專利名稱：表達(dá)豬干擾素(α、β或γ)的重組新城疫弱毒疫苗株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種表達(dá)豬干擾素(a、日或 干擾素)的重組新城疫弱毒疫苗株，更具體地，涉及一種表達(dá)豬干擾素(a、0或Y-干
擾素)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。本發(fā)明還公開了制備所述重組新城疫弱毒疫苗 株的方法和該重組新城疫弱毒疫苗株在制備豬a、0或干擾素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干擾素主要是由動(dòng)物細(xì)胞在病毒等誘生劑的作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生的。許多動(dòng)物，包括 人、哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類等都能產(chǎn)生干擾素。根據(jù)干擾素的抗原特性和分子結(jié)構(gòu)分成不同 的類型。干擾素(IFN)分為I型和II型，I型干擾素基因缺少內(nèi)含子，包括a、0、5、《、 t 5種類型，II型僅有、型1種，含有內(nèi)含子。目前所發(fā)現(xiàn)的豬干擾素包括IFN-a、3、 、t禾P IFN- y，并且IFN- T未在其它物種中發(fā)現(xiàn)[1]。豬IFN- a、co，分別是由12個(gè)和 5個(gè)以上的相關(guān)功能基因編碼的蛋白質(zhì)家族組成，這些干擾素的各亞型之間同源性很高，天 然IFN-a常常是IFN-a、co功能基因表達(dá)產(chǎn)物的混合體，而INF-0、 和IFN-Y僅由單 一基因編碼?，F(xiàn)在已完成基因克隆、測序和定位的豬干擾素基因主要包括IFN- a、0、(0和 IFN- y 0干擾素是一種高活性、多功能的生物活性蛋白，具有強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)作用，可明顯 提高機(jī)體抗感染能力。它無論對(duì)病毒、細(xì)菌、立克次氏體、衣原體、原蟲，只要寄生在細(xì)胞內(nèi)， 均有一定的抑制作用。豬白細(xì)胞IFN對(duì)哺乳仔豬和斷奶仔豬病毒性腹瀉或病毒、細(xì)菌混合 感染引起的腹瀉均有良好的預(yù)防和治療效果[2]。IFN具有預(yù)防和治療雙重作用，并且無毒 副作用，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，也不存在藥物殘留。干擾素類產(chǎn)品的開發(fā)為防治動(dòng)物病毒性疾病 開辟了新的途徑，具有良好的推廣應(yīng)用前景。負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作(Reverse genetic)是通過操作病毒基因組cDNA 制造新病毒的過程，其基本過程是①組裝完整的病毒基因組(或重組型基因組)cDNA克 隆，5’末端精確地綴于T7啟動(dòng)子后，3’末端精確綴于自我剪切的核酸酶序列和T7轉(zhuǎn)錄終 止信號(hào)之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板；②以基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板與啟動(dòng)病毒復(fù)制必須的 轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能結(jié)構(gòu)蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表達(dá)質(zhì)粒(T7啟 動(dòng)子)一起，共轉(zhuǎn)染整合表達(dá)T7聚合酶的病毒復(fù)制許可細(xì)胞；③24-72小時(shí)后收獲培養(yǎng)上 清，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲(rescue)病毒。對(duì)基因組cDNA進(jìn)行 突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system,RGS 系統(tǒng))可獲得相應(yīng)的突變或重組的負(fù)鏈RNA病毒。申請(qǐng)人:之前獲得授權(quán)的中國專利“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其 應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?00510097997.8，申請(qǐng)日2005年9月2日)已經(jīng)建立了一種新城疫LaSota 弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，并且成功救獲了野生型病毒株，并且為進(jìn)一步開展新城 疫病毒活載體疫苗研制及重組新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)相關(guān)基礎(chǔ)奠定 了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
基于豬干擾素在治療豬病毒性疾病和免疫調(diào)節(jié)方面廣闊的應(yīng)用前景，本文在已建 立的新城疫病毒疫苗株，如新城疫病毒LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了 表達(dá)豬a、0、Y干擾素基因的全基因組克隆，實(shí)現(xiàn)了豬a、0、Y干擾素在SPF雞胚內(nèi) 高效、穩(wěn)定表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了抗病毒活性研究，探索豬干擾素產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的可行 性。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供以下各項(xiàng)1. 一種表達(dá)編碼豬干擾素的基因的重組新城疫弱毒疫苗株。2.根據(jù)以上1的重組新城疫弱毒疫苗株，其為重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。3.根據(jù)以上1或2的重組新城疫弱毒疫苗株，其中所述豬干擾素是豬a、0或 干擾素，優(yōu)選所述豬a、0和干擾素的氨基酸序列分別如SEQID No. 1、SEQ ID No. 2
