專利名稱：控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值、重量克分子滲透壓濃度和溶解二氧化碳水平來增強(qiáng) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程，更特別地涉及通過改善細(xì)胞培養(yǎng)基的過程參數(shù)，包括PH值、重量克分子滲透壓濃度和溶解二氧化碳水平的控制來增強(qiáng)細(xì)胞生長、細(xì)胞密度、細(xì)胞生存力、產(chǎn)物濃度和產(chǎn)物產(chǎn)量的方法。背景
蛋白質(zhì)治療劑和其他生物制品例如單克隆抗體的商業(yè)性生產(chǎn)當(dāng)前一般在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，所述生物反應(yīng)器適合于培養(yǎng)遺傳優(yōu)化的哺乳動(dòng)物、昆蟲或其他細(xì)胞類型的懸浮液。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器一般具有數(shù)百到數(shù)千升工作體積。最常見的全規(guī)模制造廠具有工作體積從約1，000升直到25，000升的工作體積的生物反應(yīng)器。臨床試驗(yàn)的藥物候選物在具有五(5)到幾百升工作體積的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器中生產(chǎn)。優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)最少的時(shí)間量中可能的最高生物產(chǎn)物產(chǎn)量和生物反應(yīng)器規(guī)模擴(kuò)大的相關(guān)的挑戰(zhàn)集中于控制公認(rèn)的關(guān)鍵過程參數(shù)，例如PH值、溶解氧(DO)、溫度、營養(yǎng)物組成和副產(chǎn)物分布、攪動(dòng)分布、氣體噴射方法、營養(yǎng)物進(jìn)料和產(chǎn)物收獲分布。其他過程參數(shù)例如溶解的二氧化碳(dC02)和重量克分子滲透壓濃度(S卩，每千克溶液溶解的顆粒的濃度)的重要性近來才被記錄在文獻(xiàn)中。事實(shí)上，許多商業(yè)的生物反應(yīng)器甚至不具有安裝的裝置來就地測量溶解的二氧化碳水平和/或重量克分子滲透壓濃度，不用說控制和優(yōu)化這些參數(shù)的裝置。取決于商業(yè)性運(yùn)行的規(guī)?！獜臄?shù)百直到25，000升的生物反應(yīng)器體積，過程的規(guī)模擴(kuò)大、優(yōu)化和控制構(gòu)成了不同的挑戰(zhàn)。在高于約1，000升的商業(yè)規(guī)模下，如果可能的話，使用當(dāng)前最好的可獲得的技術(shù)和方法，溶解的二氧化碳水平和重量克分子滲透壓濃度的同時(shí)和單獨(dú)控制變得困難。在生物反應(yīng)器中開始制造規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程之前，一般制備種子培養(yǎng)物接種物。這涉及在孵化器中的一系列燒瓶和/或遞增體積的較小生物反應(yīng)器中培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞，直到可獲得足夠的細(xì)胞用于接種到生產(chǎn)生物反應(yīng)器中。所述過程涉及將細(xì)胞群體從一個(gè)培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)移到更大的培養(yǎng)容器中。一般地，細(xì)胞群體的20%稀釋物被用于每次轉(zhuǎn)移或傳代培養(yǎng)。在孵化器中，具有培養(yǎng)基的燒瓶被夾持在轉(zhuǎn)臺(tái)上來漩渦培養(yǎng)物和促進(jìn)培養(yǎng)基與孵化器中的大氣之間的氣體轉(zhuǎn)移.一般地，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的孵化器設(shè)置在 37°C、5% 二氧化碳(CO2)和高于約80%的濕度水平。類似的溫度和CO2水平用于在生物反應(yīng)器中生長的種子培養(yǎng)物。當(dāng)種子培養(yǎng)物達(dá)到足夠的體積和細(xì)胞密度時(shí)，它被接種到生產(chǎn)生物反應(yīng)器中。在種子培養(yǎng)物接種到生物反應(yīng)器培養(yǎng)基中之后，在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間，參數(shù)例如 PH值、溫度和溶解氧水平被控制到指定的水平。pH值一般通過在過程期間必要時(shí)添加堿性或酸性溶液來控制。通常使用的堿性溶液包括碳酸氫鈉、碳酸鈉和氫氧化鈉溶液。二氧化碳 (CO2)的溶解通常用于實(shí)現(xiàn)更為酸性的pH值。雖然可以獲得其他酸用于控制pH值，溶解的 CO2和碳酸氫鈉組合形成了細(xì)胞培養(yǎng)物的最穩(wěn)定的和有利的緩沖系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的培養(yǎng)基或溶液的優(yōu)選的溫度是約37°C。培養(yǎng)基或溶液中期望的溶解氧水平一般利用安裝在生物反應(yīng)器底部的噴射器通過空氣噴射來實(shí)現(xiàn)，以及利用分解大的空氣/氧氣泡的葉輪攪動(dòng)培養(yǎng)基或溶液來增強(qiáng)氧氣從噴射的氣泡向細(xì)胞培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移。