專利名稱：甘藍(lán)tt10基因家族及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)及其親本物種白菜(Brassica rapa)和甘藍(lán)(Brassica oleracea) TTlO (TRANSPARENT TESTA 10，透明種皮10 ；又稱LAC15，即LACCASE 15，漆酶15)基因家族及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞植物品種，為人類提供營養(yǎng)價(jià)值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜是由2個(gè)二倍體物種白菜和甘藍(lán)通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍(lán)型油菜是世界第二大油料作物，在全世界廣泛種植，栽培面積和產(chǎn)量僅次于大豆。白菜和甘藍(lán)也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)功能基因的比較基因組學(xué)研究將為揭示它們之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應(yīng)用基礎(chǔ)。籽粒顏色是甘藍(lán)型油菜的重要性狀之一。甘藍(lán)型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅粕蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)，與黑籽品系相比，餅粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和油的品質(zhì)都有所提高。雖然白菜和甘藍(lán)中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界中不存在天然的甘藍(lán)型油菜黃籽基因型。已有的甘藍(lán)型油菜黃籽材料主要通過遠(yuǎn)緣雜交等方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負(fù)相關(guān)性狀難以克服等缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘藍(lán)型油菜黃籽性狀成為甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)。長期以來，全世界眾多研究者對該性狀進(jìn)行了廣泛研究，但到目前為止對于黃籽性狀形成的分子機(jī)理仍不清楚。擬南芥(Arabidopsisthaliana) TTlO (AtTTIO，At5g48100)基因位于擬南芥的第 5染色體上，是通過候選基因的方法從透明種皮(TRANSPARENT TESTA, TT)突變體ttlO中鑒定出來的。ttlO種子在收獲時(shí)種皮呈淺褐色，在合點(diǎn)區(qū)呈深褐色，在貯藏6 12個(gè)月后， 突變體的種皮逐漸恢復(fù)為野生型種皮的深褐色。與野生型種子相比，ttlO突變體種子表現(xiàn)為發(fā)育過程中的褐變延遲。AtTTlO基因編碼漆酶15(AtLacl5)，既參與種皮中原花青素 (proanthocyanidin,PA)氧化聚合成褐色的種皮色素，也參與種皮中木質(zhì)素(Iignin)單體氧化聚合成木質(zhì)素。蕓薹屬和擬南芥同屬十字花科，可能具有相同的色素位點(diǎn)。原花青素是形成甘藍(lán)型油菜黑籽顏色的基礎(chǔ)，在黃籽種皮中明顯降低。木質(zhì)素含量也是甘藍(lán)型油菜的重要性狀之一，在十字花科的黃籽系中明顯低于在褐籽或黑籽中的含量，與十字花科的黃籽表型密切相關(guān)。因此，在蕓薹屬中對TTlO基因進(jìn)行同源克隆和功能鑒定，將有助于揭示甘藍(lán)型油菜種皮色素和木質(zhì)素的分子機(jī)理，是篩選甘藍(lán)型油菜黃籽位點(diǎn)的重要途徑。蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬年前發(fā)生分離，蕓薹族植物發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，5^Mbp)、甘藍(lán)(CC組，696Mbp) 和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當(dāng)于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍(lán)型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當(dāng)于甘藍(lán)和白菜兩個(gè)基因組之和，則約相當(dāng)于擬南芥基因組的6倍。也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍(lán)和白菜中可能分別有3個(gè)對應(yīng)的拷貝，而在甘藍(lán)型油菜中可能有6個(gè)拷貝。目前，TTlO基因在甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)中的成員數(shù)、蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性及與黃籽性狀的關(guān)系等都未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO
基因家族。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，分別克隆了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族成員的全長CDNA和對應(yīng)的基因組序列，并對其進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示所述白菜TTlO (BrTTlO)基因家族包括以下3個(gè)成員BrTT10_lA基因、BrTTlO-IB 基因和BrTT10-2基因；所述BrTTlO-IA基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示， BrTTlO-IB基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 4所示，BrTT10-2基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 6 所示；所述甘藍(lán)TTlO (BoTTlO)基因家族包括以下2個(gè)成員=BoTTlO-I基因和 BoTTlO-Ipse 基因；所述BoTTlO-I 基因的全長 cDNA序列如 SEQ ID No. 8 所示，BoTTlO-Ipse 基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 9所示；所述甘藍(lán)型油菜TTlO(BnTTlO)基因家族包括以下3個(gè)成員&ιΤΤ10_1基因、 ΒηΤΤ10-2基因和&1ΤΤ10-3基因；所述BnTTlO-I基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 11所示，BnTT10-2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 12所示，ΒηΤΤΙΟ-3基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 14 所示。進(jìn)一步，所述BrTTlO-IA基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTTlO-IB基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示，BrTT10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTTlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示；所述&ιΤΤ10_1基因的基因組序列如 SEQ ID No. 10所示，ΒηΤΤ10-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 13所示。BrTTlO-IA基因與BrTTlO-IB基因的序列極其相似，可能互為一對等位基因。 BoTTlO-Ipse假基因與BoTTlO-I基因的序列一致，但在編碼區(qū)發(fā)生2處單堿基缺失，導(dǎo)致提前終止突變，二者可能互為一對等位基因。根據(jù)基因序列和表達(dá)模式的分析，BnTTlO, BrTTlO和BoTTlO基因家族成員可分為兩種類型BnTT10_3和BrTT10_2基因?yàn)镮型基因， 它們與AtTTlO的同源性更高，可能參與原花青素聚合物的進(jìn)一步氧化以及木質(zhì)素的聚合反應(yīng)；其它基因?yàn)镮I型基因，各成員之間具有較高的序列同源性，可能參與原花青素的聚合反應(yīng)。生物信息學(xué)預(yù)測表明，BnTT10、BrTT10和BoTTlO基因家族的正常編碼蛋白序列中存在多銅氧化酶家族的3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和4個(gè)銅離子結(jié)合基序Ll L4，與其它高等植物漆酶蛋白之間具有很高的同源性，由此預(yù)測&1TT10、BrTTlO和BoTTlO基因家族編碼漆酶。 TTlO基因主要在甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)發(fā)育的種子中表達(dá)，在黑、黃籽近等基因系發(fā)育階段尤其是后期轉(zhuǎn)色階段的種子中有差異表達(dá)，不同的基因成員表現(xiàn)出不同的黑、黃籽差異表達(dá)模式。根據(jù)基因序列分析、組織特異性表達(dá)和在黑、黃籽近等基因系之間的表達(dá)差異， 可以推斷甘藍(lán)型油菜的foiTTlO-1、BnTT10-3基因分別來自于白菜的BrTTlO-IA和BrTT10_2 基因，而甘藍(lán)型油菜的&1TT10-2基因則來自于甘藍(lán)的BoTTlO-I基因?；谏鲜鼋Y(jié)果，利用本發(fā)明的&1TT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構(gòu)建TTlO基因重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化體，用于TTlO基因的正義表達(dá)、反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族在甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明選取甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族特異保守片段BTTlOA (核苷酸序列如SEQ ID No. 11中第653 1604位堿基所示)作為反義片段，將其反義插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子和Nos終止子之間，構(gòu)建了 BnTTlO.BrTTIO和BoTTlO基因家族共抑制的反義抑制表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸侵染法轉(zhuǎn)入3個(gè)不同的甘藍(lán)型油菜品種，得到了抑制內(nèi)源TTlO轉(zhuǎn)錄本效果為0 83%的轉(zhuǎn)基因株系，且3個(gè)品種轉(zhuǎn)基因材料的表型修飾效應(yīng)一致。研究發(fā)現(xiàn)，在&1TT10基因家族表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因株系中，種子的著色明顯晚于對照，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)色延遲，種皮中可溶性原花青素含量增加，而種皮木質(zhì)素含量降低，證明&1TT10基因家族參與了甘藍(lán)型油菜的種皮著色、種皮原花青素單體的聚合和種皮木質(zhì)素的合成。發(fā)明人在前期研究中已發(fā)現(xiàn)TT12 等多個(gè)基因家族在甘藍(lán)型油菜黃籽材料中的表達(dá)均有下調(diào)，因此推測&1TT10基因的表達(dá)下調(diào)參與了黃籽性狀的形成，但它本身不是最源頭上的黃籽主要位點(diǎn)，而是受黃籽主效基因調(diào)控的效應(yīng)基因之一。