專利名稱：：抑制興奮性毒性損傷的多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抑制興奮性毒性損傷的多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：興奮性毒性的概念最早是在上個(gè)世紀(jì)70年代由Olney等人提出的，是由中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)——谷氨酸受體的過(guò)度持續(xù)活化而導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡過(guò)程。谷氨酸受體過(guò)度激活使正常生理刺激下引起的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)一步放大，從而使突觸后神經(jīng)元過(guò)度興奮并最終死亡。突觸前神經(jīng)元遞質(zhì)釋放增加、膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)遞質(zhì)的重?cái)z取減少以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)等因素，均可導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸濃度的升高。此外，谷氨酸受體敏感性增加也是產(chǎn)生興奮性毒性損傷的因素之一。目前認(rèn)為，中風(fēng)、腦外傷、癲癇等急性腦損傷以及帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化等慢性神經(jīng)退行性疾病，均有谷氨酸興奮性毒性損傷的參與。生理狀態(tài)下，細(xì)胞消耗70%的能量用于通過(guò)*71(、1&56維持胞內(nèi)高1(+低化+的濃度梯度及細(xì)胞膜電位。缺血、缺氧等因素致細(xì)胞能量供應(yīng)不足或細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙時(shí)，ATP生成減少，Na7K+ATPase功能失調(diào)，胞內(nèi)K+釋放，胞外Na+內(nèi)流，細(xì)胞膜電位喪失，從而使神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞Na+依賴的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，將谷氨酸從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。此外，突觸前神經(jīng)元去極化可增加谷氨酸遞質(zhì)的釋放。上述因素共同導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸濃度的升高和興奮性毒性損傷，繼之以神經(jīng)元死亡。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體兩種類型，其中前者又分為a-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(a-araino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-proprionicacid，AMPA)受體、N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,麗DA)受體和海人藻酸(kainaterec印tor，KA)受體。谷氨酸受體過(guò)度激活導(dǎo)致興奮性毒性損傷的主要過(guò)程包括第一階段，谷氨酸與突觸后AMPA和KA受體結(jié)合，大量Na+、Cl—內(nèi)流和被動(dòng)性的H20內(nèi)流，細(xì)胞發(fā)生急性滲出性腫脹，此為可逆性變化。部分細(xì)胞可發(fā)生溶解和即刻性死亡，在傷后l-2小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)；第二階段，大量谷氨酸與麗DA受體結(jié)合，同時(shí)突觸后神經(jīng)元去極化使Mg"對(duì)麗DA受體電壓依賴性的阻滯作用去除，應(yīng)DA受體被激活，大量Ca2+內(nèi)流，形成致死性Ca2+超載，造成延遲性細(xì)胞死亡，一般在數(shù)小時(shí)至數(shù)天發(fā)生，此為興奮性毒性損傷的主要過(guò)程。應(yīng)DA受體是由兩個(gè)NR1亞基和兩個(gè)NR2亞基形成的異四聚體結(jié)構(gòu)，同時(shí)表達(dá)NR1和NR2亞基是形成功能性麗M受體所必需的。NR1亞基被認(rèn)為是NMDA受體的結(jié)構(gòu)性亞基，NR2亞基是調(diào)節(jié)性亞基，賦予畫(huà)DA受體不同的藥理學(xué)和電生理學(xué)特性，其中NR2A和NR2B亞基是兩種主要的類型。與AMPA受體和KA受體相比，醒DA受體具有獨(dú)特的功能特性，即甘氨酸的協(xié)同激活作用、Mg2+電壓依賴性阻滯、Ca2+的高通透性和緩慢的門(mén)控動(dòng)力學(xué)。盡管基礎(chǔ)狀態(tài)下，快速興奮性突觸傳遞主要通過(guò)AMPA受體介導(dǎo)，但由于醒DA受體對(duì)Ca2+具有高通透性，Ca2+作為第二信使可激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)受體功能及其生物學(xué)效應(yīng)，因此，麗DA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞和突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，與感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)和記憶等生理活動(dòng)密切相關(guān)。同時(shí)正是由于麗DA受體對(duì)Ca2+的高通透性，使其成為介導(dǎo)谷氨酸興奮性毒性損傷的核心分子。NMDA受體是導(dǎo)致大量鈣內(nèi)流、鈣超載的首要原因，其他通道如電壓門(mén)控鈣通道、電壓門(mén)控鈉通道等僅起繼發(fā)性作用。因此，理論上NMDA受體拮抗劑可用來(lái)治療興奮性毒性引起的細(xì)胞損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，NMDA受體谷氨酸結(jié)合位點(diǎn)拮抗劑、甘氨酸結(jié)合位點(diǎn)拮抗劑、通道阻斷劑、N端拮抗劑等各種具有不同親和力和亞型選擇性的拮抗劑不斷涌現(xiàn)。但臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人失望，由于幾乎所有的神經(jīng)元都表達(dá)NMDA受體，拮抗劑不可避免地阻斷了麗DA受體正常的興奮性突觸傳遞功能，產(chǎn)生明顯的毒副作用，如幻覺(jué)和記憶障礙等精神癥狀以及對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的損傷。拮抗劑已經(jīng)不是阻斷醒DA受體興奮性毒性作用的理想藥物，從腿DA受體的調(diào)節(jié)分子和作用蛋白入手，另辟蹊徑，通過(guò)干擾蛋白質(zhì)相互作用，阻斷麗DA受體興奮性毒性損傷的下游信號(hào)通路，從而減緩興奮性毒性損傷，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可抑制興奮性毒性損傷的多肽(及其編碼基因)。