專利名稱：與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病基因相連鎖的分子標(biāo)記BoR_AAG/CTC112及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病基因相連鎖的分子標(biāo)記及其獲得的方法，屬于生
物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)球甘藍(lán)在世界各地普遍栽培，也是我國的主要蔬菜作物之一。甘藍(lán)霜霉病是由 專性寄生菌寄生霜霉引起的一種世界性病害，這種真菌性病害常引起幼苗和成株葉片枯 黃，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，給甘藍(lán)生產(chǎn)上帶來極大的損失。為解決上述的重大問題，挖掘 新的抗源，以往育種家們大多借助形態(tài)學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記來輔助育種，經(jīng)篩選已獲得一些 優(yōu)良的抗霜霉病自交系，但在抗病育種和抗病轉(zhuǎn)育過程中用傳統(tǒng)的方法篩選抗性植株時選 育時間較長、操作程序繁瑣；另一方面抗性易受環(huán)境條件的影響，難以適應(yīng)育種實(shí)踐需要。 近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助甘藍(lán)抗病育種顯出巨大潛力。 一類基于 DNA變異的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被國內(nèi)外許多學(xué)者應(yīng)用于甘藍(lán)抗病研究。應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)， 可以免除傳統(tǒng)育種中繁重的選擇過程，而且跟蹤、檢測外源基因，還可以把多個抗霜霉病基 因聚合到同一優(yōu)良品種中，獲得持久抗性。目前，國內(nèi)外對結(jié)球甘藍(lán)霜霉病的研究較少，迄 今還未有與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性基因相連鎖的分子標(biāo)記的報道。因此，尋找與抗性基因緊 密連鎖的穩(wěn)定、簡單的分子標(biāo)記不僅可應(yīng)用到分子輔助育種中，提高甘藍(lán)抗病育種效率，在 農(nóng)業(yè)上有重要的應(yīng)用價值，而且還可以為進(jìn)一步克隆相關(guān)的抗病基因并分析其功能奠定基 礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病基因相連鎖的分子標(biāo)記B0RAAe/ CTC112 及其獲得的方法。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段是該與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病基因相連鎖
的分子標(biāo)記B0RAAG/CTai2為SEQ ID No. 1的序列，序列的長度共191bp。 本發(fā)明所述的分子標(biāo)記B0RAAe/CTai2的獲得方法主要包括以下步驟 1)利用經(jīng)過多代自交選育出的結(jié)球甘藍(lán)的抗病親本'R103'和感病親本'S101'，
將所述抗病親本'R103'和感病親本'S101'進(jìn)行雜交得到&群體，并構(gòu)建相應(yīng)的BQ、F2群
體； 2)根據(jù)田間自然發(fā)病材料的病害癥狀，以及病原物鏡檢和回接鑒定，明確該病害 的病原是十字花科霜霉菌； 3)經(jīng)過對BQ、&群體田間自然誘發(fā)鑒定和苗期人工接種鑒定，進(jìn)行抗病性調(diào)查發(fā) 現(xiàn)在所述BQ、 F2群體中對霜霉病的抗性受單基因顯性控制； 4)利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，運(yùn)用改良BSA法進(jìn)行與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性相關(guān)的差 異片段的篩選；
5)篩選出 一 個AFLP差異片段B0RAAe/CTC，將該AFLP差異片段B0RAAe/CTC轉(zhuǎn)化為 SCAR標(biāo)記BoR雄組n2，設(shè)計的引物為FMG/CTC112 :5—-ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3—和RAAG/CTC112 : 5— -TAGAAAATTTGGACATTCAT-3—;經(jīng)單株驗(yàn)證分析，該SCAR標(biāo)記BoRAAe/CTai2與抗性基因的遺 傳距離為5. 7cM。 本發(fā)明采用AFLP分子標(biāo)記方法對結(jié)球甘藍(lán)抗、感親本及F2分離群體運(yùn)用改良BSA 法構(gòu)建的抗、感池進(jìn)行抗霜霉病標(biāo)記的篩選，然后將得到與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病相關(guān)的差異 片段，該片段實(shí)際長191 bp。