&1TT10基因家族在種皮成熟轉(zhuǎn)色、種皮木質(zhì)素含量等種子性狀的分子育種中具有應(yīng)用價(jià)值，但必須對包括&1TT10在內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行操作。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TTlO基因在甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性等，并確認(rèn)了 TTlO基因參與了種皮著色、種皮原花青素單體的聚合和種皮木質(zhì)素的合成，為受黃籽主效基因調(diào)控的效應(yīng)基因之一，由此本發(fā)明提供了 TTlO基因在蕓薹屬作物種皮成熟轉(zhuǎn)色、種皮木質(zhì)素含量等種子性狀的分子育種特別是甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用，應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)第一鏈cDNA的獲得，其中M為DNA marker, A、B、 C分別為甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)。圖2為&1TT10、BrTTlO和BoTTlO基因家族成員全長cDNA的擴(kuò)增，其中a、b、c分別為甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)M為DNA marker, 1 9為分別采用9種引物組合擴(kuò)增所得 PCR 產(chǎn)物，d 為 BrTT10-2 和 &ιΤΤ10_3 基因全長 cDNA。
圖3為&1TT10、BrTTlO和BoTTlO基因家族成員的Southern雜交鑒定。圖4為&1TT10、BrTTlO和BoTTlO家族蛋白及AtTTlO蛋白的氨基酸序列比對。圖5為&1TT10、BrTTlO和BoTTlO家族蛋白與其它植物漆酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中 ApLACl 為山槭漆酶 1 (AAB09228)，AfLAC 為黃曲霉漆酶(XP_002378028)，AtTTlO 為擬南芥 TT10(NP_199621)，AtLAC 12 為擬南芥漆酶 12 (NP_196158)，AtLAC 13 為擬南芥漆酶 13(NP_196330)，AtLAC 14 為擬南芥漆酶 14(NP_196498)，CmLAC 為板栗漆酶(ACI46953)， 0sLAC2為水稻漆酶2 (Q8RYM9)，0sLAC9為水稻漆酶9 (Q6Z8L2)，PtLACl為火炬松 (AAK37823)，PtLAC2 為火炬松(AAK37824)，RcLAC 為蓖麻(XP_002527130), SlAOX 為番茄抗壞血酸氧化酶(AAY47050)，ZmLAC3為玉米漆酶3 (NPJ)Ol 105915)；進(jìn)化樹分支上的數(shù)字表示靴值檢驗(yàn)的百分率(1000次重復(fù))。圖6為RT-PCR檢測&iTT10、BrTT10和BoTTlO基因家族總體和各成員在不同組織
器官中的表達(dá)。圖7為RT-PCR檢測&iTT10、BrTTlO和BoTTlO基因家族總體和各成員在黑、黃籽
近等基因系生殖器官中的表達(dá)。圖8為&iTT10、BrTT10和BoTTlO基因家族反義抑制表達(dá)載體ρΒΤΤΙΟΑ的元件圖。圖9為轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜植株的PCR鑒定，其中a為轉(zhuǎn)基因ffestar，b為轉(zhuǎn)基因中油821，c為轉(zhuǎn)基因中雙10號；上排擴(kuò)增引物為FGUS+RGUS，下排擴(kuò)增引物為 F35S3N+FTT10A。圖10為轉(zhuǎn)基因和對照甘藍(lán)型油菜種子中&1TT10基因家族及各成員的表達(dá)量檢測，其中a為T2代轉(zhuǎn)基因和對照Westar種子中&ιΤΤ10基因的總體表達(dá)，b為T2代轉(zhuǎn)基因和對照中油821種子中&1TT10基因的總體表達(dá)，c為T2代轉(zhuǎn)基因和對照中雙10號種子中 BnTTlO基因的總體表達(dá)，d為T2代轉(zhuǎn)基因和對照Wfestar種子中&ιΤΤ10基因家族各成員的表達(dá)。圖11為轉(zhuǎn)基因和對照甘藍(lán)型油菜種子的轉(zhuǎn)色過程，其中a為轉(zhuǎn)基因和對照(CK) 中油821種子，b為轉(zhuǎn)基因和對照(CK)中雙10號種子。圖12為轉(zhuǎn)基因和對照ffestar T3種皮的可溶性原花青素含量(a)和不可溶性原花青素含量(b)，其中V-10、V-12、V-13為轉(zhuǎn)基因陽性株系，BnTTlO基因表達(dá)受到抑制；V-22 為轉(zhuǎn)基因陽性株系，但&1TT10基因表達(dá)未收到抑制；V-24為對照株系，BnTTlO基因表達(dá)正常汀2寸為T2代轉(zhuǎn)基因陽性株系J2-CST1代轉(zhuǎn)基因陽性株系的T2代分離陰性株或反義片段丟失的株系。圖13為轉(zhuǎn)基因和對照Wfestar種皮的可溶性木質(zhì)素含量，其中V-10、V-12、V-13、 V-22、V-24、T2-P 和 T2-C 的含義同圖 12。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實(shí)施例采用的植物材料白菜材料均來自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp. oleifera)，包括典型黑籽品系06K130以及黃、黑籽近等基因系09L597 (黑籽)和09L600 (黃籽)；甘藍(lán)材料均來自于羽衣甘藍(lán)變種(B. oleracea var. acephala)，包括典型黑籽品系06K158以及黃、黑籽近等基因系09甘1 (黑籽)和09甘4 (黃籽)；甘藍(lán)型油菜材料包括典型黑籽保持系5B以及黃、黑籽近等基因系09L588 (黑籽)和09L587 (黃籽)，均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供，大田常規(guī)種植；甘藍(lán)型油菜黑籽模式材料Westar和黑籽商業(yè)品種中油821DH系由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供，黑籽雙低商業(yè)品種中雙 10號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供。