專利名稱：水稻抗稻瘟病基因Pi 25的特異性分子標記及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于鑒定水稻抗病基因的分子生物學領域，特別是檢測水稻抗稻 瘟病基因的分子標記及其專用引物。
背景技術：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國第一大糧食作物。稻瘟
病是由子囊菌尸j^icyZarj's grises (無性世代 synonymous 尸jric〃Jarj.3 oryzse Cav.; 有性世代teleomorph船卵3/ orz^7e 弓l起的廣泛發(fā)生 在世界各稻區(qū)最主要的水稻病害之一。據(jù)統(tǒng)計，從1975年至1990年的16年 間，由稻瘟病引起的全球糧食損失高達1.57億噸，平均每年近一千萬噸；自 20世紀90年代以來，我國水稻稻瘟病年發(fā)病面積均在300萬公頃以上，年損 失稻谷產(chǎn)量數(shù)十萬噸。
目前，通常采用化學防治和種植抗病品種來控制這種病害?；瘜W防治既 昂貴又缺乏長期有效的殺菌劑，還由于污染環(huán)境和農(nóng)藥殘留而對人類健康構 成潛在的烕脅?？沟疚敛∑贩N的應用是最經(jīng)濟有效的防病措施，但由于稻瘟 病小種遺傳的多樣性和致病性的快速衍變，攜帶單抗性主基因的水稻新品種 往往于推廣后一至數(shù)年后就喪失其抗病能力。 一般認為，多基因聚合有利于 選育具有持久抗瘟性的水稻品種。在國內(nèi)外水稻品種資源的鑒定、評價和利 用研究中，也發(fā)現(xiàn)極少數(shù)水稻材料長期以來在人工接種和自然鑒定條件下都 表現(xiàn)出對稻瘟病的良好抗性，這種稱之為持久抗瘟性水稻資源的發(fā)掘和利用越來越得到重視。經(jīng)典遺傳分析和基因定位研究結果表明，持久抗瘟性水稻 材料的稻瘟病抗性一般由多個主效基因控制，且微效基因對其抗性也具有一
定作用，但前人研究所應用的Moroberekan和Tet印等抗性資源因農(nóng)藝性狀 劣而難以直接應用于育種。
谷梅2號為對國內(nèi)外稻瘟病小種有廣譜和穩(wěn)定抗性的水稻品種，是全國 稻瘟病研究協(xié)作網(wǎng)從38000份水稻資源中篩選出來的唯一一份半矮桿秈稻， 具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀和廣泛的抗性育種利用價值。利用谷梅2號和感病品種 中156配制雜交組合，采用單粒傳法構建了 304個單株組成的重組自交系， 利用該重組自交系群體對谷梅2號的稻瘟病抗性遺傳進行了深入的研究，鑒 定和定位了尸i ^《尸i /V I和尸i ZT四個稻瘟病抗性主基因和十多個 QTL。發(fā)現(xiàn)谷梅2號穩(wěn)定和持久的抗瘟性是由多個主基因和微效基因共同作用 的結果，針對不同的稻瘟病小種由不同的主基因和微效基因起作用，特殊情 況下，微效基因之間存在互作。
尸2'25是一個苗葉瘟和穗瘟兼抗的基因，位于水稻第6染色體上。為精細 定位該主效基因，從中156/谷梅2號重組自交系群體中挑選兩個株系G19(抗 病)和G153 (感病)構建了一個新的重組自交系(含1487個株系)對Wi^ 進行精細定位，利用圖位法和生物信息學法，最終將& 25定位于A7和RG456 之間，并確定編碼一個NB-ARC的基因為候選基因，利用農(nóng)桿菌介導的方法， 將候選基因轉入感病的粳稻品種日本晴，發(fā)現(xiàn)61%的轉基因植株具有稻瘟病抗 性，說明該候選基因即為主效基因/V^乂由于谷梅2號是已經(jīng)改良過的半矮 稈秈稻品種，具有廣譜和穩(wěn)定抗性，意義非常特殊，其克隆出的抗稻瘟病基 因A 25可直接在稻瘟病抗性育種中應用。常規(guī)的抗稻瘟病育種需要進行抗性鑒定，設計接種條件、季節(jié)安排等、 費時費力，且結果不是十分可靠，多數(shù)育種工作者不具備自己安排的能力。 而通過現(xiàn)代DNA分子標記輔助選擇手段，大多數(shù)育種家的實驗室都具備條件， 進行關鍵材料的基因型鑒定。因此開發(fā)Ai^基因特異性分子標記，成本低、 使用方法簡單有效，可提高育種家把抗性基因轉移到恢復系，保持系或常規(guī) 品種中的速度，可以降低育種成本、縮短品種培育周期、提高基因利用效率 和創(chuàng)造更高的社會經(jīng)濟效應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檢測水稻抗稻瘟病基因尸ii^的分子標記P25-l，以 提高分子標記輔助選擇的效率和新品種培育的效率。
