專利名稱：一種高通量篩選β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性提高突變體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種基于96微孔板及酶標(biāo)儀高通量篩選β “葡聚糖酶熱穩(wěn)定性提高突變體的方 法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
作為可以工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的β-葡聚糖酶，對(duì)酶特性的要求是產(chǎn)酶水平高、 耐熱性好、ρΗ穩(wěn)定、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單等，其中耐熱性和產(chǎn)酶水平是酶工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的 主要問題。目前國內(nèi)應(yīng)用的商品酶制劑除少部分飼用酶制劑屬國內(nèi)生產(chǎn)，其余基本是通過 進(jìn)口或由獨(dú)資外資企業(yè)生產(chǎn)，生產(chǎn)技術(shù)都是商業(yè)機(jī)密。加快進(jìn)行具有獨(dú)立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán) 的葡聚糖酶酶制劑的研究和生產(chǎn)，對(duì)當(dāng)前政府號(hào)召大力發(fā)展生豬養(yǎng)殖，降低老百的 生活消費(fèi)指數(shù)，解決“三農(nóng)”問題都具有促進(jìn)作用，降低糧耗，提高料肉比，對(duì)應(yīng)對(duì)當(dāng) 前世界糧食緊缺狀況具有重大的戰(zhàn)略意義。而國產(chǎn)的酶單位活力和耐熱性普遍低于國外 產(chǎn)品，因而限制了在實(shí)際生產(chǎn)中的運(yùn)用。利用定向進(jìn)化技術(shù)提高酶的熱穩(wěn)定性不僅可拓寬酶的工業(yè)應(yīng)用范圍，而且可以 研究酶結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的關(guān)系。定向進(jìn)化技術(shù)的關(guān)鍵是建立合適的突變體庫和建立有效的 篩選方法。本發(fā)明在建立了突變體庫的基礎(chǔ)上，通過對(duì)細(xì)菌生長、酶表達(dá)量和酶活性等影 響因素的探索，建立了基于酶標(biāo)儀、96微孔板和環(huán)境壓力的熱穩(wěn)定性提高突變體高通量 篩選模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于酶標(biāo)儀、96微孔板和環(huán)境壓力，建立高通量篩選β-葡聚糖酶熱穩(wěn) 定性提高突變體的方法。1.突變體庫的復(fù)制1.1從平板上挑選單個(gè)克隆子菌落接種于含有IOOOmL LB培養(yǎng)基(內(nèi)含30 μ g/ mL卡那霉素)的96深孔板中，每孔對(duì)應(yīng)一特定轉(zhuǎn)化子。每塊深孔板同時(shí)接種野生型克 隆，作為陽性對(duì)照。37°C，200r/min振搖培養(yǎng)12h。1.2在無菌條件下，從96深孔板中取出20 μ L菌液，對(duì)應(yīng)接入含IOOOuL新鮮LB 培養(yǎng)基的另一 96深孔板中，并進(jìn)行37°C，200r/min振搖培養(yǎng)。4°C臨時(shí)冷藏種子96深 孔板。2.文庫的誘導(dǎo)表達(dá)2.137°C，200r/min振搖培養(yǎng)重組菌4h后，每孔加入2g/L IPTG 40 μ L以及 180g/L乳糖100 μ L,混勻后于24°C，200r/min振搖培養(yǎng)6h。在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD6tltl并 保存數(shù)據(jù)后于3000r/min，4°C,離心20min。2.2以每孔一一對(duì)應(yīng)為原則，利用排槍快速移取20 μ L上清粗酶液至兩塊96PCR反應(yīng)板中。3.文庫上清粗酶液的高溫?zé)徕g化3.1將其中一塊含有粗酶液的96PCR反應(yīng)板經(jīng)過80°C金屬浴處理0.5h，另一對(duì)應(yīng) 板4°C冷藏。4.文庫的酶活表征4.1將兩快96PCR反應(yīng)板40°C預(yù)熱IOmin后(利用酶標(biāo)儀加熱模塊)，每孔 中加入40 °C藍(lán)色葡聚糖底物(使用前和pH 6.5的20mmol/L的磷酸緩沖液1 19混 合)80μ ，混勻后40°C反應(yīng)lOmin。每孔中加入300 μ L沉淀液，利用低溫離心機(jī)，于 3000r/min, 4°C,離心20min，利用排槍移上清至兩塊96反應(yīng)板中并測(cè)定OD59tl吸光值。4.2利用酶標(biāo)儀軟件計(jì)算每個(gè)克隆(OD59tl,未鈍化-OD59tl,熱鈍化VOD6tltl的數(shù)值，以陽 性對(duì)照為參考，將結(jié)果高于陽性對(duì)照的克隆挑出并進(jìn)行斜面保藏。4.3粗篩陽性突變體用于下一輪復(fù)篩。以下對(duì)本發(fā)明方法作穩(wěn)定性考察說明利用建立的高通量篩選方法對(duì)本研究室構(gòu)建的工程菌(野生菌)進(jìn)行篩選，共篩選了 192株重組菌(共8個(gè)孔板，每個(gè)孔板利用24孔)，篩選一塊板按一次實(shí) 驗(yàn)計(jì)，共計(jì)8次實(shí)驗(yàn)，其中4次實(shí)驗(yàn)(共96個(gè)菌落)中的粗酶液經(jīng)80°C，0.5h處理，另 外4次實(shí)驗(yàn)未經(jīng)高溫處理。記下最終OD6tltl在所有未經(jīng)高溫處理孔樣OD6tltl平均值士 10% 之內(nèi)菌株數(shù)。利用下列公式計(jì)算該方法的穩(wěn)定性指標(biāo)(a).精密度未經(jīng)高溫處理四組實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(b).重現(xiàn)率=實(shí)驗(yàn)成功次數(shù)/總實(shí)驗(yàn)次數(shù)X 100%(c).假陰性率=1-(未經(jīng)高溫處理0D_落在平均值士 10%之內(nèi)菌落數(shù) /96) X 100%(d).假陽性率=經(jīng)高溫處理后OD6tltl落在平均值士 10%之內(nèi)菌落數(shù)/96X 100%(1)以96微孔板為基礎(chǔ)高通量篩選方法精密度表1以96微孔板為基礎(chǔ)高通量篩選方法精密度