和SEQ ID No. 3所示，更優(yōu)選編碼所述豬a、0和y-干擾素的基因如SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 所示。4.根據(jù)以上1或2的重組新城疫弱毒疫苗株，其為rL-Swine a >rL-Swine ^、或 rL-Swine y。5.根據(jù)以上1-4中任何一項(xiàng)的重組新城疫弱毒疫苗株在制備豬干擾素中的應(yīng)用。6. 一種生產(chǎn)以上1-4中任何一項(xiàng)的重組新城疫弱毒疫苗株的方法，該方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入編碼豬干擾素的基因的所述新城疫 弱毒疫苗株的基因組cDNA序列；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫弱毒疫 苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、 和編碼所述新城疫弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述新城疫弱毒疫苗株復(fù)制許可的宿 主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)收獲上清液，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。7.根據(jù)以上6的方法，其中所述重組新城疫弱毒疫苗株是重組新城疫LaSota弱毒 疫苗株。8.根據(jù)以上6或7的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pBRN-FL-SwIFNa、 pBRN-FL-SwIFN ^、或 pBRN-FL-SwIFN Y (基因序列分別見 SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9，質(zhì)粒圖譜分別見圖5-7)。9.根據(jù)以上6或7的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pBSNP、pBSP或pBSL。10.根據(jù)以上6-9中任何一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是BHK-21。11.根據(jù)以上6-10中任何一項(xiàng)的方法制備的重組新城疫弱毒疫苗株，優(yōu)選為 rL-Swine、rL-Swine 旦、或 rL-Swine Y。12. 一種生產(chǎn)豬干擾素的方法，該方法包括1)將根據(jù)以上1-4中任何一項(xiàng)的重組新城疫弱毒疫苗株接種敏感細(xì)胞或接種雞 胚尿囊腔；2)收獲細(xì)胞上清液或雞胚尿囊液。
13.重組新城疫(Newcastle disease virus) LaSota 弱毒疫苗株 rL_Swine a 的 SPF雞胚接種尿囊液，其保藏號(hào)為CGMCC No. 2615。14.重組新城疫(Newcastle disease virus) LaSota 弱毒疫苗株 rL_Swine 3 的 SPF雞胚接種尿囊液，其保藏號(hào)為CGMCC No. 2628。15.重組新城疫(Newcastle disease virus) LaSota 弱毒疫苗株 rL_Swine Y 的 SPF雞胚接種尿囊液，其保藏號(hào)為CGMCC No. 2616。新城疫病毒LaSota株作為表達(dá)載體，分別構(gòu)建表達(dá)豬a、0、Y -干擾素(Swine interferon- a，Swine interferon-旦,Swine interferon- y )完整開方文閱讀框的全基因 組質(zhì)粒 pBRN-FL-SwIFN a、pBRN-FL_SwIFN ^、或 pBRN-FL-SwIFN y，轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞獲得表 達(dá)SwIFN-a、0、y重組新城疫病毒。重組新城疫(Newcastle disease virus)LaSota弱毒 疫苗株rL-Swinea、rL-Swine 0和rL-Swine Y接種的SPF雞胚的雞胚尿囊液于2008年 7月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)分別為CGMCC No. 2615、CGMCC No. 2628和CGMCC No. 2616。采用RT-PCR方法，證實(shí)收獲的雞胚尿囊液內(nèi) 的重組病毒含有相應(yīng)外源基因。將重組病毒尿囊液經(jīng)紫外線照射滅活新城疫病毒，利用表 達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光的重組水皰性口炎病毒(VSV-EGFP)在豬腎細(xì)胞(PK)和牛腎細(xì)胞(MDBK) 細(xì)胞系上測定rL-Swine a，rL-Swine ^，rL-Swine y抗病毒活性，表達(dá)SwIFN的重組 新城疫病毒均能有效抑制VSV-EGFP在PK和MDBK上的復(fù)制，rL-Swine a、rL-Swine 3、 rL-Swine y接種SPF雞胚所收尿囊液抗病毒活性高達(dá)2 X 106 2 X 107IU/mL。結(jié)果表明 SwIFN- a，SwIFN- ^，SwIFN- y 在重組新城疫病毒 rL-Swine a，rL-Swine ^，rL-Swine y 接 種的SPF雞胚尿囊液中獲得良好表達(dá)，并具有高效而穩(wěn)定的抗病毒活性。


圖1.新城疫病毒重組SwIFN基因組cDNA克隆的構(gòu)建(空白矩形框代表NDV LaSota基因，SwIFN基因?yàn)榛疑幱熬匦?，?jīng)Pme I位點(diǎn)插入rLaSota載體，圖下部為SwIFN 基因開放閱讀框，邊框部分表示基因起始信號(hào)和基因終止信號(hào)序列，SwIFN基因起始密碼子 ATG和終止密碼子TAA以下劃線標(biāo)示，SwIFN基因其余部分用逗點(diǎn)表示，Kozak序列用斜體 表示)； 圖2.利用VSV-EGFP-PK系統(tǒng)測定rL-Swine a/^/y抗病毒活性(A D 對(duì)接種 rL-Swine a的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行稀釋(分別地，2 X 104，2 X 105，2 X 106) ；E H 對(duì)接種 rL-Swine 3的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行稀釋(分別地，2 X 104，2 X 105，2 X 106) ；I L:對(duì)接種 rL-Swine y的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行稀釋(分別地，2 X 103，2 X 104，2 X 105) ；M N 對(duì)接種 rLaSota的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行稀釋(分別地，2 X 101，2 X 102) ；0 陰性對(duì)照)；圖3利用VSV-EGFP-MDBK系統(tǒng)測定rL-Swine a/^/y抗病毒活性(A D 對(duì)接種 rL-Swine a的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行稀釋(分別地，2 X 104，2 X 105，2 X 106) ；E H 對(duì)接種 rL-Swine 3的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行稀釋(分別地，2 X 104，2 X 105，2 X 106) ；I L:對(duì)接種 rL-Swine y的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行稀釋(分別地，2 X 103，2 X 104，2 X 105) ；M N 對(duì)接種 rLaSota的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行稀釋(分別地，2 X 101，2 X 102) ；0 陰性對(duì)照)；圖 4. pBRN-FL-Pmel 的質(zhì)粒圖譜；圖 5. pBRN-FL-SwIFN a 質(zhì)粒圖譜；