水稻抗稻瘟病基因尸i^ 的分子標記，它是用引物對SEQ IDN0:1和SEQ ID N0:2從水稻總DNA中擴增出來的核苷酸序列。
獲得權利要求1所述水稻抗稻瘟病基因A' i^的分子標記的引物對SEQ ID N0:1和SEQIDN0:2， SEQ ID N0:1核苷酸序列為GGACAGAGCAGGAACTTCAGATG， SEQ ID NO: 2的核苷酸序列為TTCTGGGTCTCAGGCGTACT。
本發(fā)明的特異性PCR引物對中，SEQ ID N(hl為上游端，自5'端至3， 端的核苷酸序列為GGACAGAGCAGGAACTTCAGATG, SEQ ID N0:2為下游端，自5， 端至3'端的核苷酸序列為TTCTGGGTCTCAGGCGTACT。該引物對能對水稻苗期 所提取的DNA進行標記鑒定，檢測是否具有抗稻瘟病基因/^i^，檢測的準確 性高，操作簡單。由于上述引物對是基于基因內(nèi)部抗感單核苷酸多態(tài)性(SNP) 差異設計的，理論上，準確率達到100%。因此，該分子標記可以作為水稻稻
5瘟病抗性育種中尸i i^基因分子標記輔助選擇的應用。


圖1是分子標記P25-1在等位基因間擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 其中，M: 100bp分子量標記(Toyobo，Lot No:53240A3)， 200ng;
l:谷梅2號；2:中156; 3: G19; 4: G153; 5:日本晴；6:中花ll;
R代表抗病，S代表感病。(擴增產(chǎn)物片段大小約為776bp。)
圖2是分子標記P25-1在日本晴轉基因植株的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 其中，M: 100bp分子量標記(Toyobo, Lot No:53240A3), 200ng;
l:谷梅2號；2:中156; 3: G19; 4: G153; 5:日本晴；6:中花ll;
7-25分別表示19個以日本晴為背景的轉基因單株。R代表抗病，S代表感病。 圖3是分子標記P25-1在重組自交系單株里擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 其中，M: 100bp分子量標記(Toyobo，Lot No:53240A3)， 200ng;
1-21分別表示21個重組自交系群體的單株。
圖4是分子標記P25-1在中花11轉基因植株的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖。 其中，M: 100bp分子量標記(Toyobo，Lot No:53240A3)， 200ng; l:谷梅2號；2:中花ll; 3-21分別表示19個轉基因植株的單株。
具體實施例方式
本發(fā)明分子標記P25-l的具體應用包含純實驗室技術部分和對含有W 基因的轉基因材料及育種群體水稻材料的檢測。它的應用不限于以下實例。實施例1: P25-1檢測時的DNA提取、PCR擴增和電泳分析
—、DNA提取:
1. 把2cm長的葉尖剪到1.5-ml離心管中，蓋緊蓋子，標上號碼，置于冰上。
2. 把葉尖剪成0.5cm長的小段，放入研缽中。
3. 加入400W提取液(Tris-Hcl 50mM， pH 8. 0: EDTA 25mM， pH 8. 0; NaCl 300mM; SDS 1%)，研磨。
4. 再加入400W提取液，混勻，吸取400W到原來的1.5-ml離心管中。
5. 加入400W氯仿，混勻，12000rpm離心1分鐘。
6. 小心吸取上清夜至一新的1. 5-ml離心管中，標上號碼。
7. 加入800W無水乙醇，混勻，12000rpm離心3分鐘，棄上清。
8. 沉淀用75%乙醇洗滌后，自然風千。
9. 用50^LTE (Tris-Hcl lOraM， pH 8.0; EDTA lmM， pH 8.0)溶解沉淀。 保存于-20° C。
10. 取IW用于PCR擴增反應。 二、 PCR擴增
PCR擴增反應在PCR擴增儀上進行。
1. 反應體系如下
