專利名稱：利用油菜基因組間雜種優(yōu)勢(shì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種利用油菜基因組雜種優(yōu)勢(shì)的方法。其國(guó)際專利分類號(hào)為A01H 1/02。
遺傳學(xué)研究已經(jīng)證明，雙二倍體的甘藍(lán)型油菜(AACC)、芥菜型油菜(AABB)和埃塞俄比亞芥(BBCC)是由蕓苔屬的三個(gè)基本種，即白菜或白菜型油菜(AA)、黑芥(BB)和甘藍(lán)(CC)兩兩雜交后自然加倍產(chǎn)生的。這一歷程發(fā)生的年代久遠(yuǎn)，長(zhǎng)期的隔離、選擇和進(jìn)化，使得相同的基因組在不同的種間產(chǎn)生了深刻的分化。如果將甘藍(lán)型油菜的染色體組認(rèn)定為AACC，為了反映這種基因組分化，可將白菜型油菜的染色體組記為A’A’，埃塞俄比亞芥染色體組記為B’B’C’C’。
油菜種間雜種存在著極強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。甘藍(lán)型油菜(AACC)與白菜型油菜(A’A’)的F1雜種(簡(jiǎn)稱甘白雜種，A’AC)植株?duì)I養(yǎng)優(yōu)勢(shì)可超過(guò)高親值的152％(Qian等，10th International Workshop on Gene,Genome and Isoenzym,1999，北京)。甘藍(lán)型油菜與埃塞俄比亞芥(B’B’C’C’)、與芥菜型油菜(A’A’BB)的F1雜種也均表現(xiàn)出強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢(shì)(劉后利，《油菜的遺傳與育種》，上?？萍汲霭嫔?，1985；Meng等，Euphytica,1998)。顯然，甘、白間的雜種優(yōu)勢(shì)來(lái)自于白菜型油菜A’基因組與甘藍(lán)型油菜中的A基因組或C基因組間的互作。而在甘埃雜交中，種間雜種優(yōu)勢(shì)源于甘藍(lán)型油菜的A、C基因組分別與埃芥的B’或C’基因組間的互作。由于油菜的這種種間雜種優(yōu)勢(shì)來(lái)源于整個(gè)基因組間的互作，稱之為基因組間雜種優(yōu)勢(shì)。
由于甘白雜種或甘埃雜種均為非整倍體，染色體配對(duì)不正常，雜種不育或育性極低，因此油菜的這種基因組間雜種優(yōu)勢(shì)只能表現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)方面，但結(jié)實(shí)率極低，無(wú)法用于雜種種子生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種可以獲得結(jié)實(shí)率正常的油菜基因間雜種優(yōu)勢(shì)的方法，提高油菜雜種優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)度。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，該方法包括常規(guī)雜交育種方法和分子生物學(xué)育種方法，將傳統(tǒng)的育種方法革新為利用油菜基因組間雜種優(yōu)勢(shì)的方法，通過(guò)種間雜交和分子標(biāo)記輔助選擇，將白菜型油菜的A’基因組與甘藍(lán)型油菜的C基因組，或白菜型油菜的A’基因組與埃塞俄比亞芥C’基因組結(jié)合在一起，培育出染色體組型為A’A’CC或A’A’C’C’的甘藍(lán)型油菜優(yōu)良品系，進(jìn)而組配超強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的甘藍(lán)型雜交組合。這些品系的價(jià)值并不在于其本身可能具有一定的雜種優(yōu)勢(shì)，而在于用它們與自然的甘藍(lán)型油菜配組，可產(chǎn)生染色體組型為A’ACC或A’AC’C的F1雜種。由于這些雜種中存在著A’/A、A’/C或C’/C間的基因組互作，將會(huì)產(chǎn)生超強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。而在另一方面，這些雜種又是雙二倍體，育性正常，從而可以利用于油菜籽的生產(chǎn)。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案得到實(shí)現(xiàn)1．種間雜交甘白種間雜交以低芥酸、低硫苷(雙低)甘藍(lán)型油菜品種作母本，以白菜型油菜作父本，獲得染色體組型為AA’C的F1種間雜種種子。例如以甘藍(lán)型油菜品系7S159為母本，白菜型油菜品種浙江1號(hào)為父本，通過(guò)母本剝蕾去雄，有性雜交，獲得雜種一代。雜種一代表現(xiàn)為植株高大，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，盛花期干重超親優(yōu)勢(shì)達(dá)152.7％，中親優(yōu)勢(shì)達(dá)175％。
