的動(dòng)力學(xué)效率。例如，對(duì)CCl而言，kcat值為17 :但其未插入雙鍵的衍生物的k。at值僅為3 ^ 催化效率約提高了 5倍。應(yīng)考慮到，這一設(shè)計(jì)可以作為生成各種各樣的Bla熒光底物的一般策略，包括用于整體動(dòng)物熒光成像的近紅外底物。也應(yīng)考慮到，新型猝滅劑QC-I和近紅外熒光團(tuán)IRDye 800CW可以改進(jìn)探針。此外， 基于IRDye的探針可以通過(guò)磺酸基團(tuán)加成進(jìn)行修飾。CNIRl、CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR 5、CNIR9 和 CNIRlO近紅外/紅外熒光底物有利于對(duì)整體熒光成像的活體動(dòng)物中Bla的表達(dá)成像，因?yàn)榧t外/近紅外線比可見(jiàn)光具有更好的組織穿透能力且光散射更少，被血紅蛋白吸收更少 (13)?；衔?CNIR1、CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR 5、CNIR9 和 CNIRlO 是用于對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中 Bla的表達(dá)成像(圖2A-2B) —系列的近紅外熒光底物。這些底物化合物可以作為構(gòu)建細(xì)胞可透過(guò)性的Bla近紅外熒光底物的參照標(biāo)準(zhǔn)，并能用于檢測(cè)電荷對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)或動(dòng)物體內(nèi)探針的可用性的影響。對(duì)Bla活性的檢測(cè)建立在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)基礎(chǔ)之上。探針包含F(xiàn)RET供體和FRET猝滅劑。為了用于在體成像，熒光團(tuán)在理想的情況下應(yīng)該具有大于650nm的發(fā)射波長(zhǎng)和較低的毒性。吲哚菁染料(Cy5、Cy5.5和Cy7)的發(fā)射波長(zhǎng)為650nm到800nm，并已經(jīng)用于成千上萬(wàn)患者的診斷和治療中，而且據(jù)報(bào)道副作用極小。因此，選擇Cy5作為FRET的供體。研究證明，猝滅基團(tuán)QSY21本身不發(fā)出熒光，但吸收光譜較寬(540nm至730nm，峰值位于660nm)，是Cy5發(fā)射波長(zhǎng)的有效猝滅劑。CNIRl基本上不發(fā)出熒光，但經(jīng)Bla處理后將生成在660nm波長(zhǎng)處發(fā)射強(qiáng)度提高 57倍的強(qiáng)熒光產(chǎn)物(14)。然而，CNIRl本身不是細(xì)胞通透性的，因而不能用于Bla的在體成像。為了提高CNIRl的細(xì)胞膜通透性，將CNIRl與全乙?；腄-葡糖胺偶聯(lián)生成COTR3， CNIR3具有較好的細(xì)胞可透過(guò)性并且能夠用于對(duì)單細(xì)胞中Bla的表達(dá)成像。為提高其可溶性，將兩個(gè)磺酸基團(tuán)加成到QSY21上，即生成CNIR4。CNIR5 和 CNIR6CNIRl至CNIR4均以Cy5為基礎(chǔ)。對(duì)于體內(nèi)動(dòng)物成像而言，Cy5. 5因其發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)而成為首選。因此，我們采用Cy5.5替代了 Cy5，并且合成了圖3A)。最終產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化并以質(zhì)譜表征(計(jì)算出的C122H123N11O39S1質(zhì)量:2687. 98 ；MALDI-MS觀測(cè)到 [M+H]+的質(zhì)量2687. 68)。CNIR5 —旦被激發(fā)，其本身在690nm處發(fā)出微弱熒光，但經(jīng)Bla 處理后，其熒光強(qiáng)度增加9倍以上(圖:3B)。其Bla水解動(dòng)力學(xué)在pH值為7.1的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)中測(cè)定催化常數(shù) k。at = 0. 62士0. 2s、米氏常數(shù)Km = 4. 6士 1. 2 μ M(上述數(shù)值由水解速率對(duì)底物濃度的雙倒數(shù)圖作加權(quán)最小二乘擬合獲得)。其催化效率(kcat/km)為1. 36 X IO5M-1S-10 CNIR5在PBS中非常穩(wěn)定，自發(fā)性水解速率為1. 75X ΚΤ Γ1。CNIR5在小鼠血清中也是非常穩(wěn)定的，即使孵育12小時(shí)之后也幾乎沒(méi)有觀察到熒光的增強(qiáng)。CNIR6是CNIR5的去全乙?；疍-葡萄糖的衍生物，用作對(duì)照。CNIR5也可以通過(guò)以QSY22替代QSY21來(lái)合成(圖3C)。這種合成與CNIR5的合成很相似，并沒(méi)有什么問(wèn)題。QSY22的合成將在下文討論。CNIR7CNIR7是對(duì)CNIR5的修飾，提高了其對(duì)Bla在體成像的靈敏度。用于CNIR5的猝滅