1W10XPCR緩沖液(鼎國DH332-1) /10W; 0. 5幽SEQ ID NO : 1上游 引物/,l; 0. 5幽SEQ ID NO :2下游引物/10Pl; 0. 5單位Taq DNA聚合酶 (鼎國DH332—1)/10Pl; DNA/娜1。
2. 溫度循環(huán)條件如下反應條件94°C 2分鐘；94°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45分鐘，30個 循環(huán)；72°C 5分鐘；4°C 10分鐘。 三、PCR產(chǎn)物檢測
接通電極，在100V恒定電壓下電泳，當溴酚藍遷移至足夠分離DNA片段 時(60min)，關閉電源。
取下凝膠，用2XGel redTM (Biotium， cat: 41003-0. 5ml)染色30分 鐘后，應用凝膠圖象分析系統(tǒng)Bio-red Universal Hood II (Bio-red, Cat: 76S/08184)記錄結果，如圖1所示。
實施例2:轉W 25基因日本晴植株的P25-1標記檢測
共對25個轉基因日本晴植株提取DNA，進行如實施例1所述的檢測過程。 結果顯示25個材料里共16個擴增出谷梅2號等位基因帶型；而稻瘟病接種 實驗結果表明，在這16個材料里，15個個體表現(xiàn)對稻瘟病毒性小種抗性，只 有1個表現(xiàn)為感病(如圖2所示)。標記和表型的吻合度為93. 7 %。
實施例3:來自中鑒100/谷梅2號的重組自交系W i"5基因的檢測
對來自中鑒100/谷梅2號的重組自交系(F8)的195個株系提取DNA， 進行上述檢測過程。在檢測的195個植株里，有86個出現(xiàn)谷梅2號的帶型， 與理論值97.5差異不顯著(P<0.05)(如圖3所示)。
實施例4:轉"25基因中花11的基因型檢測。
對中花11轉W ^"基因82個單株提取DNA，進行上述檢測過程。在檢測的82個植株里，有56個出現(xiàn)谷梅2號的帶型，(如圖4所示)。序列表
〈110>中國水稻研究所
〈120〉水稻抗稻瘟病基因Pi25的特異性分子標記及其專用引物 〈130> 〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 23
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 1
ggacagagca ggaacttcag atg 23
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212> DNA 〈213>人工序列
〈400〉 2
ttctgggtct caggcgtact 20
10
權利要求
1、水稻抗稻瘟病基因Pi 25的分子標記，其特征在于它是用引物對SEQID NO1和SEQ ID NO2從水稻總DNA中擴增出來的核苷酸序列。
2、 權利要求1所述水稻抗稻瘟病基因A 25的分子標記在鑒定抗稻瘟病品種中的應用。
3、 獲得權利要求1所述水稻抗稻瘟病基因尸ii^的分子標記的引物對SEQID N0:1和SEQ ID N0:2，其特征在于SEQ ID N0:1核苷酸序列為GGACAGAGCAGGAACTTCAGATG ， SEQ ID NO :2 的核苷酸序列為TTCTGGGTCTCAGGCGTACT 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻抗稻瘟病基因Pi 25的分子標記P25-1，它是用引物對SEQ ID NO1和SEQ ID NO2從水稻總DNA中擴增出來的核苷酸序列，可以應用于水稻稻瘟病抗性育種中Pi 25基因分子標記輔助選擇，以提高分子標記輔助選擇的效率和新品種培育的效率。本發(fā)明還公開了獲得P25-1的引物對SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，SEQ ID NO1核苷酸序列為GGACAGAGCAGGAACTTCAGATG，SEQ ID NO2的核苷酸序列為TTCTGGGTCTCAGGCGTACT。該引物對能對水稻苗期所提取的DNA進行標記鑒定，檢測是否具有抗稻瘟病基因Pi 25，檢測的準確性高。
文檔編號C12Q1/68GK101643790SQ20091015261
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月7日 優(yōu)先權日2009年9月7日
發(fā)明者吳建利, 莊杰云, 施勇烽, 潔 陳 申請人:中國水稻研究所