優(yōu)選實(shí)施例采用的主要試劑及試劑盒Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Easy-Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)、DL-2000 plus Marker、 PEASY-T3載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000、λ -HindIII digest DNA Marker.rTaq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)和 Ex Taq Hot Start DNA 聚合酶(5U/ μ 1)、pMD18-T 和 pMD19_T 載體、RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內(nèi)切酶DraI、EcoRI、EcoRV、SacI(10U/y 1)購自美國New England Biolabs 公司；限制性內(nèi)切酶 BamHI 和 SacI(10U/μ 1)、T4 DNA 連接酶(lOU/μ 1) 購自立陶宛 MBI Fermentas 公司；MS (Murashige & Skoog medium, including vitamins) 基本培養(yǎng)基購自荷蘭Duchefa Biochemie公司；pGEM_T easy載體購自Promega公司；柱式小量植物組織RNA抽提試劑盒、小量膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，GeneRacer Kit購自美國hvitrogen公司，Southern雜交試劑、檢測試劑盒、尼龍膜、地高辛標(biāo)記的DNA Marker購自德國Roche公司。優(yōu)選實(shí)施例采用的主要儀器PTC-200Programmable Thermal Controller PCR 儀購自美國MJ Research公司，Veriti 多重控溫PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；UVP HL-2000雜交紫外交鏈儀購自美國UVP公司，Bio-Rad Model 785真空轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司，以及分子生物學(xué)和基因工程的其它常規(guī)儀器和設(shè)備?！⒏仕{(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族的克隆1、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)基因組總DNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜06K130和甘藍(lán)06K158的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。1. 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的3個(gè)物種的基因組總DNA完整性好，平均分子量均大于λ -HindIII DNA Marker的231Λ條帶，RNA消化比較完全，經(jīng)分光光度法檢測純度較高，可以直接用于PCR擴(kuò)增及Southern雜交。2、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)各器官總RNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜06K130和甘藍(lán)06K158的蕾(Bu)、 花(Fl)、開花后10天的種子(IOD)、開花后20天的種子(20D)和開花后30天的種子(30D)； 以及大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜09L587和09L588、白菜09L600和09L597、甘藍(lán)09 甘4和09甘1的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St), Bf (Le)、蕾、花、莢果皮(SP)以及發(fā)育不同階段的種子(甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)取15D、30D、45D和55D的種子；白菜取10D、 25D、40D和45D的種子)共12個(gè)器官；采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒提取各器官總 RNA，采用電泳法和分光光度法評價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。1. 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得的總RNA特征條帶清晰，且無明顯RNA降解和DNA污染，經(jīng)分光光度法檢測純度較高，能夠滿足RACE操作的基本要求。