埃白種間雜交以埃塞俄比亞芥作母本，以白菜型油菜作父本，得到染色體組型為A’B’C’的F1種間雜種種子。但這一組合的雜交親和性低，結(jié)實(shí)率因組合不同而差異很大。對(duì)于結(jié)實(shí)率近于零的組合須采用胚挽救方法得到雜種苗。用0.1％秋水仙素處理埃塞俄比亞芥與白菜型油菜的F1雜種幼苗，獲得染色體組型為A’A’B’B’C’C’的異源六倍體。
2．對(duì)雜交后代的處理對(duì)甘白雜種后代的處理在甘白雜種(A’AC)減數(shù)分裂過(guò)程中，除產(chǎn)生大量非整倍配子外，也將產(chǎn)生整倍的A或A’配子，及整倍的AC或A’C配子，因此甘白雜種有一定的育性。將甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜的雜種套袋并輔助授粉，生產(chǎn)自交種子，經(jīng)種植產(chǎn)生F3代植株，淘汰生長(zhǎng)畸形和育性不高的植株，獲得F2株系種子，對(duì)各F3株系的植株作農(nóng)藝和品質(zhì)性狀選擇后，再作染色體檢查，選出染色體數(shù)目為2n=38的優(yōu)良單株。
對(duì)埃白雜交后代的處理用雙低甘藍(lán)型油菜品種與埃塞俄比亞芥與白菜型油菜雜交的異源六倍體雜交，產(chǎn)生染色體組型為A’ABC’C的倍半五倍體。在減數(shù)分裂中，倍半五倍體中的B基因組因不能配對(duì)而將被消除，僅A’、A、C’、C基因組的染色體傳遞到F2代。種植F2代植株，檢查花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為，選散粉正常，結(jié)實(shí)率高，農(nóng)藝和品質(zhì)性狀符合育種要求的染色體數(shù)為2n=38的單株。
3．對(duì)當(dāng)選株系的基因組分析測(cè)試對(duì)處理雜交后代后所獲得的植株進(jìn)行基因組指紋分析。所述的方法包括擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)，簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)，限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)可靠性高等穩(wěn)定性好的DNA指紋分析方法。然后再根據(jù)當(dāng)選植株的DNA指紋，結(jié)合其親本指紋在甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜的雜交后代中選出染色體組型為A’A’CC的F4株系，在埃塞俄比亞芥與白菜型油菜雜交后代中選出染色體組型為A’A’C’C’的F3株系。
所述的DNA指紋分析方法具體步驟是AFLP的分析程序AFLP指紋分析主要采用Vos等(1995)的方法，并對(duì)其進(jìn)行了以下修正(1)采用250ng基因組DNA,2.5U EcoRⅠ,2.5U MseⅠ,2.0μl雙酶切緩沖液Y+/TangoTM，加超純水到20μl 37℃酶切3小時(shí)；(2)酶切完成后，每個(gè)反應(yīng)再加5μl連接混合液于37℃連接3小時(shí)，該混合液由以下成分構(gòu)成EcoRⅠ接頭(5μM)0.5μl,MseⅠ接頭(50μM)0.5μl,T4 DNA連接酶0.5U,10x T4 DNA連接酶緩沖液0.5μl，用超純水把混合液體積調(diào)至5μl(3)預(yù)擴(kuò)增采用以下體系進(jìn)行，10×Taq DNA聚合酶緩沖液2.0μl,MgCl2(25mM)1.5μ1,dNTP(含dATP dTTP dCTPdGTP四種脫氧核苷酸各2.0mM)2μl，帶1-堿基3′-延伸末端的EcoRⅠ引物30ng,帶1-堿基3′延伸末端的MseⅠ引物30ng,Taq DNA聚合酶0.5U，稀釋了10倍的酶切/連接核苷酸產(chǎn)物1μl，加超純水至20μl。預(yù)擴(kuò)增的PCR熱循環(huán)為①94℃ 2分鐘，②94℃ 30秒，③50℃ 30秒，④72℃ 1分鐘，⑤重復(fù)②到④步34次，⑥將PCR熱循環(huán)于4℃停止。(4)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后取1μl再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并采用有3個(gè)堿基的3′-延伸末端的引物來(lái)控制擴(kuò)增帶紋的密集程度。其PCR熱循環(huán)為①94℃ 2分鐘，②94℃ 30秒，③65℃ 30秒，④72℃ 1分鐘，⑤重復(fù)②到④步10次，并且使每個(gè)循環(huán)的復(fù)性溫度都在上個(gè)循環(huán)的基礎(chǔ)上降低一度，這樣使復(fù)性溫度一直降到56℃，然后保持56℃的復(fù)性溫度繼續(xù)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。⑥最后將PCR熱循環(huán)于4℃停止。(6)按《分子克隆》(第二版)中的方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(7)電泳結(jié)果采用試劑盒銀染顯示，方法見銀染試劑盒說(shuō)明書。