權(quán)利要求
1. 一種高通量篩選β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性突變體的方法，其特征是方法步驟為1.突變體庫的復(fù)制1.1從平板上挑選單個(gè)克隆子菌落接種于含有1000 μ L LB培養(yǎng)基(內(nèi)含30 μ g/mL卡 那霉素)的96深孔板中，每孔對(duì)應(yīng)一特定轉(zhuǎn)化子。每塊深孔板同時(shí)接種野生型克隆，作 為陽性對(duì)照。37°C，200r/min振搖培養(yǎng)12h。1.2在無菌條件下，從96深孔板中取出20 μ L菌液，對(duì)應(yīng)接入含IOOOuL新鮮LB培 養(yǎng)基的另一 96深孔板中，并進(jìn)行37°C，200r/min振搖培養(yǎng)。4°C臨時(shí)冷藏種子96深孔 板。
2.文庫的誘導(dǎo)表達(dá)2.137°C，200r/min振搖培養(yǎng)重組菌4h后，每孔加入2g/L IPTG 40 μ L以及180g/L 乳糖100 μ L，混勻后于24°C，200r/min振搖培養(yǎng)6h。在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD_并保存數(shù) 據(jù)后于 3000r/min，4°C,離心 20min。2.2以每孔一一對(duì)應(yīng)為原則，利用排槍快速移取20 μ L上清粗酶液至兩塊96PCR反應(yīng) 板中。
3.文庫上清粗酶液的高溫?zé)徕g化3.1將其中一塊含有粗酶液的96PCR反應(yīng)板經(jīng)過80°C金屬浴處理0.5h，另一對(duì)應(yīng)板 4°C冷藏。
4.文庫的酶活表征4.1將兩快96PCR反應(yīng)板40°C預(yù)熱IOmin后(利用酶標(biāo)儀加熱模塊)，每孔中加入 40°C藍(lán)色葡聚糖底物(使用前和pH6.5的20mmol/L的磷酸緩沖液1 19混合)80 μ L， 混勻后40°C反應(yīng)IOmin。每孔中加入300 μ Ll沉淀液，利用低溫離心機(jī)，于3000r/min，4°C,離心20min，利用排槍移上清至兩塊96反應(yīng)板中并測(cè)定OD59tl吸光值。4.2利用酶標(biāo)儀軟件計(jì)算每個(gè)克隆(OD59tl,未鈍化-OD59tl,熱鈍化)/OD6QQ的數(shù)值，以陽性對(duì) 照為參考，將結(jié)果高于陽性對(duì)照的克隆挑出并進(jìn)行斜面保藏。 4.3粗篩陽性突變體用于下一輪復(fù)篩。
全文摘要
高通量篩選是一種同時(shí)分析多個(gè)樣本的方式，從大量樣本中挑選出符合目標(biāo)的個(gè)體，目前廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)、酶的發(fā)現(xiàn)和改造方面。體外定向進(jìn)化作為后基因組時(shí)代一個(gè)重要的技術(shù)平臺(tái)正得到日益廣泛的應(yīng)用。定向進(jìn)化技術(shù)在改造酶的熱穩(wěn)定性方面已表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性，而將這一技術(shù)應(yīng)用在β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性定向進(jìn)化上國內(nèi)外尚未有相關(guān)報(bào)道。采用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性改造過程中，如何快速有效地篩選得到目標(biāo)突變體是其瓶頸問題之一。本發(fā)明建立了基于酶標(biāo)儀、96微孔板和環(huán)境壓力的熱穩(wěn)定性提高突變體高通量篩選模型，見附

圖1。該發(fā)明將96微孔板菌落的誘導(dǎo)表達(dá)與菌落的原位復(fù)制技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，以β-葡聚糖酶與藍(lán)色葡聚糖底物作用后釋放藍(lán)色基團(tuán)特性為基礎(chǔ)，以各孔酶反應(yīng)液的吸光值大小為指標(biāo)建立了直觀、快速簡(jiǎn)易的高通量篩選方法。通過該方法可以篩選到熱穩(wěn)定性和催化活性同時(shí)提高的變異體且穩(wěn)定性良好。對(duì)該方法的篩選穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，其精密度良好，RSD為8.1％，重現(xiàn)性達(dá)到100％，假陽性率及假陰性較低，分別為6.25％及2.1％。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK102010887SQ200910264848
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者劉春鳳, 李崎, 李永仙, 秦久福, 鄭飛云, 顧國賢 申請(qǐng)人:江南大學(xué)