用覆蓋氣體吹掃生物反應(yīng)器頂部空間提供了有限程度的表面氣體交換。不利地，空氣噴射和培養(yǎng)基或溶液的攪動(dòng)可能引起泡沫和對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的剪切損傷，其不利地影響細(xì)胞生存力。在培養(yǎng)基的表面上泡沫的積累也導(dǎo)致進(jìn)一步限制表面氣體交換和降低生物反應(yīng)器的可用的工作體積。商業(yè)規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程可以以三種不同的運(yùn)行方式進(jìn)行用于懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)物的批量模式和進(jìn)料-分批模式，以及用于固定化細(xì)胞的灌流模式。大部分商業(yè)規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程以進(jìn)料-分批模式運(yùn)行。在進(jìn)料-分批模式中，其他的培養(yǎng)基和營養(yǎng)物在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間的不同時(shí)間添加到生物反應(yīng)器，來在初始的生物反應(yīng)器建立之后補(bǔ)充碳源和其他營養(yǎng)物。在任何生物反應(yīng)器用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)之前，一般它必需被消毒和裝備各種探測器，以及用于補(bǔ)充氣體供應(yīng)和導(dǎo)入其他進(jìn)料的連接物。溫度探測器、PH值檢測器、溶解氧探測器和溶解CO2探測器或傳感器被用于實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液的溫度、pH值、溶解氧和溶解CO2水平。此外，細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液樣品可以在選定的間隔時(shí)間從生物反應(yīng)器中抽出來測定細(xì)胞密度和細(xì)胞生存力，以及分析其他特征，例如，代謝物和重量克分子滲透壓濃度。根據(jù)這樣的分析結(jié)果，其他進(jìn)料或其他添加劑可以添加到細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液，以延長細(xì)胞生存力和提高生物制品的產(chǎn)量。當(dāng)細(xì)胞生存力達(dá)到指定的下閾值時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)過程可以停止或關(guān)閉。指定的下閾值常常根據(jù)下游回收和收獲的生物制品的純化的結(jié)果經(jīng)驗(yàn)性地確定。在培養(yǎng)過程期間，哺乳動(dòng)物細(xì)胞展現(xiàn)了三個(gè)階段，S卩，遲緩期、指數(shù)生長期、以及穩(wěn)定或生產(chǎn)期。遲緩期在接種之后立即出現(xiàn)，一般是哺乳動(dòng)物細(xì)胞對新環(huán)境的生理適應(yīng)的階段。在遲緩期之后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞被認(rèn)為處于指數(shù)生長期。在指數(shù)生長期中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞密度隨時(shí)間指數(shù)地提高。在指數(shù)生長期的某些時(shí)點(diǎn)期間，許多細(xì)胞實(shí)際上開始生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)、抗體或生物產(chǎn)物。細(xì)胞密度是指培養(yǎng)物中細(xì)胞的總數(shù)，通常以活細(xì)胞和非活細(xì)胞的密度表示。當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定或生產(chǎn)期時(shí)，活細(xì)胞活躍地產(chǎn)生用于下游收獲的生物產(chǎn)物。在這個(gè)階段，總細(xì)胞密度可能一般保持恒定，但是細(xì)胞生存力(即，活細(xì)胞的百分比)傾向于隨著時(shí)間快速地降低。已知哺乳動(dòng)物細(xì)胞對于細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液中溶解的二氧化碳的量敏感。在指數(shù)生長期期間暴露于過量的二氧化碳水平的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可能展現(xiàn)單克隆抗體或其他期望的生物產(chǎn)物的降低的產(chǎn)生。在接種之前，弱堿性培養(yǎng)基的PH值必需用二氧化碳降低調(diào)節(jié)到最佳值。這個(gè)過程常常導(dǎo)致在許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的遲緩期的開始時(shí)溶解的二氧化碳的升高的水平。