圖 6. pBRN-FL-SwIFN β 質(zhì)粒圖譜；圖 7. pBRN-FL-SwIFN γ 質(zhì)粒圖譜；圖8.質(zhì)粒pBSNP的序列，帶下劃線的斜體部分是NP基因的編碼序列；圖9.質(zhì)粒pBSP的序列，帶下劃線的斜體部分是P基因的編碼序列；圖10.質(zhì)粒pBSL的序列，帶下劃線的斜體部分是L基因的編碼序列。序列表說明SEQ ID No. 1豬α干擾素氨基酸序列；SEQ ID No. 2豬β干擾素氨基酸序列；SEQ ID No. 3豬γ干擾素氨基酸序列；SEQ ID No. 4豬α干擾素基因；SEQ ID No. 5豬β干擾素基因；SEQ ID No. 6豬γ干擾素基因；SEQ ID No. 7插入豬α干擾素的LaSota基因組序列的質(zhì)粒SEQ ID No. 8插入豬β干擾素的LaSota基因組序列的質(zhì)粒SEQ ID No. 9插入豬γ干擾素的LaSota基因組序列的質(zhì)粒SEQ ID No. IOpBRN-FL-PmeI 的核苷酸序列。
具體實(shí)施例方式下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不 是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。實(shí)施例1豬α、β、Υ干擾素在新城疫病毒LaSota疫苗株中的高效穩(wěn)定表達(dá)及抗 病毒活性檢測材料和方法1 材料表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的重組水皰性口炎病毒VSV-EGFP商購自中 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所_。ΒΗΚ-21細(xì)胞(ATCCCCL-10)、ΡΚ(15)細(xì)胞(ATCC CCL-33)、MDBK(NBL-I)細(xì)胞(ATCCCCL-22)由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清 的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Media) ；SPF雞胚商購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸 醫(yī)研究所；表達(dá)T7聚合酶的痘病毒vTF7-3(ATCC，VR-2153)購自ATCC ；新城疫LaSota克隆 株rLaSota (按照ZL200510097997. 8制備)由本實(shí)驗(yàn)室保存；rLaSota反向遺傳操作系統(tǒng) 基因組轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒PBRN-FL-PmeI (參見葛金英，溫志遠(yuǎn)，王永，等。表達(dá)綠色熒光蛋白重 組新城疫病毒LaSota疫苗株的構(gòu)建[J].微生物學(xué)報(bào)，2006，46 (4) :547 551)(病毒基因 組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBRN-FL-Pmel，含有新城疫病毒的基因組全長cDNA，pBRN-FL-Pmel的序列信息 見SEQ ID No. 10，質(zhì)粒圖譜見圖4)。如ZL200510097997. 8或參考文獻(xiàn)[11]所述，將表達(dá)新城疫病毒(基因組序列 GenBank登錄號(hào)AY845400)的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的開放閱 讀框架(ORF)cDNA分別緊接著克隆在pBlueScript載體(Clontech)質(zhì)粒T7啟動(dòng)子下游， 分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL(序列分別如圖8至10所示)。2表達(dá)豬α、β、Y干擾素基因的全基因組克隆的構(gòu)建參照genebank登錄號(hào)EU364896、EF104599、EU249804委托上海捷瑞生物工程
:pBRN-FL-SwIFNa :pBRN-FL-SwIFN^ :pBRN-FL-SwIFNγ有限公司合成豬干擾素α、β、Y，合成的片段經(jīng)EcoRV酶切位點(diǎn)連入同樣經(jīng)此酶處理的 pBlueScript 載體(Clontech)上，質(zhì)粒命名為 pBS-SwIFNa、pBS_SwIFN3 , pBS-SwIFN γ。以質(zhì)粒 pBS-SwIFN a、pBS-SwIFN β、pBS-SwIFN y 為模板，通過 PCR 引物在干 擾素基因ORF的5'端引入PmeI限制酶識(shí)別序列和NDV自身聚合酶L識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止 序列GE (TTAAGAAAAAA)、轉(zhuǎn)錄起始序列GS (ACGGGTAGAA)及增強(qiáng)基因表達(dá)的Kozak序列 (GCCACC)，在干擾素基因ORF的3'端引入PmeI限制酶識(shí)別序列(所用引物見表1)；為 了確保重組基因組cDNA全長總堿基數(shù)仍保持6的倍數(shù)，在引物GS和Kozak序列之間加入 適當(dāng)數(shù)量堿基進(jìn)行調(diào)整。PCR末端經(jīng)PmeI酶切插入同樣經(jīng)PmeI處理的pBRN-FL-PmeIM 載體內(nèi)，表達(dá)豬α、β、γ干擾素的重組基因組全長cDNA克隆命名為pBRN-FL-SwIFNa、 pBRN-FL-SwIFN β、pBRN-FL-SwIFN γ (圖 1，質(zhì)粒圖譜見附圖 1,2,3) 利用引物 NDV_3#PF 5' -gtccgtgcattgatcatg-3'和各基因PCR所用下游引物鑒定方向。3重組病毒的拯救BHK-21細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)生長達(dá)50 80 %單層時(shí)，轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒 pBRN-FL-SwIFN α、pBRN-FL-SwIFN β、pBRN-FL-SwIFN γ 分別與轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒 pBSNP、pBSP 和pBSL共轉(zhuǎn)染預(yù)先感染VTF7-3的BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染上清經(jīng)0. 22um孔徑濾器過濾后接種 9 11天的SPF雞胚尿囊腔；接種后的SPF雞胚繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，取雞胚尿囊液50 μ 1按 常規(guī)進(jìn)行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑止(HI)試驗(yàn)，詳細(xì)操作方法參見文獻(xiàn)M。收獲 HA及HI試驗(yàn)結(jié)果陽性尿囊液，-70°C凍存，并按常規(guī)方法分別于9-10日齡雞胚尿囊腔接種 進(jìn)行傳代、病毒滴度測定⑷。重組新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Swine α ,rL-Swine β和 rL-Swiney接種的SPF雞胚尿囊液于2008年7月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)分別為CGMCC No. 2615,CGMCC No. 2628和CGMCC No. 2616。