將該片段轉(zhuǎn)化為簡單、穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記BoRg^，同時，經(jīng) F2代群體160個單株的SCAR驗(yàn)證，利用Mapmaker/EXP3. 0軟件進(jìn)行分析，BoRMe/CTeil2標(biāo)記 與抗病基因遺傳連鎖距離為5. 7cM。該標(biāo)記可用于結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病的輔助選擇育種。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于 霜霉病是目前影響結(jié)球甘藍(lán)生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病害。本發(fā)明利用AFLP分子標(biāo)記方 法，結(jié)合改良的BSA法得到一個與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性相關(guān)的差異片段，并通過克隆、測 序、引物設(shè)計，將該片段轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定簡單的SCAR標(biāo)記，可直接用于結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病分子 標(biāo)記的輔助選擇育種。利用該分子標(biāo)記，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時間周期長等缺點(diǎn)， 還可以有目的的聚合多個抗霜霉病基因，培育出具有穩(wěn)定抗性的結(jié)球甘藍(lán)品種。同時也可 利用這個新霜霉病抗性基因的分子標(biāo)記克隆抗霜霉病基因，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析， 這對于進(jìn)一步了解結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病的分子遺傳機(jī)理有積極意義。因此，本發(fā)明在結(jié)球甘 藍(lán)育種實(shí)踐及抗病理論研究上均具有重要意義。


圖1是結(jié)球甘藍(lán)霜霉病菌圖，該霜霉病菌為寄生霜霉(Hyaloperonospora); 圖2是兩個親本和兩對抗感池預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖3是AFLP特異條帶的篩選及另一對池和親本的驗(yàn)證譜帶圖； 圖4是SCAR在兩親本、兩對池、FpBQ中的分布譜帶圖； 圖5是SCAR標(biāo)記在抗病單株和感病單株中的分布譜帶圖； 圖6是SCAR標(biāo)記在30份材料中驗(yàn)證譜帶圖； 其中，圖2-6中符號分別表示為 1.抗病親本；2.感病親本；3.第一抗病池；4.第一感病池；5.第二抗病池；6.第
二感病池；7.Fi群體；8.感病親本為回交親本的BQ感病群體；9.感病親本為回交親本的
BQ抗病群體；10.抗病親本為回交親本的BQ ; M :1000bp pUC mix marker ; R :有B0RMe/CTC112特異帶的雜交后代抗病單株； R* :沒有該特異帶，但表型為抗病的雜交后代單株； S :沒有B0RMe/CTC112特異帶的雜交后代感病單株； S* :有該特異帶的感病單株，表型為感病的雜交后代單株。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病分子標(biāo)記B0RMe/CTai2的獲得方法主要包括以下步驟
(1)利用經(jīng)過多代自交選育出的結(jié)球甘藍(lán)的抗病親本'R103'和感病親本'S101'，
4兩者進(jìn)行雜交得到巳群體，并構(gòu)建了相應(yīng)的BQ、 F2群體。根據(jù)田間發(fā)病材料的病害癥狀， 以及病原物鏡檢和回接鑒定，明確該病害的病原是十字花科霜霉菌(即寄生霜霉)。利用田 間自然誘發(fā)抗性鑒定和苗期人工接種抗性鑒定，表明結(jié)球甘藍(lán)對霜霉病的抗性受單基因顯 性控制。 具體做法為對經(jīng)多年選育的結(jié)球甘藍(lán)的抗病親本'R103'和感病親本'S101'整 個生長過程中的霜霉病等病害發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，記載發(fā)病率、病情指數(shù)，并觀察和描述癥 狀。采集'S101'的新鮮病葉，并進(jìn)行處理，培養(yǎng)新生孢子囊產(chǎn)生后，制作臨時鏡檢片，觀察 病菌孢囊梗和孢子囊的形態(tài)特征。另用80% a-羥基丙酸浸泡田間病葉表皮組織，在150 倍顯微鏡下觀察卵孢子形態(tài)特征，重復(fù)試驗(yàn)以明確病原。如圖l所示說明孢子梗和孢子囊 的形態(tài)特征與十字花科寄生霜霉相一致。