本發(fā)明所提供的多肽，為如下a)、b)、c)、d)或e)所示的多肽a)、由SEQIDNO.1自N端起第21-40位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；b)、由SEQIDNO.1自N端起第1-50位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；c)、由SEQIDN0.4所示的氨基酸序列組成的多肽；d)、由SEQIDNO.1自N端起第51-256位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；e)、由SEQIDNO.1自N端起第101-256位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；f)、將a)、b)、c)、d)或e)限定的多肽的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的分別由a)、b)、c)、d)或e)限定的多肽衍生的多肽。含有上述任一所述多肽的編碼基因的重組載體、重組菌、表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制興奮性毒性損傷的藥物。本發(fā)明所提供的抑制興奮性毒性損傷的藥物，其活性成份為上述任一所述多肽或上述任一所述編碼基因或上述任一所述重組載體。上述任一所述多肽或任一所述編碼基因或任一所述重組載體在制備抑制興奮性毒性損傷的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)探索研究，發(fā)現(xiàn)蛋白DREAM/Calsenilin/KChlP3(以下簡(jiǎn)稱DREAM，downstreamregulatoryelementantagonistmodulator,氨基酸殘基序列如SEQIDNO.1所示)可以與NMDA受體的NRl亞基發(fā)生直接的結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)包括其N端(1-50位氨基酸)和C端(1CU-256位氨基酸，含有4個(gè)EFhand結(jié)構(gòu)域)，并且二者單獨(dú)均可以與NRl亞基結(jié)合，但前者與NR1亞基的結(jié)合能力強(qiáng)，后者與NR1亞基的結(jié)合相對(duì)較弱。DREAM21-40位氨基酸構(gòu)成其N端與NRl亞基結(jié)合的核心序列。據(jù)此序列，構(gòu)建具有穿膜能力的TAT融合肽TAT-21-40。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，TAT-21-40使與DREAM結(jié)合的NR1亞基量降低至對(duì)照組的51.67±7.67%(代0.05)。完全體外pull-down實(shí)驗(yàn)表明，TAT-21-40使與DREAM1-50結(jié)合的NRl亞基量降低至對(duì)照組的54.32±5.69%(代0.05)。麗DA損傷前預(yù)處理細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)表明，與scramble-TAT相比，TAT-21-40使神經(jīng)元使固DA處理引起的LDH滲出量從2.10±0.18下降為1.09±0.06(代0.05)，使NMDA處理引起的PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)從38.34±1.82%下降為25.39±1.46%(代O.001)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。麗DA處理后細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)表明，TAT-21-40使NMDA致LDH釋放量從4.70±0.20下降到4.20±0.06(代O.05)，PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)從46.89±1.59%下降到38.54±1.35%(代O.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明，TAT-21-40不僅在醒DA損傷前預(yù)處理可以減輕麗DA致細(xì)胞損傷，在麗DA處理后再加入細(xì)胞中仍可以發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，表明TAT-21-40對(duì)麗DA受體誘導(dǎo)的興奮性毒性損傷不僅可以發(fā)揮預(yù)防作用，還具有治療作用。因此，本發(fā)明的多肽及其編碼基因在抑制興奮性毒性損傷中具有廣闊的應(yīng)用前景。圖1為DREAM與NR1亞基結(jié)合位點(diǎn)的鑒定。圖2為T(mén)AT-21-40對(duì)DREAM與NR1亞基結(jié)合的影響。圖3為T(mén)AT-21-40預(yù)處理對(duì)麗DA致細(xì)胞損傷程度的影響。圖4為T(mén)AT-21-40后處理對(duì)麗DA致細(xì)胞損傷程度的影響。圖5為T(mén)AT-21-40減少麗DA受體在胞膜的表達(dá)。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、DREAM蛋白與NR1亞基結(jié)合位點(diǎn)的鑒定DREAM蛋白全長(zhǎng)256個(gè)氨基酸，在其102-113，139-150，175-186和223-234位氨基酸各有一個(gè)EFhand結(jié)構(gòu)域。據(jù)此將DREAM蛋白分段，N端定義為1-100位，C端定義為101-256位，含有4個(gè)完整的EFhand結(jié)構(gòu)域，N端進(jìn)一步又分為1-50位和51-100位兩段。DREAM蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。實(shí)驗(yàn)一中使用如下肽段DREAM1-50(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第1-50位氨基酸肽段)、DREAM51-100(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第51-100位氨基酸肽段)、DREAM101-256(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第101-256位氨基酸肽段)、DREAMA1-50(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第51-256位氨基酸肽段)、DREAM(SEQIDNO.l所示)(圖la)。實(shí)驗(yàn)時(shí)在各肽段前加GST標(biāo)簽。實(shí)驗(yàn)二中使用如下肽段DREAM1-20(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第1-20位氨基酸肽段)、DREAM11-30(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第11-30位氨基酸肽段)、DREAM21-40(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第21-40位氨基酸肽段)、DREAM31-50(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第31-50使氨基酸肽段)(圖Id)。