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中溶解的二氧化碳來自化學(xué)和生物學(xué)來源。二氧化碳的化學(xué)來源是在細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液內(nèi)發(fā)生的平衡化學(xué)反應(yīng)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液包括含有碳酸氫鈉和/或碳酸鈉的選定量的緩沖溶液。另外，二氧化碳可以直接噴射到弱堿性培養(yǎng)基或溶液中來將肉湯的PH值水平降低到指定水平，通常約7. 0，產(chǎn)生更多的溶解的二氧化碳。二氧化碳的生物學(xué)來源是生物反應(yīng)器內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的呼吸作用的產(chǎn)物。二氧化碳的這種生物學(xué)來源隨著細(xì)胞密度提高，一般在大約生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞密度最大的同時(shí)達(dá)到其最大值。然而，隨著產(chǎn)生更多的二氧化碳，細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值傾向于酸性，從而需要另外的碳酸氫鹽來將細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液的PH值保持在期望的范圍之內(nèi)。為了補(bǔ)償降低PH值的提高的溶解二氧化碳的作用，人們可以添加碳酸氫鈉以將溶液的PH值維持在指定范圍內(nèi)。補(bǔ)償提高的二氧化碳的效應(yīng)的這些手段對哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程具有其他消極后果。首先，溶解二氧化碳水平的任何提高促進(jìn)了細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液重量克分子滲透壓濃度的提高。類似地，調(diào)節(jié)溶液的PH值以補(bǔ)償二氧化碳所需的碳酸氫鈉的添加也提高重量克分子滲透壓濃度。(重量克分子滲透壓濃度代表了每千克溶液溶解的顆粒的量，通常通過冰點(diǎn)下降報(bào)告為mOsm/kg.)添加碳酸氫鈉也將提高容許進(jìn)入溶液的溶解二氧化碳的平衡飽和水平，使得二氧化碳更難以在曝氣過程中除去。本領(lǐng)域已知的是， 溶解二氧化碳的提高的水平或重量克分子滲透壓濃度的提高對細(xì)胞密度或產(chǎn)量具有有害的或消極的影響。然而，二氧化碳水平和重量克分子滲透壓濃度的組合的或協(xié)同的效應(yīng)沒有充分地了解。二氧化碳在水中在7的pH值下解離成碳酸氫根離子僅僅部份二氧化碳保持為非解離狀態(tài)的游離C02。由于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在6. 5到7. 5的范圍內(nèi)的PH值水平下進(jìn)行，從細(xì)胞培養(yǎng)物中除去溶解的二氧化碳因而變得困難。離解的碳酸氫根離子不容易除去，一般必需在可以從溶液中脫除它們之前重新結(jié)合成游離二氧化碳。碳酸氫鈉的任何添加來平衡PH值也將提高溶液中平衡的溶解二氧化碳濃度或飽和水平，使得更加難以物理上除去二氧化碳。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液除去或脫除溶解二氧化碳的常規(guī)方法是通過用空氣或空氣/氧氣/氮?dú)獾幕旌蠚怏w在攪拌罐中噴射細(xì)胞培養(yǎng)物溶液。然而，在攪拌罐中氣體噴射引起對細(xì)胞培養(yǎng)過程的副作用。特別地，在旋轉(zhuǎn)的攪拌器的尖端的氣體-氣泡破裂是高剪切速率的來源，其損傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜，常常足以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。即使當(dāng)損傷是亞致死性時(shí)，在修復(fù)受損的膜期間細(xì)胞生產(chǎn)力受到損害。并且，將空氣或氮?dú)鈬娚涞缴锓磻?yīng)器中產(chǎn)生氣泡，其上升到生物反應(yīng)器內(nèi)溶液的表面，在此氣體被釋放到頂部空間中。在細(xì)胞培養(yǎng)溶液的頂部表面處的氣泡破裂常常比由攪拌器引起的損傷更大地?fù)p害哺乳動(dòng)物細(xì)胞。限制攪拌器速度和限制氣體噴射速率當(dāng)前被看作是避免這樣的損傷和提高細(xì)胞生存力的最佳方式。然而，這些手段都降低了可被除去的二氧化碳的量，不能除去的過量部分還抑制細(xì)胞生長和生存力。在大的商業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器中這些缺點(diǎn)是要克服的特別的挑戰(zhàn)，在所述生物反應(yīng)器中剪切速率隨著葉輪的直徑實(shí)質(zhì)上地提高。并且，大規(guī)模生物反應(yīng)器中更大的靜液壓頭傾向于提高二氧化碳的溶解度，意味著需要除去更多以將溶解的CO2水平維持在最佳范圍內(nèi)。發(fā)明概述