田間自然誘發(fā)抗性鑒定，采用五點(diǎn)法進(jìn)行調(diào)查抗 病性，對'R103'、 'S101'、F2和BQ群體進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查，調(diào)查級別分為免疫、高抗、抗病、 耐病、感病和高感，并隨機(jī)鏡檢發(fā)病植株的病原菌。田間苗期人工接種鑒定，即在結(jié)球甘藍(lán) 拉十字期，將從感病親本材料上得到的病菌，并進(jìn)行重新培養(yǎng)后，采用孢子懸浮液噴霧法接 種，接種7天后進(jìn)行抗性調(diào)查。 (2)用AFLP分子標(biāo)記方法，得到與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性相關(guān)的差異片段B0RAAe/CTC。
具體做法是抗病親本多代自交系'R103'為抗病基因供體，與多代自交系'S101' 感病材料進(jìn)行雜交，并構(gòu)建F2群體用于研究，用AFLP分子標(biāo)記與改良BSA方法相結(jié)合得到 與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病相關(guān)的差異片段B0RAAC/CTC。
1)采用CTAB法提取與純化甘藍(lán)基因組DNA 具體做法為取結(jié)球甘藍(lán)新鮮的嫩葉0. 5g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提 取緩沖液2% CTAB(2% CTAB，50mmo1 L—1 Tris pH 8. 0，20,1 L—泊DTA， 1 % PVP-360, 1. 4mol L—、aC1，0. 2%疏基乙醇)，充分混勻后，65t:溫浴45min，其間顛倒混勻2次。在 2(TC下，12000rpm離心20min，取上清，加入等體積預(yù)冷的氯仿異戊醇(24 : l)抽提，緩慢 顛倒混勻。在4t:下，12000rpm離心10min，取上清液，加入上清體積2/3預(yù)冷的異丙醇，緩慢 混勻。置于-20。C下培養(yǎng)30min。在4。C下，13000rpm離心10min，棄上清。加入lmL預(yù)冷的 70%乙醇洗滌兩次DNA沉淀，微干。力n 200 ii L TE，溶解DNA，力n 2 y L 10mg *mL—^NAse 37°C 水浴60min，加入等體積200iiL預(yù)冷的氯仿異戊醇(24 : 1)混勻，靜置10min。在4°C 下，12000離心10min，取上清加入1/9體積的3mo1 'L—NaAc， 2倍體積冷的無水乙醇。_20°C 放置30min。在4。C下13000rpm，離心15min，用70%的冷乙醇洗沉淀兩次，再用無水乙醇漂 洗1次，風(fēng)干后，加50 ii L ddH20溶解。紫外分光光度法檢測DNA樣品的濃度及質(zhì)量，0. 8% 的瓊脂糖凝膠(含0. 5% ii g/ ii L Goldview)電泳檢測DNA的質(zhì)量。
2)抗、感基因池的構(gòu)建 具體做法為本發(fā)明采用改良的BSA法分別構(gòu)建抗病池和感病池，用于AFLP引物 的多態(tài)性篩選。F2單株DNA提取后各取極端抗病和感病10個單株DNA等量混合，構(gòu)建1對 抗感池，采用相同的方法另選不同單株構(gòu)建另1對抗感池?？共∮H本'R103'和感病親本 'S103' DNA采用10株混合樣DNA。
(3)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(AFLP)分析 具體做法為AFLP接頭和引物由上海生物工程合成。1對EcoR I和Msel預(yù)擴(kuò)引 物，8個EcoR I和8個Mse I選擇性引物，共構(gòu)成64對選擴(kuò)引物組合進(jìn)行篩選。
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i.酶切基因組DNA取150ng基因組DNA，采用EcoR I和Mse I進(jìn)行雙酶 切。酶切體系2.5U EcoRI 0. 125ii L，2. 5UMse I 0. 25 ii L， 10XY+/TangoBuffer (with 10XBSA)5. Oil L，補(bǔ)dd H20終體系為25ii L。 37。C酶切6h，酶切后于7(TC水浴處理15min
滅活酶。 ii.人工接頭連接在酶切產(chǎn)物中加ddH20 0. 6 ii L， 10X連接Buf f er3. 0 ii L， EcoR I接頭0. 5 ii L， Mse I接頭0. 5 ii L， T4DNA連接酶0. 4 y L，終體系為30 y L。 20。C或室溫連 接過夜。 iii.預(yù)擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增體系25 ii L :ddH20 18. 1 ii L，連接后DNA模板2. 5 ii L， EcoR I 引物(50ng' ii L—"O. 7ii L， Mse I引物(50ng ii L—0 0. 7 ii L， dNTPs (lOmmol L—0 0. 5 ii L， 10XPCR reaction buffer(with Mg2+) 2. 0 ii L， 2U Taq Polymerase 2. 