實(shí)驗(yàn)時(shí)在各肽段前加GST標(biāo)簽。幾種帶有His6標(biāo)簽或GST標(biāo)簽的蛋白的制備如下構(gòu)建原核表達(dá)載體然后進(jìn)行制備。GST-tag菌體裂解液lOraMPMSF/1XPI/1XPBS;Hise-tag菌體裂解液:Na2HP04*H207.8g，NaCl17.54g，咪唑(Sigma)0.68g溶于800mlddH20中，用NaOH調(diào)pH值至8.0。表l、引物序列表序號(hào)質(zhì)粒名稱酶切位點(diǎn)引物1pet28a(+)-NR1C-terminusECoRI5'-AGCGAATTCGCCACCGAGATCGCCTACAAGCGACAC-3'HindIII5'-AGCAAGCTTGCTCTCCCTATGACGGGAACA-3'2PGEX-5X-1-DRE細(xì)ECoRI5'-AGCGAATTCATGCAGAGGACCAAGGAAGCA-3'Xhol5'-AGCCTCGAGCTAGATGACGTTCTCAAACAG-3'3PGEX-5X-1-1-50DREAMECoRI同PGEX-5X-1-DREAM上游引物Xhol5'-AGCCTCGAGCCACTTGATTAAGCAGCAACG-3'4PGEX-5X-l-51-訓(xùn)DREAMECoRI5'-AGCGAATTCATCCTGTCCAGTGCTGCCCCA-3'Xhol5'-AGCCTCGAGGAAGCCTCGGTACAGGGACTG-3'5PGEX-5X-1-101-256DREAMECoRI5'-AGCGAATTCAAGAACGAATGTCCCACGGGC-3'Xhol同PGEX-5X-1-DREAM下游引物6PGEX-5X-1-A1-50DREAMECoRI同PGEX-5X-1-DREAM-51-100上游引物Xhol同PGEX-5X-1-DREAM下游引物7PGEX-5X+1-20DREAMECoRI5'-AATTCATGCAGAGGACCAAGGAAGCAATGAAGGCATCGGATGGCAGCCTCCTGGGAGACCCTGGGC-3'Xhol5'-TCGAGCCCAGGGTCTCCCAGGAGGCTGCCATCCGATGCCTTCATTGCTTCCTTGGTCCTCTGCATG-3'8PGEX-5X-1-11-30DREAMECoRI5'-AATTCTCGGATGGCAGCCTCCTGGGAGACCCTGGGCGCATACCGCTGAGCAAGAGGGAAGGCATCC-3'Xhol5'-TCGAGGATGCCTTCCCTCTTGCTCAGCGGTATGCGCCCAGGGTCTCCCAGGAGGCTGCCATCCGAG-3'9PGEX-5X-1-21-40DREAMECoRI5'-AATTCCGCATACCGCTGAGCAAGAGGGAAGGCATCAAGTGGCAGAGGCCACGGTTCACCCGCCAGC-3'Xhol5'-TCGAGCTGGCGGGTGAACCGTGGCCTCTGCCACTTGATGCCTTCCCTCTTGCTCAGCGGTATGCGG-3，10PGEX-5X-1-31-50D區(qū)MECoRI5'-AATTCAAGTGGCAGAGGCCACGGTTCACCCGCCAGGCCCTGATGCGTTGCTGCTTAATCAAGTGGC-3'<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1、His6-NRl-la亞基C末端蛋白的制備和純化1)制備NR1-la亞基C末端的編碼基因以大鼠全腦cDNA為模板，用表1中序列1所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到NR1-la亞基C末端的編碼基因(大鼠NR1基因834-938位)，該編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；NR1-la亞基C末端蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。2)含有"His6-NRl-la亞基C末端的編碼基因"的重組菌的制備將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)ECoRI和HindIII雙酶切插入pet28(+)載體(Clontech公司)，得到含有"Hise-NRl-la亞基C末端的編碼基因"的重組載體；將重組載體導(dǎo)入BL21(DE3)菌(天根生化科技(北京)有限公司)，得到含有"His6-NRl-la亞基C末端的編碼基因"的重組菌，經(jīng)測(cè)序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)確認(rèn)插入片段正確。3)發(fā)酵重組菌，誘導(dǎo)Hise-NR1-la亞基C末端蛋白表達(dá)及純化取單克隆重組菌，搖菌過(guò)夜；取上述菌液按最終誘導(dǎo)體積1/10的比例加入新鮮培養(yǎng)基中，37°C250rpm，搖菌2-3h;加入0.5raMIPTG誘導(dǎo)，30°C250rpm繼續(xù)搖菌l-2h;4°C3，000rpraX15min離心，棄上清，收集菌體沉淀；每ml菌液加入100ul裂解液重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞40W6sX3次；加入10%TritonX-IOO，使其終濃度為1%，4。C混懸lh;4°C12，000rpmX20min離心，取上清；上清中加入15-20ul珠子(Ni-NTAagrose，Qiagen，Cattt30210)，4'C混懸2h;washbuffer(Na2HP04*H207.8g，NaCl17.54g，咪唑1.36g溶于800mlddH20中，用NaOH調(diào)pH值至8.0)清洗珠子6次，4°C2，000rpmX2min離心，去除非特異性結(jié)合；加入適量洗脫緩沖液(Na2HP(VH207.8g,NaCl17.54g，咪唑17g溶于800mlddH20中，用NaOH調(diào)pH值至8.0)，4。C靜置30min，2，000rpmX2min離心取上清，此為純化的His6-NRl-la亞基C末端蛋白(即帶有組氨酸標(biāo)簽的NRl-la亞基C末端蛋白)。2、分別連有GST標(biāo)簽的蛋白的制備1)各蛋白的編碼基因的擴(kuò)增以大鼠全腦cDNA為模板，以表l中所示序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到如下多肽片段的編碼基因；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果產(chǎn)物序列正確。DREAM1-50(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第1-50位氨基酸肽段)(引物表1中3)、DREAM51-100(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第51-100位氨基酸肽段)(引物表l中4)、DREAM101-256(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第101-256位氨基酸肽段)(引物表l中5)、DREAMA1-50(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第51-256位氨基酸肽段)(引物表1中6)、DREAM(SEQIDNO.1所示)(引物表1中2)、DREAM-1-20(SEQIDNO.1所示DRE細(xì)蛋白N端起第1-20位氨基酸肽段)(引物表1中7)、DREAM-11-30(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第11-30位氨基酸肽段)(引物表1中8)、DREAM-21-40(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第21-40位氨基酸肽段)(引物表1中9)、DREAM-31-50(SEQIDNO.1所示DREAM蛋白N端起第31-50位氨基酸肽段)(引物表1中10)。