19基團(tuán)QSY21 二磺酸鹽，其最大吸收為675nm，但Cy5. 5發(fā)射峰值位于690nm。因此，與COTR5 一樣，猝滅效率只有90%，其中大部分構(gòu)成了可觀察到的背景熒光。在QSY21和Cy5 (COTRl) 的FRET供體-受體對(duì)中，由于QSY21和Cy5之間光譜重疊較好，其猝滅效率超過(guò)98%。因此，能夠吸收690nm波長(zhǎng)光線的猝滅基團(tuán)能夠更好地猝滅Cy5. 5，降低背景信號(hào)。據(jù)報(bào)道，對(duì)于QSY21而言，當(dāng)二氫吲哚被四氫喹啉取代的時(shí)候，其吸收最大值紅移14nm。因此，通過(guò)用四氫喹啉取代QSY21的二氫吲哚基團(tuán)合成了新結(jié)構(gòu)的QSY21 二磺酸鹽(圖4A-4D)，其最大吸收同樣紅移14nm。由于兩者唯一的結(jié)構(gòu)差異是QSY22包含六元稠環(huán)的四氫喹啉，而QSY21包含五元的二氫吲哚，因此可以使用磺化化學(xué)方法使其在苯環(huán)的相同磺化位置(對(duì)位)上磺化。因此，QSY22 二磺酸鹽應(yīng)該能夠更有效地猝滅Cy5. 5，降低背景信號(hào)。第二，CNIR5的k。at值約為0. 6s—1，較CCl和CCF2小得多。在猝滅劑和Cy5. 5之間插入雙鍵也可以使k。at增大。第三，減小FRET供體Cy5. 5和猝滅劑QSY22 二磺酸鹽之間的距離以提高能量轉(zhuǎn)移效率。CNIR5具有較長(zhǎng)的包含與轉(zhuǎn)運(yùn)體相連的半胱氨酸的連接基團(tuán)。 在新型的CNIR7中，轉(zhuǎn)運(yùn)體與Cy5. 5的其他偶聯(lián)部位相連，因此不再需要較長(zhǎng)的連接基團(tuán)。 此外，用2-氨基苯硫酚取代CNIR5中的4-氨基苯硫酚，可以進(jìn)一步縮短Cy5. 5和猝滅劑之間的距離。圖5A-5B顯示的是肌R底物的最終設(shè)計(jì)、CNIR7及其化學(xué)合成。該合成能夠以更短的路線完成，較CNIR5的合成更加簡(jiǎn)單。CNIR7也可能包括陽(yáng)離子短肽，例如取代全乙?；腄-葡糖胺的TAT序列。使用 D-氨基酸而不是L-氨基酸可以避免肽酶水解。研究證明，陽(yáng)離子短肽(如觸足蛋白同源域的第三個(gè)螺旋(15-16)、HIV-I Rev蛋白和HTLV-I Rex蛋白的基本域以及HIV-I Tat的堿性結(jié)構(gòu)域)能夠透過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜。用于結(jié)核分枝桿菌中Bla成像的籠狀Bla底物Bla籠狀底物(Bluco)的結(jié)構(gòu)(圖6A)包括D-熒光素、螢火蟲(chóng)熒光素酶底物 (Fluc)和β -內(nèi)酰胺及β -內(nèi)酰胺酶底物。D-熒光素的酚羥基基團(tuán)對(duì)其被Fluc氧化至關(guān)重要。當(dāng)酚羥基基團(tuán)直接通過(guò)醚鍵與頭孢菌素的3’位置偶聯(lián)時(shí)，所得到的復(fù)合物是Fluc專(zhuān)一性較差的底物，但仍然是Bla的底物。Bla切開(kāi)的β -內(nèi)酰胺環(huán)的開(kāi)口會(huì)觸發(fā)自發(fā)斷裂， 從而導(dǎo)致3’位醚鍵的斷裂并釋放在發(fā)光作用中能夠被Fluc氧化的游離的D-熒光素。為提高復(fù)合物的穩(wěn)定性，頭孢菌素的硫化物被氧化成亞砜，從而給出最終結(jié)構(gòu)——Bluco0 Bluco的制備能夠通過(guò)多步有機(jī)合成來(lái)完成(圖6Β)。由于Bluco較COTR系列的探針小得多，因此它能夠更好地透過(guò)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁。7位氨基位置上已知的取代可以用來(lái)設(shè)計(jì)用于對(duì)TB中Bla進(jìn)行SREL成像的TB特異性的籠狀熒光底物。通過(guò)插入雙鍵(Bluco2)可以獲得具有較高Keat值的Bluco，也可以通過(guò)使用氨基甲酸酯連接(Bluco3) 來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例4CNIR4、CNIR5、CNIR9 和 CNIRlO 的 FRET 與熒光摻入動(dòng)力學(xué)體外 FRET以CNIR5檢測(cè)大腸桿菌中的Bla活性進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)以測(cè)試CNIR5是否能夠檢測(cè)活菌中的Bla活性。以氨芐青霉素抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，30°C培養(yǎng)過(guò)夜。收集細(xì)胞并用LB培養(yǎng)基洗滌兩次，然后加入500nM的 CNIR50每隔一段時(shí)間采集熒光光譜(激發(fā)波長(zhǎng)640nm)，其數(shù)據(jù)如圖7所示。在測(cè)量的最
20后(t = 160分鐘)，加入純化的Bla溶液以證明CNIR5被完全水解。結(jié)果表明CNIR5能夠檢測(cè)大腸桿菌中的Bla。與之相比，在同樣的條件下使用hvitrogen公司的熒光底物CCF2/ AM時(shí)，未檢測(cè)到LB培養(yǎng)基中大腸桿菌的Bla。FRET 光譜圖8B-8E是探針CNIR4、CNIR5、CNIR9和CNIRlO被Bla分解前和分解后10分鐘時(shí)的FRET發(fā)射光譜。大腸桿菌TEM-I和結(jié)核分枝桿菌Bla-C以CNIR4和CNIR5為底物的動(dòng)力學(xué)表1比較了大腸桿菌TEM-I型β -內(nèi)酰胺酶和結(jié)核分枝桿菌Bla-C型β -內(nèi)酰胺酶以CNIR4和CNIR5為底物的動(dòng)力學(xué)(圖9Α-9Β)。表權(quán)利要求