5iiL。預(yù)擴(kuò)增的PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 30s， 56°C 30s， 72°C 60s， 16個循環(huán)。產(chǎn)物在1. 2%的瓊脂糖凝膠(含0. 5% g/ LGoldview)電泳檢測，紫外燈下觀察并拍照，表明基因組DNA酶切充分，接頭連接較 好，可以繼續(xù)進(jìn)行AFLP分析。圖2是第一抗病池3、第一感病池4、第二抗病池5、第二感病 池6的預(yù)擴(kuò)結(jié)果，其中，圖2中的M為1000bp pUC mixmarker。 iV.選擇性擴(kuò)增選擇性擴(kuò)增體系20 ii L :模板(預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物X 50) 0. 5 y L， EcoR I弓| 物(20ng ii L—"O. 25ii L， Mse I引物(20ng ii L—0 1. 5 ii L， d證s (10,1 L—0 0. 4 ii L， 10XPCR reaction buffer(with Mg2+) 2. 0 ii L， 2U Taq Polymerase 0. 5 ii L， ddH20 14. 85ii L。選擇性擴(kuò)增程序?yàn)?4。C預(yù)變性120s，94。C 30s，65。C 30s，72。C 60s，然后每個循 環(huán)退火溫度降低0. 7°C ，經(jīng)13個循環(huán)后，退火溫度降至56 °C ，再進(jìn)行28個以下循環(huán)的擴(kuò)增 94°C 30s，56。C 30s，72。C 60s后72。C延伸420s。產(chǎn)物于6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測， 然后用銀染方法顯色。 V.變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將玻璃板洗滌干凈。干燥后，平板用BindingSilane 擦拭，U型板用Sigmacote處理。將平板平放，取0. 4mm的Space置于左右兩側(cè)，將U型板 壓于其上，夾子固定。配置60mL 6%聚丙烯酰胺凝膠(25.2g尿素+6.8mL 40%的膠原液 +6mL 10XTBE，加水至60mL)的，灌入上述準(zhǔn)備好的玻璃板中(灌入前膠中加入30 y LTEMED 和300iiL10X AP)。插梳子，聚合3h以上或過夜。膠聚合后，將玻璃板安裝在電泳儀上， 60W恒功率預(yù)電泳30min。將AFLP選擇性擴(kuò)增樣品加入等體積的Loading Buffer (98%甲 酰胺，10mM EDTA，O. 25%溴酚藍(lán)，0. 25%二甲苯青)，95。C變性5min，立即置于冰上冷卻。每 份樣品取4 ii L上樣，電泳至距膠底部約10cm處，終止電泳。 Vi.銀染顯色將電泳后的平板放入加有1L固定液(900mL ddH20中加入lOOmL冰醋 酸)的托盤中，輕搖20min。然后用1L ddH20漂洗凝膠3次，每次2min，將玻板取出，讓玻板 豎直滴干10 20s，再用1L染色液(lg AgN03和1. 5mL 37%甲醛溶于1L ddH20中)染色 30min，隨后用1L ddH20漂洗1次，立即將膠置于預(yù)冷的顯色液(30g Na2C03溶于1L ddH20 中，冰浴至l(TC，顯色前加入l. 5mL 37X甲醛和200iiL 10mg'mL—^S^)中，輕搖顯色，直 至膠上大部分條帶都清晰出現(xiàn)。最后在顯色完成后，用1L ddH20漂洗凝膠2次，每次2min， 將玻板取出自然晾干或?qū)⒛z面放于通風(fēng)廚中充分干燥，可以用照相機(jī)拍照或用掃描儀進(jìn)行 掃描成像。 我們利用64對引物對抗、感池進(jìn)行了 AFLP分析，發(fā)現(xiàn)在引物組合EcoRI-AAG/ Msel-CTC的擴(kuò)增產(chǎn)物在抗病池中出現(xiàn)特異條帶。圖3是該引物組合擴(kuò)增的結(jié)果，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，此帶仍能穩(wěn)定出現(xiàn)，由此說明這條特異帶可能與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性存在聯(lián)系。
3) AFLP差異片段轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記B0RAAG/CTC112 具體做法是為了將AFLP分析得到的差異片段B0RMe/CTC轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定簡單的SCAR 標(biāo)記，將該差異片段用上海生物工程公司的UNIQ-5柱離心式DNA膠回收試劑盒純化，純化 的DNA片段與PGEM*-Teasy Vector (Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Jml09，重組質(zhì)粒PRC產(chǎn) 物電泳檢測，EcoRI酶切鑒定，獲得陽性克隆子，送Sangon測序。將測序結(jié)果用生物信息學(xué) SMS進(jìn)行分析，并通過Internet與GenBank國際基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析。經(jīng)雙端測序 后，該片段共由191bp組成。該序列為SEQ ID No. l的序列。由于從GenBank沒有查詢到 相關(guān)的基因與該片段同源，該片段可以認(rèn)為是結(jié)球甘藍(lán)'R103'中與抗霜霉病相關(guān)的新的片 段。 根據(jù)克隆片段的DNA序列，我們合成了一對SCAR標(biāo)記引物，該對引物序列如下