本發(fā)明可以特征在于增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞生長、細(xì)胞生存力、細(xì)胞密度、產(chǎn)物產(chǎn)量和產(chǎn)物濃度的方法，包括步驟(a)在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的生長期或生產(chǎn)期期間將細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳維持在小于10%的溶解二氧化碳濃度的一般穩(wěn)定水平；以及在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的生長期期間將細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度維持在約300 mOsmol/kg和700 mOsmol/kg之間的值。附圖的簡要描述
根據(jù)連同以下的圖畫中呈現(xiàn)的、以下的本發(fā)明的更詳細(xì)的說明，本發(fā)明的上述和其他方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得更加明顯，其中
附

圖1是描繪在具有中度水平重量克分子滲透壓濃度的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行的溶解二氧化碳百分比，其中三個(gè)運(yùn)行包括具有高峰值溶解二氧化碳水平的一個(gè)、具有中度峰值溶解二氧化碳水平的另一個(gè)和具有低峰值溶解二氧化碳水平的第三個(gè)；
附圖2A是描繪附圖1的具有中度重量克分子滲透壓濃度的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中活細(xì)胞密度的圖形；
附圖2B是描繪附圖1的具有中度重量克分子滲透壓濃度的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的按照百分比的細(xì)胞生存力的圖形；
附圖2C是描繪附圖1的具有中度重量克分子滲透壓濃度的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中總細(xì)胞密度的圖形；
附圖3是描繪附圖1的具有中度重量克分子滲透壓濃度的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中生物產(chǎn)物濃度的圖形；
附圖4是描繪具有一般恒定的或穩(wěn)定的重量克分子滲透壓濃度的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩個(gè)不同運(yùn)行的、作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中溶解二氧化碳的百分比的圖形，其中第一個(gè)運(yùn)行包括低的峰值溶解二氧化碳水平，第二個(gè)運(yùn)行包括中度的總體峰值溶解二氧化碳水平；
附圖5是描繪附圖4的具有中度重量克分子滲透壓濃度和一般恒定或穩(wěn)定的溶解二氧化碳水平的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩種不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中活細(xì)胞密度的圖形；
附圖6是描繪附圖4的具有中度重量克分子滲透壓濃度和一般恒定或穩(wěn)定的溶解二氧化碳水平的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩種個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中生物產(chǎn)物滴度或濃度的圖形；
附圖7是描繪哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的生長和生產(chǎn)期期間溶解二氧化碳分布的圖形； 附圖8是描繪其中維持溶解二氧化碳的不同的、但一般恒定的水平的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系另外兩個(gè)不同運(yùn)行中，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中活細(xì)胞密度的圖形；
附圖9是描繪附圖8的具有不同但一般恒定的溶解二氧化碳水平的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中重量克分子滲透壓濃度的圖形；
附圖10是描繪附圖8的具有不同的但一般恒定的溶解二氧化碳水平的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩種個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中活細(xì)胞百分比的圖形；
附圖11是描繪附圖8的具有不同的但一般恒定的溶解二氧化碳水平的過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩種個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中生物產(chǎn)物產(chǎn)量或滴度的圖形；
附圖12是描繪與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相比較的、利用當(dāng)前的動(dòng)力學(xué)氣體控制(DGC)過程的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中溶解二氧化碳的圖形；