3、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)RACE第一鏈cDNA的獲得分別取甘藍(lán)型油菜5B、白菜06K130和甘藍(lán)06K158的蕾、花和3個(gè)發(fā)育時(shí)期的種子的總RNA混合成總量為5 μ g的RNA樣品，采用GeneRacer Kit按其說明書進(jìn)行一系列的 RACE操作，最終反轉(zhuǎn)錄獲得在3’端和5’端同時(shí)錨定有人工接頭序列的第一鏈cDNA，PCR 放大后進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，三個(gè)物種的總cDNA呈現(xiàn)出大小在200bp 101Λ的拖帶，重心區(qū)域在11Λ 41Λ，說明反轉(zhuǎn)錄比較完全，得到了較高質(zhì)量的 cDNA,可用于克隆甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族完整的cDNA末端。4、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族5’ cDNA末端的克隆通過Vector NTI Advance 9. 0 對 AtTT10/AtLacl5 基因以及其它 16 個(gè)漆酶 (AtLacI-AtLac 14、AtLacl6和AtLacl7)基因序列進(jìn)行多重比對，選取AtTTlO基因與其它擬南芥漆酶成員核酸序列中的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)了 2條正向引物(FTT10-31和FTT10-32)和2 條反向引物(RTT10-51和RTT10-52)(表1)作為擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族成員cDNA末端的基因特異引物(GSP)。分別以甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)第一鏈cDNA為模板，用引物組合5，P+RTT10-51進(jìn)行 5，cDNA 末端的 RACE—擴(kuò)。50 μ 1 標(biāo)準(zhǔn) Taq PCR 擴(kuò)增體系為10 X PCR Buffer 5μ 1, 25mmol/L 的 MgCl23 μ 1,10mmol/L 的 dNTPs 1 μ l,10ymol/L 的正向引物 1 μ l,10ymol/L 的反向引物1 μ 1，5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，加雙蒸水至總體積為50 μ 1。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，52°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共 25個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。表15’和3’ RACE中的基因特異引物和GeneRacer試劑盒引物
引物名稱引物序列(5’-3')GeneRacer 5'PcgactggagcacgaggacactgaGeneRacer 5'NPggacactgacatggactgaaggagtaGeneRacer 3'PgctgtcaacgatacgctacgtaacgGeneRacer 3’ NPcgctacgtaacggcatgacagtgRTT10-51ctatgcgcgtgccaccaaacagtRTT10-52tgccaccaaacagtcgtgtcttcFTT10-31cctatgcatctccatggttttagcttFTT10-32ttctatgtggttggagtagggttcgg 以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用引物組合5，NP+RTT10-52進(jìn)行5，cDNA末端的RACE巢擴(kuò)， PCR擴(kuò)增體系與一擴(kuò)相同但模板改為0. 1 μ 1，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘；再94°C 變性1分鐘，43 48°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用小量膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，與T 載體(pMD18-T或pMD19-T)連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5 α或JM109)感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培養(yǎng)至藍(lán)白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp 的LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果陽性克隆子表現(xiàn)出明顯的長度多態(tài)性，每個(gè)物種挑選8 9個(gè)代表性單克隆子委托上海英竣生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明&ιΤΤ10基因家族得到長度分別為405 (2種序列)、409、374和379bp [均不包括poly (A)，下同]的5個(gè)5，cDNA末端，NCBI BLASTn分析表明它們與AtTTlO基因 (NM_124184)具有很高的同源性，可能分別代表2種不同的5，cDNA末端；BrTTlO基因家族得到長度分別為346、357、374、379、405 (2種序列)、406和409bp的8個(gè)5，cDNA末端，表現(xiàn)為差異明顯的兩種類型，但都與AtTTlO基因具有較高的同源性；BoTTlO基因家族得到長度分別為379(2種序列)、398、405、409和411bp的6個(gè)5，cDNA末端，均與AtTTlO基因有較高的同源性，可能代表2種不同的5’ cDNA末端。5、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族3，cDNA末端的克隆分別以白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，用引物組合3，P+FTT10-31進(jìn)行3，cDNA末端的RACE —擴(kuò)。PCR擴(kuò)增體系和程序與5，cDNA末端的RACE —擴(kuò)相同。以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用引物組合3，NP+FTT10-32進(jìn)行3，cDNA末端的RACE巢擴(kuò)， PCR擴(kuò)增體系和程序與5’cDNA末端的RACE巢擴(kuò)相同。PCR產(chǎn)物如前法所述進(jìn)行電泳檢測、 膠回收、T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測序。