SSR的分析程序SSRs(Simple Sequence Repeats簡(jiǎn)單序列重復(fù))是指根據(jù)真核生物基因組中具有豐富變異的簡(jiǎn)單重復(fù)序列兩端的保守序列設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增出來(lái)的多態(tài)性帶紋。我們所用的引物主要根據(jù)Szewc-McFadden等1996年的報(bào)道合成的。PCR混合液為DNA模板10ng，左右引物各15pmol,dATP dTTP dCTP dGTP四種脫氧核苷酸各3.75μmol,MgCl2(25mM)1.875μl,1.0U Taq酶，10×Taq DNA聚合酶緩沖液1.5μl,15μl反應(yīng)體系。PCR熱循環(huán)采用以下體系進(jìn)行94℃變性2分鐘，接著是20個(gè)循環(huán)的嚴(yán)緊性不斷降低的變溫PCR擴(kuò)增94℃ 60秒變性，變溫30秒復(fù)性，72℃延伸45秒，復(fù)性溫度從68℃到58℃，每2個(gè)循環(huán)降低1℃，然后保持58℃的復(fù)性溫度再擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，最后4℃儲(chǔ)藏。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按《分子克隆》(第二版)中的方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和試劑盒銀染顯示多態(tài)性。
RFLP的分析程序RFLP指紋分析主要按《分子克隆》(第二版)的方法進(jìn)行，并對(duì)其進(jìn)行了少量修正(1)取15μg質(zhì)量上好的基因組DNA進(jìn)行酶切，0.4NNaOH轉(zhuǎn)膜；(2)1-4張10×20cm2膜取30ml預(yù)雜交液于65℃預(yù)雜交8-10小時(shí)；(30ml預(yù)雜交液包含硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)0.3g于17.7ml超純水65℃溶解，20×SETS6ml,50×Denharts 6ml,10％SDS 0.3ml，變性斷裂的鮭魚精DNA 3mg。)(3)5-10ml雜交液于65℃雜交12小時(shí)；(5ml雜交液包含硫酸葡聚糖0.5g于2.92ml超純水65℃溶解，20×SETS 1ml,50×Denharts 1ml,10％SDS 0.05ml，變性斷裂的鮭魚精DNA 0.1mg, [α-32P]dCTP標(biāo)記的探針40μl；(4)探針標(biāo)記采用以下體系常溫標(biāo)記5小時(shí)探針DNA模板4μl(約400ng)，6堿基隨機(jī)引物3μl(150ng)，DNA分子量標(biāo)記2μ1(20ng)，超純水19μl，以上混合均勻后沸水浴3分鐘，于冰水中冷卻后繼續(xù)加入二硫蘇糖醇(DTT)2ul(40mmol),dATP、dGTP和dTTP混合液2μl(各10mmol),10×Klenow聚合酶緩沖液4ul,DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow fragment)2ul，進(jìn)口[α-32P]dCTP 2ul(20μCi)。(5)洗膜和壓片按《分子克隆》(第二版)中講述的方法進(jìn)行。
采用以上各種分子標(biāo)記，本發(fā)明在白菜型油菜或甘藍(lán)型油菜內(nèi)部和它們之間都檢測(cè)到了豐富的多態(tài)性，其中更不乏白菜型油菜或甘藍(lán)型油菜所特有的標(biāo)記，為輔助選擇提供了大量信息，現(xiàn)舉例說(shuō)明。
白菜型油菜所特有的標(biāo)記有PNl38H15、PN67H9、PA14H3.4、PN54B6.5……甘藍(lán)型油菜所特有的標(biāo)記有PN25H2.2、PN25H3.3、PN31H3.3、PN159H10……4．配合力測(cè)驗(yàn)以A’A’CC或A’A’C’C’與甘藍(lán)型油菜不育系測(cè)交，根據(jù)F1的表現(xiàn)選出超強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的雜交組合。當(dāng)所選株系中不含恢復(fù)基因時(shí)，采用轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入TA29或其它雄性不育基因。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1．解決了油菜基因組間雜種不育的問(wèn)題，使其雜種能用于油菜F1種子的生產(chǎn)。
2．獲得超強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的油菜組合。
權(quán)利要求