2)含有"各肽段的編碼基因"的重組菌的制備上述PCR產(chǎn)物經(jīng)ECoRI和Xhol雙酶切插入PGEX-5X-1載體(Clontech公司)，得到含有"連接有GST標(biāo)簽的各肽段的編碼基因"的重組載體；將重組載體導(dǎo)入BL21(DE3)菌，得到含有"連接有GST標(biāo)簽的各肽段的編碼基因"的重組菌，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)插入片段正確。3)發(fā)酵重組菌，制備連接有GST標(biāo)簽的各肽段及連接有該蛋白的珠子取單克隆重組菌，搖菌過(guò)夜；取上述菌液按最終誘導(dǎo)體積1/10的比例加入新鮮培養(yǎng)基中，37°C250rpm，搖菌2-3h;加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)，30°C250rpm繼續(xù)搖菌1-2h;4°C3,000rpmX15min離心，棄上清，收集菌體沉淀；每ml菌液加入100(il裂解液重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞40W6sX3次；加入10%TritonX-100，使其終濃度為1%，4T:混懸lh;4°C12，000rpmX20min離心，取上清；上清中力口入15-20|il珠子(GlutathioneSepharose4fastflow,AmershamPharmacia,Cat#17-5132-01)，4'C混懸2h;1XPBS清洗珠子6次，4°C2，000rpmX2min9離心，去除非特異性結(jié)合，備用。分別得到連有蛋白GST-DREAM1-50、蛋白GST-DREAM51-100、蛋白GST-DREAM101-256、蛋白GST-DREAMA1-50、蛋白GST-DREAM的珠子(圖la)。分別得到連有蛋白GST-DREAM1-20、蛋白GST-DREAM11-30、蛋白GST-DREAM21-40、蛋白GST-DREAM31-50的珠子(圖ld)。海馬組織總蛋白提取物的制備大鼠斷頭，迅速分離海馬，單側(cè)海馬加入500ul組織裂解液[Tris-HC1(pH7,5)50mM，NaCl250mM，EDTA10mM，NP-400.5%，Leup印tin10uM，PMSF1mM,NaF4raM]，組織勻漿器(PelletPestlerMotor,Rontes)研磨，研磨充分后補(bǔ)加500ul裂解液，4°C混懸1h;4°C12，000gX4min離心，分離組織碎片，取上清即為海馬組織總蛋白提取物。一、完全體外pul1-down實(shí)驗(yàn)將純化的His6-NRla亞基C末端蛋白分別與結(jié)合GST標(biāo)簽蛋白(GST標(biāo)簽蛋白、GST-DREAM1-50、GST-DREAM51-100、GST-DREAM101-256、GST-DREAMA1-50、GST-DREAM蛋白)的珠子孵育，孵育液用預(yù)冷的O.1%TritonX-100/1XTBS，4°C混懸2h;預(yù)冷的0.1%TritonX-100/1XTBS清洗珠子6次，2，000rpmX2min離心，去除非特異結(jié)合；每管加入洗脫緩沖液[IOmM還原型谷胱甘肽(Roche),50mMTris-CI(pH8.0)]10pi冰浴10-20min，洗脫蛋白，加入6XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，SDS-PAGE電泳；待電泳前沿指示劑至凝膠底部時(shí)，停止電泳，去除濃縮膠，將分離膠放入轉(zhuǎn)膜液中，室溫洗膠20min;4。C恒壓轉(zhuǎn)膜(100V)1h;將NC膜放入到封閉液(含5%脫脂奶粉的1XTBST溶液)中，室溫封閉lh;—抗His6標(biāo)簽抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，CATttC1301，小鼠單克隆抗體，1:1000稀釋)或GST標(biāo)簽抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，CATttC1303，小鼠單克隆抗體，1:2000稀釋)孵育，1XTBST洗膜，5minX3次；服P標(biāo)記羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，CATttZB-2305，1:1000稀釋)孵育，1XTBST洗膜，10minX3次；化學(xué)發(fā)光液(A，B液等量混合，SantaCruz，sc2048)孵育2min，暗室曝光。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果表明，除GST-DREAM51-100(記作51-IOO)外，GST-DREAM1-50(記作1-50)、GST-DREAM101-256(記作101-256)、GST-DREAMA1—50(記作△1-50)及GST-DREAM(記作fulllength)均可以與His6-NR1C-末端蛋白'結(jié)合，并且DREAMl-50的結(jié)合力最強(qiáng)(圖lb)。二、半體外pull-down實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)一中所述方法相同，不同的是將海馬組織總蛋白提取物分別與結(jié)合GST蛋白(GST標(biāo)簽蛋白、GST-DREAM1-50、GST-DREAM51-100、GST-DREAM101-256、GST-DREAM51-256、GST-DREAM蛋白)的珠子孵育。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果與實(shí)驗(yàn)一類似，雖然GST-DREAM1-50、GST-DREAM101-256、GST-DREAMA1-50及GST-DREAM(記作fulllength)均可以與內(nèi)源性表達(dá)的NR1亞基結(jié)合，但GST-DREAM1-50與NR1亞基的結(jié)合最強(qiáng)(圖lc)。三、將DREAMl-50進(jìn)一步分段，再進(jìn)行完全體外pull-down實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)一中方法相同，不同的是所用的珠子如下連有GST蛋白、GST-DREAM1-50、GST-DREAM1-20、GST-DREAM11-30、GST-DREAM21-40、GST-DREAM31-50蛋白的珠子。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示，GST-DREAM21-40(記作21-40)與His6-NR1C-末端蛋白結(jié)合最強(qiáng)(圖le)。綜合實(shí)驗(yàn)一、二和三的結(jié)果，表明DREAMN端和C端均參與NRl亞基的相互作用，但N端起第21-40位氨基酸肽段與NR1亞基的結(jié)合最強(qiáng)。