F雄/面2 :5— -ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3— RMG/CTC112 :5—-TAGAAAATTTGGAAAGTTCAT-3— 用上述引物在抗感親本、2對抗感池、巳、群體中分別進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 IOXPCR反應(yīng)緩沖液2ii L(with Mg2+) ， dNTP (lOmmol L—0 0. 4 ii L，引物1 (10 ii M) 0. 5 ii L，引 物2 (10 ii M) 0. 5 ii L， 5U Taq E 0. 2 ii L，模板DNA (50ng ii L—0 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L，總體積 20ii L ;反應(yīng)程序?yàn)?4。C 180s，94。C 30s，53。C 30s，72。C 30s，35個循環(huán)，72。C 420s，。擴(kuò)增 產(chǎn)物在1. 2%的瓊脂糖凝膠(含O. 5% i！ g/ii L Goldview)上電泳檢測，紫外反射投射分析 儀觀察并照相。擴(kuò)增結(jié)果證明，在抗病親本、2個抗病池、、以抗病親本為回交親本的BQ和 以感病親本為回交親本的抗病群體中均擴(kuò)增出110bp左右的一條特異帶，而在感病親本、 感病池和以感病親本為回交親本的感病群體中沒有檢測到這條特異帶。由此說明AFLP得 到的差異片段確實(shí)與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性有關(guān)。具體可參看圖4。 結(jié)球甘藍(lán)抗病親本'R103'和感病親本'S101'雜交構(gòu)建的&分離群體中，經(jīng)田 間自然鑒定后的抗、感單株分別提取總DNA，用上述同樣的反應(yīng)體系及程序，用上述SCAR引 物進(jìn)行單株的PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計抗、感單株標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計算交換值，用 M即maker EXP3. 0b計算標(biāo)記與抗霜霉病基因之間的遺傳距離。結(jié)果顯示(圖5所示)，96 個抗病單株中有94株存在特異帶，2株沒有特異帶；35株感病單株中5株有特異帶，其他的 均沒有特異帶。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明特異SCAR標(biāo)記是與結(jié)球甘藍(lán)抗病性是緊密連鎖的，但在 抗病和感病單株中有一定的交換，交換率為5. 3% ，經(jīng)計算SCAR標(biāo)記BOR雄/cTcm與抗病基因 的遺傳距離為5. 7cM。如圖5所示R是有B0RMe/erai2特異帶的雜交后代抗病單株；R*是沒 有該特異帶，但表型為抗病的雜交后代單株，表明發(fā)生了交換；S是沒有B0RAAe/CTai2特異帶 的雜交后代感病單株，SA是有該特異帶的感病單株，表型為感病的雜交后代單株，表明也發(fā) 生了交換。 為了檢測這個SCAR標(biāo)記的可靠性，我們用20份多代自交所得的材料進(jìn)行驗(yàn)證。10 份抗病材料中都有該特異帶，10份抗病和感病雜交材料中也可以擴(kuò)出該條帶，在10份感病 材料中有1份中得到了特異條帶。如圖6所示R是有B0RMe/CTai2特異帶的雜交后代抗病 材料；S是沒有B0RAAe/CTai2特異帶的雜交后代感病材料，S*是有該特異帶的感病材料，表型 為感病的感病材料，表明該SCAR標(biāo)記可直接用于結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗病育種。