附圖13是描繪與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相比較的、利用當(dāng)前的動(dòng)力學(xué)氣體控制(DGC)過程的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞生存力的圖形；
附圖14是描繪與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相比較的、利用當(dāng)前的動(dòng)力學(xué)氣體控制(DGC)過程的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中活細(xì)胞密度的圖形； 附圖15是描繪與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相比較的、利用當(dāng)前的動(dòng)力學(xué)氣體控制(DGC)過程的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中生物產(chǎn)物產(chǎn)量或滴度的圖形；
附圖16是描繪具有變化的重量克分子滲透壓濃度水平的細(xì)胞培養(yǎng)過程中IgG滴度對比峰值(10)2的趨勢的圖表；
附圖17是描繪具有低水平溶解二氧化碳的DGC型細(xì)胞培養(yǎng)過程中IgG滴度對比最大重量克分子滲透壓濃度的趨勢的圖表；和
附圖18是提供了在重量克分子滲透壓濃度和溶解二氧化碳的不同組合的各種細(xì)胞培養(yǎng)過程運(yùn)行期間采集的數(shù)據(jù)的表格。詳細(xì)說明
溶解的二氧化碳、PH值和重量克分子滲透壓濃度關(guān)系
大部分商業(yè)規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)轉(zhuǎn)入進(jìn)料_分批過程，控制以維持相對恒定的重量克分子滲透壓濃度、PH值和溶解二氧化碳水平是幾乎不可能的。在進(jìn)料_分批過程中添加營養(yǎng)物和細(xì)胞強(qiáng)化劑將總是傾向于提高細(xì)胞培養(yǎng)物重量克分子滲透壓濃度，而PH 值和溶解二氧化碳水平在整個(gè)過程中不斷變化。例如，在指數(shù)生長期期間產(chǎn)生的二氧化碳超出了大多數(shù)當(dāng)前的生物反應(yīng)器的二氧化碳脫除能力，引起溶解二氧化碳水平的持續(xù)提高。溶解二氧化碳水平的這種繼續(xù)提高常常需要添加堿來中和溶解二氧化碳對PH值的影響，因?yàn)榭刂萍?xì)胞培養(yǎng)基的pH值被看作是管理任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的最關(guān)鍵參數(shù)之一。提高溶解二氧化碳和添加堿都進(jìn)一步提高了細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液的重量克分子滲透壓濃度。簡而言之，細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液中的PH 值、重量克分子滲透壓濃度和溶解二氧化碳水平都是緊密地相互聯(lián)系的。許多本領(lǐng)域技術(shù)人員相信最低水平的溶解二氧化碳和重量克分子滲透壓濃度將提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的最佳運(yùn)行條件。然而，近期的研究和在此公開的某些經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)另外地表明，溶解二氧化碳的最佳水平和最佳重量克分子滲透壓濃度仍然需要對每種獨(dú)立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)過程來確定。當(dāng)二氧化碳溶于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，它形成HC0” 一種生長的細(xì)胞的關(guān)鍵離子。隨著溶解二氧化碳建立與HC03_離子的平衡，PH值被降低。對HC03_的需求與它的緩沖作用無關(guān)，但是由于二氧化碳、HCO3-和pH值是密切聯(lián)系的，難以限定溶解的二氧化碳的最佳水平和對細(xì)胞生長的直接影響。當(dāng)在開放的容器中孵育細(xì)胞時(shí)，一般使用95%空氣和 5%二氧化碳的氣體混合物。最初根據(jù)在肺的肺泡腔中存在的二氧化碳來選擇二氧化碳的濃度。這種二氧化碳濃度是用于肺成纖維細(xì)胞的研究的，但是現(xiàn)在變?yōu)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的典型的二氧化碳濃度。氣相二氧化碳張力將作為溫度的函數(shù)直接地調(diào)節(jié)溶解二氧化碳的濃度。這種調(diào)節(jié)隨后產(chǎn)生H2CO3,其根據(jù)以下反應(yīng)解離H2O+ CO2 臺(tái) H2Cas · => H + + HCO{...........................(1)
HCO3-具有十分低的解離常數(shù)，僅產(chǎn)生低濃度的氫離子，獲得僅中度降低的溶液ρΗ值。 提高大氣的二氧化碳的凈結(jié)果是通過向右移動(dòng)上述(1)中顯示的平衡的系列來降低PH值。
為了維持固定的PH值，堿，例如碳酸氫鈉被用于中和提高的二氧化碳張力的作用 NaHCO3 臺(tái) Na* + HCO；.............................................(2)