實(shí)施例2、TAT-21-40抑制興奮性毒性損傷的應(yīng)用TAT(transcriptionalactivatorprotein)穿膜肽是跨膜遞送載體之一，可以將與其共價(jià)連接的多肽、蛋白質(zhì)及DNA等分子跨膜導(dǎo)入細(xì)胞，甚至可以通過(guò)血腦屏障，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高并且對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療學(xué)及藥學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)DREAMN端與NR1亞基結(jié)合的主要位點(diǎn)即其N端21-40位氨基酸，構(gòu)建具有穿膜能力的融合肽——TAT-21-40。將靶序列的氨基酸順序打亂，構(gòu)建scramble-TAT作為對(duì)照。TAT-21-40的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，由TAT穿膜序列(RKKRRQRRR)和DREAMN端起第21-40位氨基酸組成。TAT-21-40由吉爾生化(上海)有限公司11合成，其分子量為3873.67，分子式為C167H295N71036。(圖2a)scramble-TAT的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，由吉爾生化(上海)有限公司合成，其分子量為3873.67，分子式為C167H295N71036。(圖2a)一、TAT-21-40抑制DREAM與NR1亞基的結(jié)合1、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAT-21-40對(duì)DREAM與NR1亞基結(jié)合的影響免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)步驟先用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗珠子(proteinA-S印haroseCL-4，AmershamPharmacia,CAT#17-5280)3次，2，000rpmX2min離心，棄上清；珠子(每管20jil)與DREAM抗體(Santacruz，CATftsc9142)孵育，按1:100的比例用組織裂解液稀釋DREAM抗體，4。C混懸3h，得到孵育液；在上述孵育液中加入200iug海馬組織總蛋白提取物，4'C混懸過(guò)夜；用預(yù)冷的O.1%TritonX-100/1XTBS清洗珠子6次，2，000rpmX2min離心，去除非特異結(jié)合；吸凈上清，加入2XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，煮沸，使與珠子結(jié)合的蛋白釋放；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗NR1抗體(SantaCruz，CATOsc1467，1:500稀釋)孵育，置4"C搖床過(guò)夜；1XTBST洗膜5minX3次，二抗服P標(biāo)記兔抗羊二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，CATttZB2306，1:1000稀釋)孵育，室溫1h;1XTBST洗膜IOminX3次；暗室曝光。實(shí)驗(yàn)組(記作TAT-21-40):向孵育液中同時(shí)加入200jig海馬組織蛋白提取物和TAT-21-40(TAT-21-40在孵育液中的濃度為3|_iM)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組(記作Scramble-TAT):向孵育液中同時(shí)加入200pg海馬組織蛋白提取物和scramble-TAT(scramble-TAT在孵育液中的濃度為3(iM)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。定量統(tǒng)計(jì)"TAT-21-40抑制DREAM與NR1亞基的結(jié)合"將SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜經(jīng)抗體檢測(cè)的條帶掃描，利用TotalLab軟件(AmershamBiosciences)進(jìn)行灰度分析，并將對(duì)照組的灰度值設(shè)為1，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比所得數(shù)值為實(shí)驗(yàn)組的灰度值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示TAT-21-40顯著抑制DREAM與NR1亞基的結(jié)合。定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示TAT-21-40使與DREAM結(jié)合的NR1亞基量降低至對(duì)照組的51.67±7.67%(尸=0.0242，n=3，Paired卜test)(圖2b和c)。以上結(jié)果表明TAT-21-40能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制DREAM與NR1亞基的結(jié)合，但不能完全阻斷二者的結(jié)合。2、完全體外pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAT-21-40對(duì)DREAM-1-50與NR1亞基C端結(jié)合的影響實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例1中實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是將His6-NRlC末端蛋白與結(jié)合有GST-DREAM1-50的珠子孵育。實(shí)驗(yàn)組(記作TAT-21-40):將Hise-NR1C-末端蛋白與珠子孵育時(shí)，向孵育液中加入TAT-21-40(TAT-21-40在孵育液中的濃度為3|_iM)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組(記作Scramble-TAT):將Hise-NRlC-末端蛋白與珠子孵育時(shí)，向孵育液中加入scramble-TAT(scramble-TAT在孵育液中的濃度為3(iM)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。定量統(tǒng)計(jì)方法與上述實(shí)驗(yàn)1中所述相同。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示在孵育液中加入3fiMTAT-21-40可以顯著降低DREAM1-50與NR1亞基C端的結(jié)合(圖2d)。定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示TAT-21-40使與DREAMl-50結(jié)合的NRl亞基量降低至對(duì)照組的54.32±5.69%(圖2e，n=3，*尸二0.0152,Pairedtest)。實(shí)驗(yàn)1和2的結(jié)果顯示TAT-21-40顯著抑制DREAMN端1-50與NR1亞基C末端蛋白的結(jié)合。結(jié)合上述工作結(jié)果，Al-50DREAM具有比DREAM更強(qiáng)的減緩興奮性毒性損傷的效應(yīng)，TAT-21-40通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制DREAMN端1-50與NR1亞基的結(jié)合，使DREAMC端更好地發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。