1.實(shí)時(shí)檢測(cè)個(gè)體中致病菌的方法，包括向所述個(gè)體或其生物樣品中引入所述致病菌的內(nèi)酰胺酶的熒光底物、發(fā)光底物或顯色底物；通過(guò)內(nèi)酰胺酶作用于底物而生成的產(chǎn)物對(duì)所述個(gè)體或樣品成像；和在內(nèi)酰胺酶產(chǎn)物所發(fā)射的波長(zhǎng)獲得信號(hào)；以檢測(cè)所述個(gè)體中的致病菌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括建立發(fā)射信號(hào)的三維重建以確定所述個(gè)體中所述致病菌的位置。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)大于測(cè)量的對(duì)照信號(hào)的發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度， 對(duì)與所述致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)的實(shí)時(shí)診斷。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述病理生理狀態(tài)是肺結(jié)核。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光底物、發(fā)光底物或顯色底物是熒光底物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述熒光底物是COTR2、CNIR3,CNIR4、CNIR5, CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR7-TAT、籠狀熒光素、顯色試劑或它們的衍生物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述致病菌包括擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、分枝桿菌屬、埃希氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬或李斯特菌屬其中的菌種。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中成像波長(zhǎng)為約300nm至約900nm。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中發(fā)射信號(hào)的波長(zhǎng)為約300nm至約900nm。
10.診斷個(gè)體中與致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)的方法，包括向所述個(gè)體給予所述致病菌的內(nèi)酰胺酶的熒光或發(fā)光底物或使其生物樣品與所述致病菌的β-內(nèi)酰胺酶的熒光或發(fā)光底物接觸；通過(guò)β -內(nèi)酰胺酶作用于底物而生成的產(chǎn)物對(duì)所述個(gè)體成像；和在所述產(chǎn)物發(fā)射波長(zhǎng)處實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)的強(qiáng)度；其中大于檢測(cè)的對(duì)照信號(hào)的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)強(qiáng)度與所述病理生理狀態(tài)的診斷相關(guān)聯(lián)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，進(jìn)一步包括建立信號(hào)的三維重建以確定所述致病菌的位置。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，進(jìn)一步包括給予一種或多種有效治療所述病理生理狀態(tài)的治療化合物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括對(duì)所述個(gè)體再次給予所述熒光底物，或使其生物樣品接觸所述的熒光底物；和對(duì)所述個(gè)體或所述生物樣品進(jìn)行成像以監(jiān)測(cè)治療化合物的功效，其中相對(duì)于診斷時(shí)信號(hào)，發(fā)射信號(hào)的降低指示對(duì)所述病理生理狀態(tài)的治療作用。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述病理生理狀態(tài)是肺結(jié)核。
15.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述致病菌包括擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、分枝桿菌屬、埃希氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬或李斯特菌屬其中的菌種。
16.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述熒光底物是CNIR2,CNIR3, CNIR4、CNIR5, CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR7-TAT、籠狀熒光素、顯色試劑或它們的衍生物。
17.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述成像波長(zhǎng)為約300nm至約900nm。
18.如權(quán)利要求10所述的方法，其中發(fā)射信號(hào)的波長(zhǎng)為約300nm至約900nm。