1．一種利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，包括常規(guī)雜交育種和分子生物學(xué)育種方法，其特征在于將傳統(tǒng)的利用油菜是種間雜種優(yōu)勢(shì)利用方法革新為利用油菜基因組雜種優(yōu)勢(shì)的方法，通過(guò)種間雜交和分子標(biāo)記輔助選擇，將白菜型油菜的A’基因組與甘藍(lán)型油菜的C基因組，或白菜型油菜A’基因組與埃塞俄比亞芥C’基因組結(jié)合在一起，培育出染色體組型為A’A’CC或A’A’C’C’的甘藍(lán)型油菜優(yōu)良品系，進(jìn)而組配超強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的甘藍(lán)型油菜雜交組合。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，其特征在于，以低芥酸、低硫苷(雙低)甘藍(lán)型油菜品種作母本，以白菜型油菜作父本，獲得染色體組型為AA’C的F1種間雜種種子。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，其特征在于，以埃塞俄比亞芥作母本，以白菜型油菜作父本，得到染色體組型為A’B’C’的F1種間雜種種子。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，其特征在于，用0.1％濃度的秋水仙素處理埃塞俄比亞芥與白菜型油菜的F1雜種的幼苗，獲得染色體組型為A’A’B’B’C’C’的異源六倍體。
5．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，其特征在于，將甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜的雜種套袋并輔助授粉，生產(chǎn)自交種子，經(jīng)種植生產(chǎn)F2代植株，淘汰生長(zhǎng)畸型和育性不高的植株，獲得F3株系植株作農(nóng)藝和品質(zhì)選擇后，再作染色體檢查，選出染色體數(shù)目為2n=38的優(yōu)良單株。
6．根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，其特征在于，用雙低甘藍(lán)型油菜品種與埃塞俄比亞芥與白菜型油菜雜交的異源六倍體雜交，生產(chǎn)染色體組型為A’ABC’C的倍半五倍體，種植F2代植株，檢查花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為，選散粉正常，結(jié)實(shí)率高，農(nóng)藝和品質(zhì)符合育種要求的染色體數(shù)2n=38的單株。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，其特征在于對(duì)當(dāng)選雜交后代處理后所獲得的植株進(jìn)行DNA指紋分析，所述的方法包括運(yùn)用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)，簡(jiǎn)單系列重復(fù)(SSR)，限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)方法，根據(jù)當(dāng)選植株的DNA指紋，結(jié)合其親本指紋在甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜的雜交后代中選出染色體組型為A’A’CC的F4株系，在埃塞俄比亞芥與白菜型油菜的雜交后代中選出染色體組型為A’A’C’C’的F3株系。
8．根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求7所述的利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的方法，其特征在于，以A’A’CC或A’A’C’C’與甘藍(lán)型油菜不育系測(cè)交，根據(jù)F1的表現(xiàn)選出超強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的雜交組合，當(dāng)所選的株系中不含恢復(fù)基因時(shí)，采用轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入TA29或其它雄性不育基因。
全文摘要
一種利用油菜基因組間雜種優(yōu)勢(shì)的方法,屬于油菜新品系選育技術(shù)領(lǐng)域。其特征是通過(guò)種間雜交和分子標(biāo)記輔助選擇,將白菜型油菜的A’基因組與甘藍(lán)型油菜的C基因組,或白菜型油菜的A’基因組與埃塞俄比亞芥的C’基因組結(jié)合在一起,培育出染色體組型為A’A’CC或A’A’C’C’的新型甘藍(lán)型油菜優(yōu)良品系,并進(jìn)而組配超強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的甘藍(lán)型油菜雜交組合。
文檔編號(hào)A01H1/02GK1303588SQ9912012
公開日2001年7月18日 申請(qǐng)日期1999年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月15日
發(fā)明者孟金陵, 錢偉, 劉仁虎, 趙建偉 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)