二、TAT-21-40抑制NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性損傷作用NMDA處理造成的神經(jīng)元興奮性毒性離體模型常被用來(lái)研究NMDA受體參與興奮性毒性損傷的機(jī)制及篩選神經(jīng)保護(hù)藥物。在原代培養(yǎng)9天的海馬神經(jīng)元上，通過(guò)麗DA處理造成興奮性毒性損傷模型，觀察TAT融合肽預(yù)處理和后處理對(duì)細(xì)胞損傷程度的影響。原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)E18SD孕鼠購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。E18SD孕鼠脫臼處死，立即在無(wú)菌條件下分離胚胎置于預(yù)冷的解剖液中，用尖頭小鑷子剝離皮膚和顱骨，取全腦，置于裝有預(yù)冷的解剖液的小平皿中，用游絲鑷仔細(xì)分離雙側(cè)海馬；加入0.125%胰酶37。C消化30min，然后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化；吹打得到細(xì)胞懸液，靜置，取上清，沉淀中再加入含10%FBS的DMEM液繼續(xù)吹打，靜置，取上清，如此反復(fù)數(shù)次；將幾次取得的上清合并，200目細(xì)胞篩過(guò)濾除去組織碎片，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至合適密度；將細(xì)胞分別接種于Poly-D-lysine(1mg/ral,Sigma)處理過(guò)的孔板或培養(yǎng)皿中；4-6h后，待細(xì)胞貼壁換為含B27的Neurobasal培養(yǎng)基；2天后加入終濃度為10一的Ara-C(cytosinearabinoside，Sigma)，每3天半量換液一次。培養(yǎng)9天，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)測(cè)定采用CytoTox96non-radioactivecytotoxicityassaykit(Promega，CAT#G1780)，具體步驟如下吸取待測(cè)孔培養(yǎng)基上清加入96孔板中，每孔50(il;將assaybuffer與reconstitutesubstratemix混合，加入上述測(cè)定孔中，每孔50pi;混勻，室溫避光孵育30min;每孔加入50|ulstopsolution,終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀490nm讀數(shù)；每個(gè)樣本3復(fù)孔，取其均值為該樣本吸光值；將加入scramble-TAT并未經(jīng)NMDA處理組作為空白對(duì)照組，其吸光值的均值標(biāo)準(zhǔn)化為1，加入scramble-TAT并經(jīng)麗DA處理組、加入TAT-21-40未經(jīng)NMDA處理組和經(jīng)NMDA處理組的吸光值除以空白對(duì)照組吸光值均值所得數(shù)值為測(cè)量值。數(shù)值越高，代表LDH釋放量越多，細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。Hoechst33342與碘化丙啶PI(propidiumiodide)雙標(biāo)染色:細(xì)胞處理完畢后，加入含2pg/mlHoechst33342(Sigma)和l|ug/mlPI(Sigma)的1XPBS室溫染色10min;用1XPBS輕洗細(xì)胞2次，即刻熒光顯微鏡(LeicaDRM，Germany)觀察，CCD攝像頭、Qcapture軟件(Qimagine，MediaCybernetics,Canada)拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)選取至少6個(gè)視野。Hoechst33342為紫外光激發(fā)，發(fā)射藍(lán)光，標(biāo)記所有細(xì)胞；PI為綠光激發(fā)，發(fā)射紅光，標(biāo)記死亡細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)PI陽(yáng)性細(xì)胞比例；PI陽(yáng)性細(xì)胞比例的計(jì)算公式為PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)X100呢。1、TAT-21-40預(yù)處理對(duì)細(xì)胞損傷程度的影響1)加入TAT-21-40:醒DA處理組先在神經(jīng)元原培養(yǎng)基中加入終濃度為3|iM的TAT-21-40孵育1小時(shí)，然后加入終濃度為100fiM的NMDA(Sigma,CAT#M3262)和終濃度為100jiM的甘氨酸(Novon)，處理1小時(shí)后更換為新鮮無(wú)酚紅neurobasal培養(yǎng)基(Gibco，CATtt12348017)，12小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞損傷測(cè)定(通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH的釋放量和計(jì)數(shù)PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)反映細(xì)胞的損傷程度)(圖3a)。未處理組先在神經(jīng)元原培養(yǎng)基中加入終濃度為3(oM的TAT-21-40孵育1小時(shí)，然后更換為新鮮無(wú)酚紅neurobasal培養(yǎng)基，12小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞損傷測(cè)定。2)加入scramble-TAT:麗DA處理組方法同上述加入TAT-21-40的麗DA處理組，不同的是將TAT-2卜40替換為scramble-TAT。未處理組方法同上述加入TAT-21-40的未處理組，不同的是將TAT-21-40替換為scramble-TAT。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示，未經(jīng)麗DA處理組，scrambleTAT組神經(jīng)元LDH的基礎(chǔ)釋放量為1±0.10，TAT-21-40組神經(jīng)元LDH的基礎(chǔ)釋放量為1.19±0.04，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；麗DA處理組，與scramble-TAT相比，TAT-21-40使神經(jīng)元經(jīng)NMDA處理引起的LDH滲出量從2.10±0.18下降為1.09±0.06(代O.05)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(圖3b，n=4,*代0.05，雙因素方差分析)。同時(shí)，PI陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，未經(jīng)NMDA處理組，scrambleTAT組的PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為11.61±0.88%，TAT-21-40組的PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為13.63±1.50%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；麗DA處理組，與scrambleTAT相比，TAT-21-40使麗DA處理引起的PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)從38.34±1.82%下降為25.39±1.46%(代O.001)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(圖3c，n=26,林*代0.001，雙因素方差分析)。