提高的HCO3-濃度抵抗了更高的溶解二氧化碳水平的作用，將上述(1)中的平衡向左側(cè)推動(dòng)，直到平衡可以在碳酸氫鹽系統(tǒng)的PH 7. 4處建立?？傊?，在開放容器中的細(xì)胞培養(yǎng)物需要在二氧化碳的大氣中孵育，其濃度與培養(yǎng)基中的碳酸氫鈉平衡。在密封的燒瓶中生長到中高濃度(IX IO5個(gè)細(xì)胞/mL)的細(xì)胞可能不需要二氧化碳添加到氣相，條件是碳酸氫鹽濃度被保持很低廣4 mM)，特別是如果細(xì)胞是高酸生產(chǎn)者的話。然而，在更低的細(xì)胞濃度下(例如，在克隆或接種期間)，以及對于某些原代培養(yǎng)物，必需向密封燒瓶的氣相添加二氧化碳。當(dāng)需要出口來容許二氧化碳的平衡化或它的逃逸時(shí)(如對于高酸生產(chǎn)者)，必需使覆蓋物保持松弛，或使用二氧化碳可透過的覆蓋物。 孵化器的大部分用95%空氣和5% 二氧化碳的混合物吹掃。在良好控制的生物反應(yīng)器中，將至少在開始時(shí)需要二氧化碳來將培養(yǎng)基ρΗ值調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)闹怠⑿枰渌亩趸紒碇泻头趸髦行〉娜萜髦猩L的接種物，因?yàn)檫@些傾向于具有比生物反應(yīng)器設(shè)置點(diǎn)更高的PH值。使用二氧化碳的這種起始PH值調(diào)整將提高起始批次的重量克分子滲透壓濃度。隨著在分批過程中培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到指數(shù)生長期，它們變?yōu)樽畲蟠x活性的，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生它最大的二氧化碳輸出。當(dāng)細(xì)胞密度低時(shí)，大部分二氧化碳可以通過用空氣噴射發(fā)酵液或用覆蓋氣或空氣吹掃生物反應(yīng)器的頂部空間來除去。然而，進(jìn)入分批循環(huán)幾天后， 二氧化碳產(chǎn)生將超過典型的生物反應(yīng)器的正常二氧化碳清除能力。細(xì)胞產(chǎn)生的過量的二氧化碳將提高溶解二氧化碳水平并降低溶液PH值。為了維持優(yōu)選的ρΗ值，需要添加額外的堿，產(chǎn)生生物反應(yīng)器發(fā)酵液中過多的溶解二氧化碳和不期望的高重量克分子滲透壓濃度。由于二氧化碳產(chǎn)生和脫除速率之間的不平衡的次優(yōu)條件隨著擴(kuò)大到更大的生物反應(yīng)器而變得更為嚴(yán)重。首先，隨著常規(guī)的生物反應(yīng)器大小增加，表面積比體積比降低。對于相同的覆蓋氣比反應(yīng)器體積，在液體表面處二氧化碳去除的有效性被大大降低。優(yōu)選的二氧化碳脫除系統(tǒng)和方法的實(shí)例在美國臨時(shí)專利申請系列號(hào)61/ 086665中公開。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中的ρΗ值優(yōu)化
哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的PH值設(shè)置點(diǎn)可以顯著地影響細(xì)胞培養(yǎng)性能。已知細(xì)胞培養(yǎng)基PH值影響許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的細(xì)胞內(nèi)酶活性。降低的ρΗ值降低了比葡萄糖消耗和乳酸生成率，降低了葡萄糖耗盡的風(fēng)險(xiǎn)或乳酸的毒性水平。在典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中較低的PH值設(shè)置點(diǎn)是約7. 0 ；已知低于約6. 8的ρΗ值抑制細(xì)胞生長。還已知中間或中度PH值影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞的比生長速率和比生產(chǎn)率，其最終影響總體培養(yǎng)物生產(chǎn)力。過低或過高的PH值可能殺死細(xì)胞。約7. 0到7. 4的ρΗ值范圍通常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程。常常在過程期間發(fā)生的PH值的大幅變動(dòng)，例如，當(dāng)重新補(bǔ)足培養(yǎng)基時(shí)，對細(xì)胞具有副作用?？刂撇溉閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的PH值現(xiàn)今是特別重要的，因?yàn)槌Ｒ?guī)地達(dá)到高細(xì)胞密度(>1 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL)。沒有適當(dāng)?shù)腜H值控制，當(dāng)細(xì)胞這樣濃縮時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵液可能快速地變?yōu)樗嵝?。不同類型的哺乳?dòng)物細(xì)胞可能具有不同的生長最佳pH值。一般地，人類成纖維細(xì)胞在比建立的細(xì)胞(pH 7. 0-7. 4)更高的pH值(7. 6-7. 8)下生長，在7. 2-7. 4的pH值下培養(yǎng)原代細(xì)胞是常見的。