19.篩選能夠有效治療個(gè)體中與致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)的治療化合物的方法，包括選擇所述致病菌的潛在的治療化合物； 使所述細(xì)菌細(xì)胞與熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑接觸； 使所述細(xì)菌細(xì)胞與所述潛在的治療化合物接觸；和在所述潛在的治療化合物存在或不存在的情況下檢測(cè)由所述細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)；其中相對(duì)于所述治療化合物不存在時(shí)的信號(hào)，所述治療化合物存在時(shí)的信號(hào)的降低，指示所述化合物對(duì)所述致病菌的治療效果。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述致病菌是重組菌，所述使細(xì)菌與熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑相接觸的步驟包括利用含有熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生菌。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述表達(dá)載體包含熒光蛋白。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述熒光蛋白是mPlum、mKeima,Mcherry或 tdTomato。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述表達(dá)載體包含β-半乳糖苷酶基因，所述方法進(jìn)一步包括使所述重組菌細(xì)胞與熒光團(tuán)相接觸，所述熒光團(tuán)在β -半乳糖苷酶存在的情況下有效發(fā)出熒光信號(hào)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述熒光團(tuán)是C2FDG、C12RG、DDA0G或它們的衍生物。
25.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述表達(dá)載體包含熒光素酶基因，其中所述方法進(jìn)一步包括使所述重組菌細(xì)胞與D-熒光素相接觸。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述熒光素酶是螢火蟲(chóng)螢光素酶、叩頭蟲(chóng)紅色熒光素酶或rLuc8。
27.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述熒光檢測(cè)試劑是細(xì)菌內(nèi)酰胺酶的熒光底物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述致病菌在體內(nèi)與以下試劑相接觸熒光底物 CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR-TAT、籠狀熒光素、 顯色試劑或它們的衍生物。
29.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述致病菌在體外與以下熒光底物相接觸CC1、 CC2、CHPQ, CR2、CNIRU CNIR6 或它們的衍生物。
30.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述致病菌包括擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、分枝桿菌屬、埃希氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬或李斯特菌屬其中的菌種。
31.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述病理生理狀態(tài)是肺結(jié)核。
32.對(duì)致病菌成像的方法，包括使所述致病菌與其β-內(nèi)酰胺酶的熒光底物相接觸；向所述致病菌施加內(nèi)酰胺酶作用于底物所生成的產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)；獲得所述產(chǎn)物發(fā)出的熒光、發(fā)光或顯色信號(hào)；和建立獲得的信號(hào)的三維重建，從而對(duì)所述致病菌成像。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述致病菌包括擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、分枝桿菌屬、埃希氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬或李斯特菌屬其中的菌種。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中激發(fā)波長(zhǎng)為約540nm至約730nm。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中發(fā)射信號(hào)的波長(zhǎng)為約650nm至約800nm。
36.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述致病菌在體內(nèi)與以下熒光底物相接觸 CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR-TAT、籠狀熒光素、 顯色試劑或它們的衍生物。
37.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述致病菌在體外與以下熒光底物相接觸CC1、 CC2、CHPQ, CR2、CNIRU CNIR6 或它們的衍生物。