2、TAT-21-40后處理對(duì)細(xì)胞損傷程度的影響1)加入TAT-21-40:醒DA處理組在神經(jīng)元原培養(yǎng)基中加入終濃度為100的麗DA和終濃度為100禪的甘氨酸處理l小時(shí)后更換為新鮮無(wú)酚紅neurobasal培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為3一的TAT-21-40孵育，12小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞損傷測(cè)定(檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH的釋放量和計(jì)數(shù)PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))(圖4a)。未處理組正常培養(yǎng)神經(jīng)元與麗DA處理組同時(shí)更換為新鮮無(wú)酚紅neurobasal培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為3(iM的TAT-21-40孵育，12小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞損傷測(cè)定。2)加入scramble-TAT:麗DA處理組方法同上述加入TAT-21-40的麗DA處理組，不同的是將TAT-21-40替換為scramble-TAT。未處理組方法同上述加入TAT-21-40的未處理組，不同的是將TAT-21-40替換為scramble-TAT。LDH的釋放量和計(jì)數(shù)PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)方法與實(shí)驗(yàn)1中所述相同。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。LDH測(cè)定結(jié)果顯示，未經(jīng)麗DA處理組，TAT-21-40與scrambleTAT相比，神經(jīng)元LDH的基礎(chǔ)釋放量從l.OO土O.14下降為0.34±0.02(圖4b，n二3-4，**代O.01，雙因素方差分析)；麗DA處理組，TAT-21-40使醒DA致LDH釋放量從4.70±0.20下降到4.20±0.06(代O.05)(圖4b，n=3-4，*代0.05,雙因素方差分析)。PI陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，未經(jīng)麗DA處理組，scrambleTAT組PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為4.75±0.64%，TAT-21-40組為2.25±0.30%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；函DA處理組，與scrambleTAT組相比，TAT-21-40使PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)從46.89±1.59%下降到38.54±1.35%(代O.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4c，n=27-28,林*代O.001雙因素方法分析)。以上結(jié)果說(shuō)明，預(yù)先使用TAT-21-40可以對(duì)醒DA致神經(jīng)元損傷發(fā)揮一定的保護(hù)作用，更重要的是在麗DA損傷后使用TAT-21-40仍然可以減輕神經(jīng)元的損傷程度，具有細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。三、TAT-21-40減少躍DA受體在胞膜的表達(dá)原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)同本實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)二所述。生物素標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白實(shí)驗(yàn)采用EZlink-NHS-LC-biotin標(biāo)記試劑盒(Pierce,CAT#21335)禾卩UltraLinkImmobilizedNeutrAvidinProteinPlus(Pierce,CAT#53151)。平衡瓶裝biotin至室溫，稱取1mg溶于2nil含Ca2+，Mg'+DPBS中，biotin終濃度為0.5mg/ml;用冰冷的含Ca2+，Mg2+DPBS輕洗細(xì)胞3次，加入適量的上述biotin溶液(覆蓋皿底)，4°C1-2h;小心棄去biotin溶液，用預(yù)冷的中和液[含IOOmM甘氨酸的Ca2+，Mg2+DPBS(PH7.2)]輕洗細(xì)胞3次，中和殘留的未與蛋白結(jié)合的biotin;加入適量裂解液(1%TritonX-100/0.1%SDS/1XPI/1XPBS)裂解細(xì)胞，冰上15min，刮下細(xì)胞，12，000gX4min離心，取上清，即為總蛋白提取物；BCA蛋白定量；每管蛋白(200pg)中加入20ul珠子(預(yù)先用PBS清洗3次)，4。C混懸過(guò)夜；4°C5，000gX1min離心，washbuffer[1%TritonX-100/0.1%SDS/1XPBS]輕洗珠子6次；棄凈上清，加入10-15|al2XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育(所用抗體同免疫共沉淀實(shí)驗(yàn))、曝光。實(shí)驗(yàn)組(記作TAT-21-40):用3TAT-21-40處理神經(jīng)元細(xì)胞2小時(shí)，然后進(jìn)行生物素標(biāo)記細(xì)胞膜表面蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。16對(duì)照組(記作scramble-TAT):用3|iMscramble-TAT處理神經(jīng)元細(xì)胞-小時(shí)，然后進(jìn)行生物素標(biāo)記細(xì)胞膜表面蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。定量統(tǒng)計(jì)"TAT-21-40抑制麗DA受體在胞膜的表達(dá)"與本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)一定量統(tǒng)計(jì)"TAT-21-40抑制DREAM與NRl亞基的結(jié)合"所述一致。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示，3nMTAT-21-40處理神經(jīng)元2小時(shí)，引起胞膜NRl亞基的表達(dá)量下降為sramble-TAT對(duì)照組的44.33±9.40%(尸=0.0274)(圖5，n=3，*尸二0.0274，Paired卜test)。以上結(jié)果說(shuō)明，TAT-21-40通過(guò)抑制麗DA受體在胞膜的表達(dá)，從而減輕其介導(dǎo)的興奮性毒性損傷作用。