在低培養(yǎng)密度下人類包皮成纖維細(xì)胞(例如，F(xiàn)S-4)生長的最佳pH 值，比人類肺成纖維細(xì)胞(例如，MRC-5)的生長最佳pH值更為堿性。當(dāng)在約IO5個(gè)細(xì)胞/mL 或更小的密度下培養(yǎng)生長期期間的這些細(xì)胞時(shí)，對于FS-4，pH值應(yīng)當(dāng)是約7. 7到7. 8，對 MRC-5細(xì)胞約7. 5到7. 6。對于CHO細(xì)胞，通常有益的是在附著期間在約7. 0的pH值下培養(yǎng)細(xì)胞。在幾個(gè)小時(shí)之后，CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中的pH值可以提高到稍微更高的值。將細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵液維持在約7. 0或更高的pH值代表了對控制溶解二氧化碳水平的努力的另一個(gè)挑戰(zhàn)。因?yàn)槎趸伎梢耘c水反應(yīng)，它可以以四種形式的任一存在于液相中CO2、H2CO3 > HCCV 和 CO廣。上文式(1)中的平衡關(guān)系表明，在約5.0或以下的pH值下，幾乎所有的溶解二氧化碳是CO2的形式。在約7.0到9.0之間的PH值下，碳酸氫鹽是碳的主要形式。最后，在約11.0或更高的pH值下，幾乎所有的是碳酸鹽。由于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值一般被控制在約PH 7.0到pH 7. 4之間，與其中pH值可以更低得多的微生物發(fā)酵過程相比時(shí)，二氧化碳去除一般是更困難的。為了從pH約7. 0和7. 4之間的細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵液除去溶解二氧化碳，限制步驟可以是化學(xué)的或物理的。由于僅溶解的二氧化碳分子被轉(zhuǎn)運(yùn)跨越氣-液界面，碳酸氫鹽必需重新締合以形成二氧化碳分子。將上文的式(1)分成它的兩個(gè)部分，注意的是，以下作為式 (3)和(4)列出的逆反應(yīng)一般是快速的，而由式(5)代表的反應(yīng)的第一部分是慢得多的。H2CO3 ◎ HCO; + H*..........................................(3)
KJJ=TSfCs) = K Itifc^ ] = 2,5x1 Q-4 moliL...........................(4)
^[H2CO3]K J
h
H2COiCO2+ H2O...................................................(5)
其中 Ii1 = 20 S-1 以及 Ie1 = 0. 03 S-1
PH值的控制是關(guān)鍵的操作條件，因?yàn)樵S多類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)pH值基本上處在 PH7.0和pH7. 4之間的范圍外時(shí)死亡。對于在當(dāng)前的細(xì)胞培養(yǎng)過程控制中固有的限制，主要目標(biāo)是PH值調(diào)節(jié)，而溶解二氧化碳/碳酸氫鹽水平和重量克分子滲透壓濃度基本上不被控制，在培養(yǎng)周期期間顯著變化?？色@得很少的數(shù)據(jù)來展現(xiàn)同時(shí)維持恒定的pH值、溶解二氧化碳和重量克分子滲透壓濃度的益處。培養(yǎng)基必需在兩組細(xì)胞生長條件下緩沖(1)小的開放容器中(例如，孵化器內(nèi)部)，其中二氧化碳可以喪失到大氣中，引起pH值提高，和(2)在生物反應(yīng)器中，此時(shí)由于高細(xì)胞濃度的二氧化碳和乳酸的最大產(chǎn)生引起PH值降低。緩沖液可以摻入到培養(yǎng)基來穩(wěn)定 PH值，但是其他的氣體性二氧化碳仍然是某些細(xì)胞系需要的，特別是在低細(xì)胞濃度下，以防止溶解二氧化碳和碳酸氫鹽從培養(yǎng)基中完全喪失。盡管在生理學(xué)pH值下其不良的緩沖能力，由于其低毒性、低成本和對培養(yǎng)物的營
養(yǎng)益處，碳酸氫鹽緩沖液仍然比任何其他緩沖液更頻繁地使用。因此，二氧化碳在控制PH
值方面的作用仍然是優(yōu)化高細(xì)胞產(chǎn)量和高細(xì)胞生存力的條件時(shí)要考慮的最重要的方面。
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如果作為替代使用另一種堿(例如，NaOH)，凈結(jié)果類似于碳酸氫鹽 NaOH + H2CfJs ￠^ MaHCO3 + H2O ◎ Na+ + HCO3' + H2O............(6)