38.細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶的熒光底物，即CNIR-7，CNIR7-TAT或它們的衍生物。
39.在個(gè)體體內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)致病菌的方法，包括向所述個(gè)體體內(nèi)引入以Y射線同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記的底物；其中所述底物是所述致病菌特異的β -內(nèi)酰胺酶、其他酶或蛋白的底物；以放射性標(biāo)記底物在作用過(guò)程中發(fā)出的Y射線對(duì)所述個(gè)體成像；獲得由發(fā)出的Y射線產(chǎn)生的信號(hào)；和基于Y射線產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)所述個(gè)體體內(nèi)的放射性標(biāo)記濃度建立三維重建；從而檢測(cè)所述致病菌。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，進(jìn)一步包括基于所述檢測(cè)而實(shí)時(shí)診斷與所述致病菌相關(guān)的病理生理狀態(tài)。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)一步包括給予一種或多種能夠有效治療所述病理生理狀態(tài)的治療化合物。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，進(jìn)一步包括向所述個(gè)體再次給予所述放射性標(biāo)記底物；和對(duì)所述個(gè)體再次成像以監(jiān)測(cè)所述治療化合物的功效；其中相對(duì)于診斷時(shí)的Y射線，Y 射線的下降指示對(duì)所述病理生理狀態(tài)的治療作用。
43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述病理生理狀態(tài)是肺結(jié)核。
44.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述放射性標(biāo)記是正電子同位素，而成像是通過(guò)正電子發(fā)射斷層顯像(PET)。
45.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述放射性標(biāo)記是直接發(fā)射γ射線的同位素，而成像是通過(guò)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(SPECT)。
46.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述其他的酶或蛋白是與β-內(nèi)酰胺酶相似的酶或青霉素結(jié)合蛋白。
47.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述致病菌包括擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、分枝桿菌屬、埃希氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬或李斯特菌屬其中的菌種。
48.適用于PET或SPECT成像的細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶的放射性標(biāo)記的底物。
49.如權(quán)利要求48所述的放射性標(biāo)記的底物，其中所述放射性標(biāo)記是氟-18、氮-13、氧-18、碳-11、锝-99m、碘-123 或銦-111。
全文摘要
本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┝艘幌盗谐上穹椒ㄒ杂糜诎l(fā)現(xiàn)，診斷和影像致病菌或與致病菌相關(guān)的某病理生理狀態(tài)，此方法利用熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑，例如細(xì)菌酶的熒光性底物，籠狀熒光素和熒光蛋白，熒光素酶和重組細(xì)菌表達(dá)的酶類(lèi)。在與細(xì)菌共存的狀況下，由熒光、發(fā)光或顯色檢測(cè)試劑發(fā)出的信號(hào)被用來(lái)與參照組比較，以檢測(cè)和定位致病菌。本發(fā)明申請(qǐng)也提供了一種篩選方法以篩選用以治療上述的病理生理狀態(tài)的治療性藥物，此方法測(cè)量并比較在潛在的治療藥物的存在和不存在的情況下，檢測(cè)試劑發(fā)出的熒光或冷光。另外，本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N以PET和SPECT來(lái)檢測(cè)致病菌的方法，此方法利用該致病菌的β-內(nèi)酰胺酶、其他酶類(lèi)或蛋白的放射正電子的底物或放射γ射線的底物來(lái)檢測(cè)。另外，本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┝藷晒庑缘孜顲NIR-7或CNIR7-TAT或者放射性標(biāo)記的底物。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102369440SQ200980139644
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日
發(fā)明者杰弗里·D·希瑞羅, 饒江洪 申請(qǐng)人:得克薩斯A&M大學(xué)體系, 萊蘭斯坦福初級(jí)大學(xué)評(píng)議會(huì)