序列表<110>北京大學(xué)〈120〉抑制興奮性毒性損傷的多肽及其應(yīng)用<160〉5<210〉1〈211〉256<212>PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉<400〉1SerLeuLeu15lieLysTrp30CysLeulieSerSerAspGlyLeuAsp80GinSerLeu95AspGluAsp110AspAlaThrGlyAsnGlyLeuLeuArgMetGinArgThrLysGluAlaMetLysAlaSerAspGly1510GlyAspProGlyArglieProLeuSerLysArgGluGly2025GinArgProArgPheThrArgGinAlaLeuMetArgCys354045LysTrplieLeuSerSerAlaAlaProGinGlySerAsp505560SerGluLeuGluLeuSerThrValArgHisGinProGlu657075GinLeuGinAlaGinThrLysPheThrLysLysGluLeu8590TyrArgGlyPheLysAsnGluCysProThrGlyLeuVal100105ThrPheLysLeulieTyrSerGinPhePheProGinGly115120125ThrTyrAlaHisPheLeuPheAsnAlaPheAspAlaAsp130135140AlalieHisPheGluAspPheValValGlyLeuSerlie145150155160GlyThrValHisGluLysLeuLysTrpAlaPheAsnLeuTyrAsplie165170175AsnLysAspGlyTyrlieThrLysGluGluMetLeuAlalieMetLys180185190SerlieTyrAspMetMetGlyArgHisThrTyrProlieLeuArgLys195200205AspAlaProLeuGluHisValGluArgPhePheGinLysMetAspArg210215220AsnGinAspGlyValValThrlieAspGluPheLeuGluThrCysGin225230235240LysAspGluAsnlieMetSerSerMetGinLeuPheGluAsnVallie245250255〈210>2<211〉105〈212〉PRT〈213〉人工序列<220><223〉<400〉2GlulieAlaTyrLysArgHisLysAspAlaArgArgLysGinMetGin151015LeuAlaPheAlaAlaValAsnValTrpArgLysAsnLeuGinAspArg202530LysSerGlyArgAlaGluProAspProLysLysLysAlaThrPheArg354045AlalieThrSerThrLeuAlaSerSerPheLysArgArgArgSerSer505560LysAspThrSerThrGlyGlyGlyArgGlyAlaLeuGinAsnGinLys65707580AspThrValLeuProArgArgAlalieGluArgGluGluGlyGinLeu859095GinLeuCysSerArgHisArgGluSer100105<210〉3<211〉315<212>腿<213〉人工序列〈220><223〉<400〉3gagatcgcctacaagcgacacaaggatgcccgtaggaagcagatgcagctggcttttgca60gccgtgaacgtgtggaggaagaacctgcaggatagaaagagtggtagagcagagcccgac120cctaaaaagaaagccacatttagggctatcacctccaccctggcctccagcttcaagaga180cgtaggtcctccaaagacacgagcaccgggggtggacgcggcgctttgcaaaaccaaaaa240gacacagtgctgccgcgacgcgctattgagagggaggagggccagctgcagctgtgttcc300cgtcatagggagagc315<210〉4<211〉29<212>PRT〈213〉人工序列<220〉〈223〉<400>4ArgLysLysArgArgGinArgArgArgArglieProLeuSerLysArg151015GluGlylieLysTrpGinArgProArgPheThrArgGin202520<210>5<211>29〈212〉PRT<213〉人工序列<220〉<223〉<400〉5ArgLysLysArgArgGlnArgArgArgArgLysPheGinGlulieArg151015GinLeuThrlieProTrpSerLysProArgArgArgGly202權(quán)利要求1、一種多肽，為如下a)、b)、c)、d)、e)或f)所示的多肽a)、由SEQIDNO.1自N端起第21-40位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；b)、由SEQIDNO.1自N端起第1-50位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；c)、由SEQIDNO.4所示的氨基酸序列組成的多肽；d)、由SEQIDNO.1自N端起第51-256位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；e)、由SEQIDNO.1自N端起第101-256位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；f)、將a)、b)、c)、d)或e)限定的多肽的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的分別由a)、b)、c)、d)或e)限定的多肽衍生的多肽。2、權(quán)利要求1中所述多肽的編碼基因。3、含有權(quán)利要求2所述編碼基因的重組載體、重組菌、表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。4、一種抑制興奮性毒性損傷的藥物，其活性成份為權(quán)利要求1中任一所述多肽或權(quán)利要求2中任一所述編碼基因或權(quán)利要求3中任一所述重組載體。5、權(quán)利要求1中任一所述多肽或權(quán)利要求2中任一所述編碼基因或權(quán)利要求3中任一所述重組載體在制備抑制興奮性毒性損傷的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了抑制興奮性毒性損傷的多肽及其應(yīng)用。該多肽為由SEQIDNO.6所示的氨基酸序列組成的多肽。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的多肽不僅在NMDA損傷前預(yù)處理可以減輕NMDA致細(xì)胞損傷，在NMDA處理后再加入細(xì)胞中仍可以發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，表明多肽對(duì)NMDA受體誘導(dǎo)的興奮性毒性損傷不僅可以發(fā)揮預(yù)防作用，還具有治療作用。因此，本發(fā)明的多肽在抑制興奮性毒性損傷中具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N15/12GK101591386SQ20091008856公開(kāi)日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年7月3日優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日發(fā)明者瑛張,朱彥兵,韻王,萍蘇,濤韓申請(qǐng)人:北京大學(xué)