由于許多細(xì)胞培養(yǎng)基成分在酸性溶液中配制并可以摻入緩沖液，如上述式(6)中的在其他的堿也可能間接地貢獻(xiàn)于碳酸氫鹽水平時(shí)，難以預(yù)測要使用多少碳酸氫鹽。對于Good，s緩沖液(例如，HEPES, Tricine)引入到組織培養(yǎng)中，預(yù)測二氧化碳不再是穩(wěn)定PH值所必需的，因而可以省略。這種預(yù)測被證明是不正確的，至少對于大量的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，特別是在低細(xì)胞濃度下。雖然20 mM的HEPES顯示了將pH值控制在正常的生理學(xué)范圍內(nèi)，大氣二氧化碳的缺少容許化學(xué)式(1)移向左側(cè)，最后從細(xì)胞培養(yǎng)基中消除溶解的二氧化碳，以及最終是HC03_。這種事件鏈看起來限制了細(xì)胞生長，雖然不清楚的是有限的細(xì)胞生長是否是缺乏溶解二氧化碳或缺乏HC03_或這兩者的結(jié)果。另一個(gè)實(shí)例是Leibovitz L_15細(xì)胞培養(yǎng)基，其不使用二氧化碳來緩沖或控制pH 值。當(dāng)需要低的二氧化碳張力時(shí)，優(yōu)選地使用Leibovitz-15細(xì)胞培養(yǎng)基。Leibovitz L_15 含有更高濃度的丙酮酸鈉(550 mg/L)，但是缺乏NaHCO3,不需要?dú)庀嘀械亩趸?。在培養(yǎng)基中包含丙酮酸允許哺乳動(dòng)物細(xì)胞提高它們的二氧化碳產(chǎn)生，使得它們獨(dú)立于外部供應(yīng)的二氧化碳以及HC03_。在Leibovitz L - 15細(xì)胞培養(yǎng)基中的緩沖通過相對高的氨基酸濃度來實(shí)現(xiàn)。然而，從細(xì)胞培養(yǎng)基中消除碳酸氫鹽具有如上文描述的Good’ s緩沖液所見的對細(xì)胞生長的類似的負(fù)面影響。這些緩沖系統(tǒng)類型可以對具有低細(xì)胞密度的小的開口平皿和工作良好，但是在高細(xì)胞密度生物反應(yīng)器中將是非常有害的。目前，大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基利用C02/HC03_緩沖系統(tǒng)，但是它的能力常常不足以防止小的分批過程中PH值朝向細(xì)胞培養(yǎng)周期的結(jié)尾的降低。在生物反應(yīng)器中更大規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，pH值的小的改變可以通過添加 HCO3或提高二氧化碳張力來控制。添加NaOH或HCl將控制更大的改變，但是局部化的細(xì)胞損傷可能由于強(qiáng)堿或酸的添加而引起。由大規(guī)模系統(tǒng)提供的恒定的監(jiān)視和控制機(jī)會(huì)意味著HEPES不再是高細(xì)胞產(chǎn)量所必需的。當(dāng)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)物pH值也可以被控制。在添加緩沖液用于PH值控制時(shí)，應(yīng)當(dāng)小心不顯著地改變細(xì)胞培養(yǎng)基的重量克分子滲透壓濃度。培養(yǎng)基的重量克分子滲透壓濃度顯著地影響細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力。提高的培養(yǎng)基重量克分子滲透壓濃度已經(jīng)顯示了降低比細(xì)胞生長速度，并提高比生產(chǎn)率。初始的培養(yǎng)基重量克分子滲透壓濃度可以根據(jù)培養(yǎng)基配方來預(yù)測。培養(yǎng)基成分之間的相互作用的量一般不會(huì)使重量克分子滲透壓濃度顯著地不同于每種成分的貢獻(xiàn)的總和。典型的培養(yǎng)基的成分的單獨(dú)的重量克分子滲透壓濃度在以下表格中顯示。
權(quán)利要求
1. 一種增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞生長、細(xì)胞生存力、細(xì)胞密度、產(chǎn)物產(chǎn)量和產(chǎn)物濃度的方法，包括步驟在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的生長期或生產(chǎn)期期間將細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳維持在小于10%的溶解二氧化碳濃度的一般穩(wěn)定水平；和在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的生長期期間將細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度維持在約300 mOsmol/kg和700 mOsmol/kg之間的值。
全文摘要
提供了控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中溶解二氧化碳的水平和限制重量克分子滲透壓濃度的方法來增強(qiáng)細(xì)胞生長、生存力和密度，以及提高生物產(chǎn)物濃度和產(chǎn)量。溶解二氧化碳水平和pH值的這種控制以及產(chǎn)生的限制哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中重量克分子滲透壓濃度的能力通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程期間采用可選擇的pH值控制策略和CO2脫除技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。這樣的pH值控制技術(shù)和二氧化碳脫除對哺乳動(dòng)物細(xì)胞很少損害或沒有損害地發(fā)生。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102171331SQ200980139318
公開日2011年8月31日 申請日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日
發(fā)明者A·T·Y·鄭, A·古普塔, B·赫尼克, N·格林特, 周瑩 申請人:普萊克斯技術(shù)有限公司