4重組病毒接種雞胚尿囊液抗病毒活性檢測分別取rL-Swine α、rL_Swine β、rL_Swine γ 以及 rLaSota 接種的 SPF 雞胚尿囊 液2ml放入平皿中，置于紫外燈下照射2h，每間隔20min搖動(dòng)一次，以滅活NDV病毒。經(jīng)紫 外線滅活的尿囊液接種SPF雞胚以檢測病毒滅活是否徹底，每胚100 μ L，共接3枚，接種后 的雞胚置37°C孵化器內(nèi)孵化，3天后檢測雞胚尿囊液是否HA陽性。HA陰性樣品分裝，-70°C
保存?zhèn)溆?。用VSV-EGFP-PK 禾Π VSV-EGFP-MDBK 細(xì)胞系統(tǒng)測定 rL-Swine α、rL-Swine β、 rL-Swine γ的抗病毒活性，具體為取滅活后重組病毒rL-Swine α ,rL-Swine β ,rL-Swine Y雞胚尿囊液，每個(gè)樣品100 μ L，用含5 %胎牛血清的DMEM進(jìn)行10倍系列稀釋，在生長 于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的PK和MDBK細(xì)胞上加入2X IO1 2X IO8稀釋的尿囊液，同時(shí)取 相同稀釋倍數(shù)的滅活rLaSota雞胚尿囊液作為對(duì)照組，于37°C作用24h。吸出上清后，接 種VSV-EGFP，劑量為200PFU(噬斑形成單位)/孔感染細(xì)胞，感作Ih后換完全培養(yǎng)液繼續(xù) 培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，24h后熒光顯微鏡觀察結(jié)果。以空白對(duì)照組為對(duì)照，將減少50% VSV-EGFP感染率的樣品的最高稀釋度定為1個(gè)病毒抑制單位(IU)。5重組病毒尿囊液抗病毒穩(wěn)定性檢測取滅活后重組病毒rL-Swine α、rL-Swine β、rL-Swine γ雞胚尿囊液分裝， 100 μ L/管，一部分放4°C冰箱長期保存，每間隔1周取出一份進(jìn)行抗病毒活性檢測；另一部 分放-70°C冰箱，取凍融1次、2次、3次樣品檢測抗病毒活性單位的變化，以檢測反復(fù)凍融對(duì)抗病毒活性的影響。結(jié)果1表達(dá)豬α、β、Y干擾素基因的全基因組克隆的構(gòu)建及鑒定通過PCR引物在干擾素基因SwIFNa、SwIFN β、SwIFN γ的ORF的5'端和3' 端引入PmeI限制酶識(shí)別序列(所用引物見表1)；由于插入的外源基因?yàn)镻meI單切連入 pBRN-FL-Pmel載體，因此克隆質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切的產(chǎn)物應(yīng)有兩條，一條為載體，約為18kb，另 一條為外源基因及其所攜帶的GE/GS等長約500 600bp ；而經(jīng)鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng) 得到比相應(yīng)外源基因大200bp左右的條帶，產(chǎn)物約700 800bp，電泳結(jié)果顯示與預(yù)期相符 (結(jié)果未顯示)。證明表達(dá)豬α、β、γ干擾素的重組基因組全長cDNA克隆構(gòu)建成功，構(gòu)建 示意圖見圖1。表1構(gòu)建表達(dá)豬α、β、Y干擾素基因的全基因組克隆所用引物 注下劃線部分為干擾素基因特異序列，酶切位點(diǎn)用邊框表示，Kozak序列用斜體 表示，基因起始信號(hào)和基因結(jié)束信號(hào)用小寫字符表示，用黑體字符調(diào)整堿基數(shù)以適應(yīng)6的 倍數(shù)規(guī)則。2重組病毒的拯救及鑒定全基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBRN-FL-SwIFN α、pBRN-FL-SwIFN β、pBRN-FL-SwIFN γ 分別 與轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pBSNP、pBSP和pBSL共轉(zhuǎn)染預(yù)先感染vTF7_3的BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染上清 接種后SPF胚繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，取雞胚尿囊液50 μ L按常規(guī)進(jìn)行新城疫病毒的血凝(HA)和 血凝抑止(HI)試驗(yàn)。收獲HA及HI試驗(yàn)結(jié)果陽性尿囊液，-70°C凍存。同時(shí)進(jìn)行RT-PCR 鑒定，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)證明重組病毒基因組內(nèi)含有相應(yīng)的外源基因片段， 至此成功拯救出表達(dá)豬干擾素α、β、Y的重組新城疫病毒，并分別命名為rL-Swine α、 rL-Swine β 禾口 rL_Swine γ。3rL-Swine α、rL-Swine β 和 rL_Swine γ 抗病毒活性檢測收獲的重組病毒尿囊液經(jīng)紫外線滅活，進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋后的樣品處理細(xì) 胞24h，然后按每孔200PFU的接種量感染VSV-EGFP，24h后經(jīng)熒光顯微鏡觀察結(jié)果。2 X IO3 倍稀釋的rL-Swine α和2 X IO4倍稀釋的rL-Swine β可以完全抑制VSV-EGFP的復(fù)制，無熒光出現(xiàn)(圖2A，D)，2X103倍稀釋孔的rL-Swine γ僅有數(shù)個(gè)發(fā)熒光細(xì)胞，可90%以上 抑制VSV-EGFP的復(fù)制。2父104倍稀釋1^-5 士1^ α和rL-Swine γ以及2 X IO5倍稀釋孔 的rL-Swine β可部分抑制VSV-EGFP的復(fù)制，熒光亮度約為對(duì)照組的一半(圖2Β，Ε，H)， 未加干擾素樣品的對(duì)照孔出現(xiàn)大量熒光(圖2L)，VSV-EGFP在PK細(xì)胞中大量復(fù)制。