測序結(jié)果表明&ιΤΤ10基因家族得到長度分別為430 (4個(gè))、407和387bp的6個(gè)3，cDNA末端，NCBI BLASTn分析表明這些3’cDNA末端與AtTTlO基因具有很高的一致性，表明它們的確為&1TT10基因家族的3’ cDNA末端，但這些不同長度的片段序列一致，可能代表同一種 3’ cDNA末端，片段長度差異是由可變poly (A)加尾位點(diǎn)所引起；BrTTlO基因家族得到長度分別為448 (2個(gè))、449 O個(gè))、403、390和377bp的7個(gè)3，cDNA末端，這些3，cDNA末端與 AtTTlO基因具有很高的一致性，可能代表2種3，cDNA末端；BoTTlO基因家族得到長度分別為430、430、388和390bp的4個(gè)3，cDNA末端，均與AtTTlO基因一致性較高，可能代表2 種3，cDNA末端。6、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族成員全長cDNA的克隆根據(jù)所獲得的&1TT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族5，和3，cDNA末端序列，設(shè)計(jì)了 3 條正向引物(FBNTT10、FBRTT10、FBOTT10)和 3 條反向引物(RBNTT10、RBRTT10、RBOTT10) (表幻，將所有正向引物與反向引物兩兩配對，形成9種引物組合。分別以甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)第一鏈cDNA為模板，采用上述引物組合和50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴(kuò)增體系，擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)TTlO基因家族各成員的全長cDNA ；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，再94°C變性1分鐘、57°C退火1分鐘、72°C延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 分鐘；PCR產(chǎn)物如前法所述進(jìn)行電泳檢測(圖幻、膠回收、T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測序。結(jié)果分別得到&1TT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族的3條、3條和8條全長cDNA序列，合并相同的基因序列，并設(shè)計(jì)特異檢測引物，經(jīng)過篩選、驗(yàn)證及補(bǔ)充克隆后，將不同的獨(dú)立基因(imigenes)分別命名為&ιΤΤ10-1、ΒηΤΤ10-2、 BrTT10-lA、BrTT10_lB、BoTTlO-I 和 BoTT10_lpse。經(jīng)過分析和比對，發(fā)現(xiàn) BrTTlO 基因家族獲得的一個(gè)5’ cDNA末端沒有擴(kuò)增獲得相應(yīng)的3’ cDNA末端和全長cDNA序列，針對該末端設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案以白菜第一鏈cDNA為模板，以該5，cDNA末端的對應(yīng)引物FBRTT10 與GeneRacer 3，NP配對，用Ex Taq Hot Start進(jìn)行擴(kuò)增，獲得相應(yīng)的全長cDNA，命名為BrTT10-2 ；再設(shè)計(jì)相應(yīng)的3，cDNA末端引物RBRTT10-I與FBRTT10配對，擴(kuò)增BnTTlO, BoTTlO基因家族的相應(yīng)cDNA，獲得&1TT10-3，而甘藍(lán)中沒有獲得相應(yīng)基因。由于BrTT10_2、 &1TT10-3的基因序列與AtTTlO基因序列具有更高的同源性，因此將此類基因定義為I型基因，其它基因則定義為II型基因。多重序列比對的分析結(jié)果表明這些基因的全長cDNA序列與AtTTlO基因有很高的同源性，且都存在與它們對應(yīng)的3’和5’ RACE末端。表2BnTT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族成員全長cDNA和基因組序列擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
1.甘藍(lán)TTlO基因家族，其特征在于包括以下2個(gè)成員=BoTTlO-I基因和BoTTlO-Ipse 假基因；所述BoTTlO-I基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示，BoTTlO-Ipse假基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 9所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)TTlO基因家族，其特征在于所述BoTTlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示。
3.含有權(quán)利要求1或2所述的甘藍(lán)TTlO基因家族中任一種或多種基因或基因保守片段的重組表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求1或2所述的甘藍(lán)TTlO基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用，所述種子性狀為種皮成熟轉(zhuǎn)色和種皮木質(zhì)素含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘藍(lán)TT10基因家族，包括BoTT10-1基因(SEQ ID No.7～8)和BoTT10-1pse假基因(SEQ ID No.9)；該基因家族可應(yīng)用于蕓薹屬作物種子性狀的分子育種。
文檔編號C12N15/63GK102492695SQ201110459818
公開日2012年6月13日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者盧坤, 張凱, 曲存民, 李加納, 柴友榮, 梁穎, 王敬喬, 王瑞, 陳薇 申請人:西南大學(xué)