上述實(shí)施用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。 與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病基因相連鎖的分子標(biāo)記BoRMe/CTC112序列表 〈110>浙江大學(xué) 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 〈120〉與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病基因相連鎖的分子標(biāo)記BoRAAG/CTC112及其獲得方法 〈160〉1 〈170>PatentIn version 3. 1 〈210>1 〈211〉 191 <212>DNA 〈213〉結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea var. c即itata L ) 〈400〉 1 gactgcgtec caattcaagg cttctgtgag agctcaggga teactcgaca tcctectggt 60 ccatectcac cgcagcag朋tggagtegte gagcgtcgaa acagaaccct tctcgagatg 120 actaggagca taatgaaaca tatgaatgtt ccaaattttc tatgggggga aggagttact 180 caggactcat c 191
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權(quán)利要求
一種與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病基因相連鎖的分子標(biāo)記BoRAAG/CTC112，其特征在于為SEQ ID No.1的序列，序列的長度共191bp。
2. —種權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記BoR皿/^^的獲得方法，其特征在于包括以下步驟1) 利用經(jīng)過多代自交選育出的結(jié)球甘藍(lán)的抗病親本'R103'和感病親本'S101'，將所 述抗病親本'R103'和感病親本'S101'進(jìn)行雜交得到巳群體，并構(gòu)建相應(yīng)的BQ、F2群體；2) 根據(jù)田間自然發(fā)病材料的病害癥狀，以及病原物鏡檢和回接鑒定，明確該病害的病 原是十字花科霜霉菌；3) 經(jīng)過對BQ、&群體田間自然誘發(fā)鑒定和苗期人工接種鑒定，進(jìn)行抗病性調(diào)查發(fā)現(xiàn)在 所述BQ、F2群體中對霜霉病的抗性受單基因顯性控制；4) 利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，運(yùn)用改良BSA法進(jìn)行與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性相關(guān)的差異片 段的篩選；5) 篩選出 一 個AFLP差異片段B0RAAe/CTC，將該AFLP差異片段B0RMe/CTC轉(zhuǎn)化為SCAR 標(biāo)記BoRMG/CTC112，設(shè)計的引物為FMG/CTC112 :5:ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3—和RAAG/CTC112 : 5— l-TAGAAAATTTGGACATTCAT-3—;經(jīng)單株驗(yàn)證分析，該SCAR標(biāo)記BoRMe/CTai2與抗性基因的遺 傳距離為5. 7cM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與結(jié)球甘藍(lán)抗霜霉病基因相連鎖的分子標(biāo)記BoRAAG/CTC112及其獲得方法。該分子標(biāo)記為SEQ ID No.1的序列，長度共191bp。其獲得方法如下將結(jié)球甘藍(lán)的抗病親本‘R103’和感病親本‘S101’雜交得到F1群體并構(gòu)建相應(yīng)的BC1、F2群體；明確該病害的病原是十字花科霜霉菌；進(jìn)行抗病性調(diào)查發(fā)現(xiàn)在BC1、F2群體中對霜霉病的抗性受單基因顯性控制；利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)及改良BSA法進(jìn)行與結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性相關(guān)的差異片段的篩選，得到AFLP差異片段BoRAAG/CTC并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記BoRAAG/CTC112，設(shè)計的引物為FAAG/CTC1125`-AT CCTACTGGTCCATACTCAC-3`和RAAG/CTC1125`-TAGAAAATTTGGACATTCAT-3`；該SCAR標(biāo)記BoRAAG/CTC112與抗性基因的遺傳距離為5.7cM。該分子標(biāo)記簡單穩(wěn)定，克服了常規(guī)育種方法周期長等缺點(diǎn)；可有目的的聚合多個抗霜霉病基因，培育出具穩(wěn)定抗性的結(jié)球甘藍(lán)品種。
文檔編號C12Q1/68GK101748211SQ20091015294
公開日2010年6月23日 申請日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者余小林, 曹家樹, 李建斌, 王神云 申請人:浙江大學(xué);江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所