同樣 2 X IO2倍稀釋的rLaSota病毒接種SPF雞胚尿囊液組也出現(xiàn)大量熒光(圖2K)，不能抑制 VSV-EGFP的復(fù)制，但是10倍稀釋時(shí)可以非特異性的部分抑制VSV-EGFP在PK細(xì)胞中的復(fù) 制(圖2J)。測得rL-Swine α、rL-Swine β在PK細(xì)胞上的抗病毒活性為2X106IU/mL, rL-Swine Y 抗病毒活性為 2 X 105IU/mL。經(jīng)同樣處理的MDBK細(xì)胞接種VSV-EGFP 24h后經(jīng)熒光顯微鏡觀察結(jié)果。2 X IO6倍 稀釋的rL-Swine α和rL-Swine β以及2X IO5倍稀釋的rL-Swine γ可以抑制90%的 VSV-EGFP在MDBK細(xì)胞上的復(fù)制(圖3A，D，G)，2X IO6倍稀釋孔的rL-Swine β僅有數(shù)個(gè)發(fā) 熒光細(xì)胞。2 X IO7倍稀釋rL-Swine α和rL-Swine β以及2 X IO6倍稀釋孔的rL-Swine Y可部分抑制VSV-EGFP的復(fù)制，熒光亮度約為對(duì)照組的一半(圖3B，E，H)，2X IO8倍稀釋 rL-Swine α和rL-Swine β以及2X IO7倍稀釋孔的rL-Swine Y與未加干擾素樣品的對(duì) 照孔一樣出現(xiàn)大量熒光(圖2C，F(xiàn)，I)，幾乎不能抑制VSV-EGFP在MDBK細(xì)胞中大量復(fù)制。測 得 rL-Swine α , rL-Swine β 在 MDBK 細(xì)胞上的抗病毒活性為 2 X 108IU/mL，rL-Swine γ 抗病毒活性為2X107IU/mL。4重組病毒尿囊液抗病毒穩(wěn)定性檢測rL-Swine α、rL-Swine β、rL-Swine γ接種的雞胚尿囊液經(jīng)反復(fù)凍溶3次后， 利用VSV-EGFP-PK細(xì)胞系統(tǒng)測定抗病毒活性無明顯下降；4°C保存可長達(dá)10天其抗病毒活 性無明顯下降，仍具有高達(dá)IO6TCID5ciAiL抗病毒活性?？梢栽趥鹘y(tǒng)冷藏條件下長途運(yùn)輸而 不影響使用。當(dāng)前，豬的病毒性疾病危害嚴(yán)重，而目前尚無特效藥物可以治療病毒性疾病。盡管 一些化學(xué)合成的抗病毒藥物如鹽酸金剛烷胺、利巴韋林等對(duì)少數(shù)病毒病有一定的作用，但 由于這些藥物在人醫(yī)上也廣泛應(yīng)用，為防止藥物殘留及耐藥性的產(chǎn)生，目前已禁止在獸醫(yī) 臨床上應(yīng)用；而干擾素具有的生物學(xué)活性，及其速效多能的特點(diǎn)使其在防治病毒性傳染病， 抑制腫瘤生長，促進(jìn)增重等方面具有重要意義；因此，研究開發(fā)的豬基因工程可有效控制當(dāng) 前對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重的病毒性疾病，因此，重組豬干擾素具有廣闊的應(yīng)用前景。目前人重組干擾素和細(xì)胞因子產(chǎn)品已廣泛用于人類醫(yī)學(xué)臨床，但動(dòng)物干擾素和細(xì) 胞因子的應(yīng)用在我國獸醫(yī)臨床中才剛剛起步。正常情況下，動(dòng)物體內(nèi)干擾素和細(xì)胞因子基 因處于封閉狀態(tài)，只有在病毒感染或誘導(dǎo)下才表達(dá)干擾素基因，但是表達(dá)量很小，因此單靠 病毒感染自身誘導(dǎo)的干擾素對(duì)病毒性疾病和細(xì)胞內(nèi)寄生菌和寄生蟲病的治療作用是微乎 其微的；而且由于其表達(dá)量低，也非常難以提取純化。因此，在考慮使用干擾素防治動(dòng)物病 毒性疾病時(shí)，最好采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)；采用基因工程技術(shù)原核表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)干擾素和 細(xì)胞因子具有活性效價(jià)高、產(chǎn)量大、成本低廉、生產(chǎn)速度快、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此可 以在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。近年來分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，干擾素的研究也日益深入，特別是PCR技術(shù)的廣 泛應(yīng)用，極大地推動(dòng)了動(dòng)物干擾素基因的研究，動(dòng)物干擾素基因的克隆與表達(dá)成為研究熱 點(diǎn)，采用基因工程的方法研制重組干擾素已成為干擾素制劑研究的重點(diǎn)。最初以在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)豬α干擾素為主，表達(dá)純化的蛋白經(jīng)過復(fù)性具有明顯的抗病毒生物學(xué) 活性[5]。證明了原核表達(dá)PoIFN-α的可行性及將基因工程原核表達(dá)的PoIFN-α真正用于 生產(chǎn)實(shí)踐中作為抗病毒制劑的可行性。但原核表達(dá)蛋白經(jīng)常以包涵體的形式出現(xiàn)，需要經(jīng) 過變性、復(fù)性的過程，復(fù)性不完全還可能導(dǎo)致干擾素的生物學(xué)活性不能正常發(fā)揮，而且純化 過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，生產(chǎn)成本高限制了干擾素的大規(guī)模應(yīng)用。萬建青等[6]利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表 達(dá)豬干擾素，嘗試真核表達(dá)干擾素取得了成功。秦立廷等[7]嘗試?yán)脳U狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表 達(dá)豬Y干擾素，重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清具有高達(dá)105TCID5(l/mL個(gè)抗病毒活 性單位。杜以軍等[8]利用豬IFN-α的成熟蛋白基因構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pAd-poIFN-a 轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，滴度為107TCID5(1/mL。并經(jīng)RT-PCR證明目的基因在mRNA水平上的有 效表達(dá)；在PK-15細(xì)胞上可以檢測到較強(qiáng)的抗豬口蹄疫病毒活性。國內(nèi)外研究資料顯示重 組豬干擾素對(duì)水泡性口炎病毒(VSV)、流感病毒[9]、傳染性胃腸炎病毒(TGEV) _、豬繁殖與 呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)[11]、口蹄疫病毒(FMDV) [12]均有明顯的抑制作用。新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的成功建立使NDV作為活載體的應(yīng)用得到了廣泛 研究。2001-2002年，Palese. P. [13]等相繼構(gòu)建表達(dá)Hl亞型流感病毒HA免疫原基因的重組 NDV Bl株和表達(dá)H7亞型流感病毒HA免疫原基因的重組NDVB 1株。2004年，Samal S. [14] 等采用LaSota疫苗株為活載體，構(gòu)建了表達(dá)傳染性法氏囊病毒(IBDV)變異株GLS-5的重 組新城疫病毒，免疫雛雞可有效抵御IBDV變異株及新城疫強(qiáng)毒的攻擊。2007年，Ge J[15] 等以LaSota疫苗株為活載體，構(gòu)建表達(dá)H5亞型高致病力禽流感病毒HA基因，免疫雛雞可 100%抵抗H5亞型高致病力禽流感病毒的致死性攻擊。NDV作為載體具有無可比擬的優(yōu)勢，LaSota疫苗株具有良好的安全性和外源基因 遺傳穩(wěn)定性，生產(chǎn)成本低廉，表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)品不僅接近天然狀態(tài)，而且無須純化，重復(fù) 性好便于產(chǎn)業(yè)化。為此，在前人研究的基礎(chǔ)上，利用新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，在新城 疫病毒基因組骨架上成功克隆了豬α、β、Y干擾素，并拯救出穩(wěn)定表達(dá)豬α、β、Y干擾 素的重組新城疫病毒-rL-Swine α、rL_Swine β和rL-Swine γ。利用VSV-EGFP-PK細(xì)胞 系統(tǒng)測定rL-Swine α ,rL-Swine β ,rL-Swine Y接種的雞胚尿囊液具有高達(dá)IO6TCID5tl/ mL抗病毒活性，經(jīng)反復(fù)凍溶或4°C長期保存其抗病毒活性無明顯下降。此外，利用MDBK細(xì) 胞測定rL-Swine α , rL-Swine β和rL-Swine Y的抗病毒活性，結(jié)果證明豬干擾素可以 誘導(dǎo)牛細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)，而且活性高達(dá)108TCID5(l/mL，可以同時(shí)作為豬、牛通用干擾素 應(yīng)用。以新城疫病毒LaSota株為載體表達(dá)豬α、β、γ干擾素既具有高水平抗病毒活性， 又便于大規(guī)模生產(chǎn)，具有光明的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)[l]Cao R B, Zhang S F, Cai M H. et al. 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110105]<170>PatentIn version 3.10106]<210>10107]<211>1890108]<212>PRT0109]<213> 豬0110]<400>10111]Met AlaProThrSerAlaPheLeuThrAlaLeuValLeuLeuSerCys0112]1510150113]Asn AlalieCysSerLeuGlyCysAspLeuProGlnThrHisSerLeu0114]2025300115]Ala HisThrArgAlaLeuArgLeuLeuAlaGlnMetArgArglieSer0116]3540450117]Pro PheSerCysLeuAspHisArgArgAspPheGlySerProHisGlu0118]5055600119]Ala PheGlyGlyAsnGlnValGlnLysAlaGlnAlaMetAlaLeuVal0120]657075800121]His GluMetLeuGlnGlnThrPheGlnLeuPheSerThrGluGlySer0122]8590950123]Ala AlaAlaTrpAspGluSerLeuLeuHisGlnPheCysThrGlyLeu0124]1001051100125]Asp GlnGlnLeuArgAspLeuGluAlaCysValMetGlnGluAlaGly0126]1151201250127]Leu GluGlyThrProLeuLeuGluGluAspSerlieLeuAlaValArg0128]1301351400129]Lys TyrPheHisArgLeuThrLeuTyrLeuGlnGluLysSerTyrSer0130]1451501551600131]Pro CysAlaTrpGlulieValArgAlaGluValMetArgSerPheSer0132]1651701750133]Ser SerArgAsnLeuGlnAspArgLeuArgLysLysGlu0134]1801850135]<210>20136]<211>1860137]<212>PRT0138]<213> 豬0139]<400>20140]Met AlaAsnLysCyslieLeuGlnlieAlaLeuLeuMetCysPheSer0141]1510150142]Thr ThrAlaLeuSerMetSerTyrAspValLeuArgTyrGlnGlnArg0143]202530
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354045
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Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln 155160
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47[1509cttggtctaacaatgtcccccggtcagaggagttcagcagcatccgtacggacccggcat13440[1510tctggtttcactcaaaatggtccacagccaagtttgcatggctccatataaaacagatcc13500[1511agaggcatctgatggtggcagctaggacaaggtctgcggccaacaaattggtgatgctaa13560[1512cccataaggtaggccaagtctttgtcactcctgaacttgtcgttgtgacgcatacgaatg13620[1513agaacaagttcacatgtcttacccaggaacttgtattgatgtatgcagatatgatggagg13680[1514gcagagatatggtcaacataatatcaaccacggcggtgcatctcagaagcttatcagaga13740[1515aaattgatgacattttgcggttaatagacgctctggcaaaagacttgggtaatcaagtct13800[1516acgatgttgtatcactaatggagggatttgcatacggagctgtccagctactcgagccgt13860[1517caggtacatttgcaggagatttcttcgcattcaacctgcaggagcttaaagacattctaa13920[1518ttggcctcctccccaatgatatagcagaatccgtgactcatgcaatcgctactgtattct13980[1519ctggtttagaacagaatcaagcagctgagatgttgtgtctgttgcgtctgtggggtcacc14040[1520cactgcttgagtcccgtattgccgcaaaggcagtcaggagccaaatgtgcgcaccgaaaa14100[1521tggtagactttgatatgatccttcaggtactgtctttcttcaagggaacaatcatcaacg14160[1522ggtacagaaagaagaatgcaggtgtgtggccgcgagtcaaagtggatacaatatatggga14220[1523aggtcattgggcaactacatgcagattcagcagagatttcacacgatatcatgttgagag14280[1524agtataagagtttatctgcacttgaatttgagccatgtatagaatatgaccctgtcacca14340[1525acctgagcatgttcctaaaagacaaggcaatcgcacaccccaacgataattggcttgcct14400[1526cgtttaggcggaaccttctctccgaagaccagaagaaacatgtaaaagaagcaacttcga14460[1527ctaatcgcctcttgatagagtttttagagtcaaatgattttgatccatataaagagatgg14520[1528aatatctgacgacccttgagtaccttagagatgacaatgtggcagtatcatactcgctca14580[1529aggagaaggaagtgaaagttaatggacggatcttcgctaagctgacaaagaagttaagga14640[1530actgtcaggtgatggcggaagggatcctagccgatcagattgcacctttctttcagggaa14700[1531atggagtcattcaggatagcatatccttgaccaagagtatgctagcgatgagtcaactgt14760[1532cttttaacagcaataagaaacgtatcactgactgtaaagaaagagtatcttcaaaccgca14820[1533atcatgatccgaaaagcaagaaccgtcggagagttgcaaccttcataacaactgacctgc14880[1534aaaagtactgtcttaattggagatatcagacaatcaaattgttcgctcatgccatcaatc14940[1535agttgatgggcctacctcacttcttcgaatggattcacctaagactgatggacactacga15000[1536tgttcgtaggagaccctttcaatcctccaagtgaccctactgactgtgacctctcaagag15060[1537tccctaatgatgacatatatattgtcagtgccagagggggtatcgaaggattatgccaga15120[1538agctatggacaatgatctcaattgctgcaatccaacttgctgcagctagatcgcattgtc15180[1539gtgttgcctgtatggtacagggtgataatcaagtaatagcagtaacgagagaggtaagat15240[1540cagacgactctccggagatggtgttgacacagttgcatcaagccagtgataatttcttca15300[1541aggaattaattcatgtcaatcatttgattggccataatttgaaggatcgtgaaaccatca15360[1542ggtcagacacattcttcatatacagcaaacgaatcttcaaagatggagcaatcctcagtc15420[1543aagtcctcaaaaattcatctaaattagtgctagtgtcaggtgatctcagtgaaaacaccg15480[1544taatgtcctgtgccaacattgcctctactgtagcacggctatgcgagaacgggcttccca15540[1545aagacttctgttactatttaaactatataatgagttgtgtgcagacatactttgactctg15600[1546agttctccatcaccaacaattcgcaccccgatcttaatcagtcgtggattgaggacatct15660[1547cttttgtgcactcatatgttctgactcctgcccaattagggggactgagtaaccttcaat15720[1548actcaaggctctacactagaaatatcggtgacccggggactactgcttttgcagagatcc15780[1549agcgactagaagcagtgggattactgagtcctaacattatgactaatatcttaactaggc15840[1550cgcctgggaatggagattgggccagtctgtgcaacgacccatactctttcaattttgaga15900[1551ctgttgcaagcccaaatattgttcttaagaaacatacgcgaagagtcctatttgaaactt15960[1552gttcaaatcccttattgtctggagtgcacacagaggataatgaggcagaagagaaggcat16020[1553tggctgaattcttgcttaatcaagaggtgattcatccccgcgttgcgcatgccatcatgg16080[1554aggcaagctctgtaggtaggagaaagcaaattcaagggcttgttgacacaacaaacaccg16140[1555taattaagattgcgcttactaggaggccattaggcataaagaggctgatgcggatagtca16200[1556attattctagcatgcatgcaatgctgtttagagacgatgttttttcctccagtagatcca16260[1557accaccccttagtctcttctaatatgtgttctctgacactggcagactatgcacggaata16320[1558gaagctggtcacctttgacgggaggcaggaaaatactgggtgtatctaatcctgatacga16380[1559tagaactcgtagagggtgagattcttagtgtaagcggagggtgtacaagatgtgacagcg16440[1560gagatgaacaatttacttggttccatcttccaagcaatatagaattgaccgatgacacca16500[1561gcaagaatcctccgatgagggtaccatatctcgggtcgaagacacaggagaggagagctg16560[1562cctcacttgcaaaaatagctcatatgtcgccacatgtaaaggctgccctaagggcatcat16620[1563ccgtgttgatctgggcttatggggataatgacgtaaattggactgctgctcttacgattg16680[1564caaaatctcggtgtaatgtaaacttagagtatcttcggttactgtcccctttacccacgg16740[1565ctgggaatcttcaacatagactagatgatggtataactcagatgacattcacccctgcat16800[1566ctctctacaggtgtcaccttacattcacatatccaatgattctcaaaggctgttcactga16860[1567agaaggagtcaaagaggggaatgtggtttaccaacagagtcatgctcttgggtttatctc16920[1568taatcgaatcgatatttccaatgacagcaaccaggacatatgatgagatcacactgcacc16980[1569tacatagtaaatttagttgctgtatcagagaagcacctgttgcggttcctttcgagctac17040[1570ttggggtggtaccggaactgaggacagtgacctcaaataagtttatgtatgatcctagcc17100[1571ctggatcggagggagactttgcgagacttgacttagctatcttcaagagttatgagctta17160[1572atctggagtcatatcccacgatagagctaatgaacattctttcaatatccagcgggaagt17220[1573tgattggccagtctgtggtttcttatgatgaagatacctccataaagaatgacgccataa17280[1574tagtgtacgacaatacccgaaattggatcagtgaagctcagaattcagatgtggtccgcc17340[1575tatttgaatatgcagcacttgaagtgctcctcaactgttcttaccaactctattacctga17400[1576gagtaagaggcctagacaatattgtcttatatatgggtgatttatacaagaatatgccag17460[1577gaattctactttccaacattgcagctacaatatctcatcccgtcattcattcaaggttac17520[1578atgcagtgggcctggtcaaccatgacggatcacaccaacttgcagatacggattttatcg17580[1579aaatgtctgcaaaactattagtatcttgcacccgacgtgtgatctccggcttatattcag17640[1580gaaataagtatgatctgctgttc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50
權(quán)利要求
一種表達(dá)編碼豬干擾素的基因的重組新城疫弱毒疫苗株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組新城疫弱毒疫苗株，其為重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組新城疫弱毒疫苗株，其中所述豬干擾素是豬α、β和 Y-干擾素，優(yōu)選所述豬α、β和Y-干擾素的氨基酸序列分別如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，更優(yōu)選編碼所述豬α、β和γ -干擾素的基因如SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組新城疫弱毒疫苗株，其為rL-Swineα ,rL-Swine β、或 rL-Swineγ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的重組新城疫弱毒疫苗株在制備豬干擾素中的應(yīng)用。
6.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的重組新城疫弱毒疫苗株的方法，該方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入編碼豬干擾素的基因的所述新城疫弱毒 疫苗株的基因組cDNA序列；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫弱毒疫苗株 的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和 編碼所述新城疫弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述新城疫弱毒疫苗株復(fù)制許可的宿主細(xì) 胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)收獲上清液，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述重組新城疫弱毒疫苗株是重組新城疫LaSota弱毒 疫苗株。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pBRN-FL-SwIFNa、 pBRN-FL-SwIFN β、或 pBRN-FL-SwIFN γ。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pBSNP、pBSP或pBSL。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任何一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是BHK-21。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10中任何一項(xiàng)的方法制備的重組新城疫弱毒疫苗株，優(yōu)選為 rL-Swine a、rL-Swine β、或 rL-Swine γ。
12.—種生產(chǎn)豬干擾素的方法，該方法包括1)將根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的重組新城疫弱毒疫苗株接種敏感細(xì)胞或接種雞 胚尿囊腔；2)收獲細(xì)胞上清液或雞胚尿囊液。
13.重組新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Swineα的SPF雞胚尿囊液，其保藏號(hào)為CGMCC No.2615。
14.重組新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Swineβ的SPF雞胚尿囊液，其保藏號(hào)為CGMCC No.2628。
15.重組新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Swineγ的SPF雞胚尿囊液，其保藏號(hào)為CGMCC No.2616。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)豬干擾素(α、β或γ-干擾素)的重組新城疫弱毒疫苗株，具體地，涉及表達(dá)豬干擾素(α、β或γ-干擾素)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。本發(fā)明還公開了制備所述重組新城疫弱毒疫苗株的方法和該重組新城疫弱毒疫苗株在制備豬α、β或γ-干擾素中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101880652SQ20091008845
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2009年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月1日
發(fā)明者步志高, 葛金英 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所