專(zhuān)利名稱(chēng)：調(diào)節(jié)植物葉片轉(zhuǎn)綠過(guò)程的蛋白、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)植物葉片轉(zhuǎn)綠過(guò)程的蛋白、 其編碼基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要器官，影響農(nóng)作物的生物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。人工 控制植物葉片顏色變化對(duì)快速改良或者培育新的園藝植物品種具有重要意義。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，因此，延長(zhǎng)葉綠體的功能對(duì)于提高生物產(chǎn)量 或者經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有重要的意義。另外，在園藝觀賞植物中，觀葉植物也是越來(lái)越受到人們的 重視。目前，這些觀賞植物都是從自然突變體或者通過(guò)人工誘變后篩選獲得的突變體。隨 著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因定向培育植物新品種顯示出快速、效率高等特點(diǎn)。但是，目前在植物中發(fā)現(xiàn)的控制葉片顏色變化的基因還為數(shù)不多。在擬南芥整個(gè) 生育期中，到目前為止只有少數(shù)幾個(gè)基因已被報(bào)道能控制葉片逐漸轉(zhuǎn)綠。因此，本領(lǐng)域還有必要進(jìn)行深入的研究，以找到效果明顯的可調(diào)控植物葉片顏色 變化的基因，從而為轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物或者園藝植物提供良好的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)節(jié)植物葉片調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀(如促進(jìn)植 物葉片的轉(zhuǎn)綠)的蛋白、其編碼基因及應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組(a)如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失 或添加而形成的，且具有(a)所述多肽的功能的由(a)衍生的多肽。在一個(gè)優(yōu)選例中，(a)所述多肽的功能是調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀(如促進(jìn)植物 葉片的轉(zhuǎn)綠)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，所述的多 核苷酸選自下組(a)編碼所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多核苷酸編碼SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示的核苷 酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有所述的載體；或基因組中整合有所述的多核苷酸。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種所述的多肽的制備方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；(b)從培養(yǎng)物中分離出所述的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀是調(diào)節(jié)(如促進(jìn))植物葉片的轉(zhuǎn)綠。在另一優(yōu)選例中，所述的植物選自下組禾本科、薔薇科、或十字花科。在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括(但不限于)擬南芥、水稻、煙草、瓜果、蔬菜、
油菜等。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的方法包括(1)將所述的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入所述的多核 苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述的多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生 成植物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的方法包括步驟(si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有所述的多核苷酸；(s2)將植物細(xì)胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述的 多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(s3)選擇出轉(zhuǎn)入了所述的多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(S3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種轉(zhuǎn)基因的植物，其由所述的制備轉(zhuǎn)基因植物的方 法制備。在本發(fā)明的另一方面，提供一種所述的多肽或其編碼基因的激動(dòng)劑或拮抗劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多肽的拮抗劑選自(但不限于)抗所述多肽的抗體，干 擾所述多肽的編碼基因表達(dá)的干擾分子。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽的拮抗劑是含有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列的 干擾分子。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備植物的方法，所述植物的葉片具有黃化(部 分葉片黃化或全部葉片黃化)的性狀，所述的方法包括降低植物中所述的多肽的表達(dá)量；或使植物中所述的多肽不表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的方法包括(1)將干擾所述的多核苷酸表達(dá)的干擾分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，獲 得轉(zhuǎn)化入所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成 植物。在另一優(yōu)選例中，所述的干擾所述的多核苷酸表達(dá)的干擾分子是在植物體內(nèi)形成 microRNA的分子；優(yōu)選的，所述的干擾分子含有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種植物，所述的植物葉片具有黃化的性狀，其由以下
5方法制備獲得降低植物中所述的多肽的表達(dá)量；或使植物中所述的多肽不表達(dá)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。


圖1顯示了野生型擬南芥(WT)，突變型擬南芥(clpr4)，在突變型擬南芥中轉(zhuǎn)化野 生型的ClpR4基因后獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥(ClpR4in clpr4)，在野生型擬南芥中轉(zhuǎn)入干擾 野生型擬南芥中ClpR4基因表達(dá)的干擾分子后獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Ami-clpr4)的表型。 其中，箭頭所指為黃色葉片。圖2顯示了擬南芥AtClpR4_GFP融合蛋白定位于葉綠體中。圖3顯示了野生型擬南芥以及AtClpR4功能缺失的突變型擬南芥的葉綠體超微結(jié) 構(gòu)。圖4顯示了 AtClpR4基因在擬南芥中表達(dá)的組織特異性分析。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，找到一種新的基因一ClpR4基因，并且將之與植物的 葉片轉(zhuǎn)綠過(guò)程相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)ClpR4基因的低表達(dá)或缺失表達(dá)使得植物對(duì)新生葉片轉(zhuǎn)綠變慢 (植物新生葉片黃化)。并且，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，ClpR4蛋白是一個(gè)定位于葉綠體中的蛋白 水解酶。利用本發(fā)明的ClpR4基因可調(diào)節(jié)植物葉片顏色性狀，調(diào)節(jié)植物光合作用效率。如本文所用，所述的“植物”包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述 的“植物”包括但不限于十字花科蕓薹屬的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、禾本科的水 稻、玉米、薔薇科的櫻桃，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化 的。如本文所用，“分離的ClpR4蛋白”或“分離的ClpR4多肽”是指ClpR4蛋白基本上 不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白 質(zhì)純化技術(shù)純化ClpR4蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主 帶?！癆tClpR4蛋白”或“AtClpR4多肽”是指擬南芥的“ClpR4蛋白”或“ClpR4多肽”。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選的是重組多肽。本發(fā)明 的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主 (例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿 主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括 起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括ClpR4蛋白的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍 生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的ClpR4蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。 本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基 (優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成 熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多 肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或 用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和 類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。任何一種ClpR4蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，ClpR4蛋白 的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長(zhǎng)的ClpR4蛋白的全部或部分 功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長(zhǎng)ClpR4蛋白的活性。在更優(yōu) 選的條件下，所述活性片段能夠保持全長(zhǎng)ClpR4蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、 或100%的活性。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“ClpR4蛋白”指具有ClpR4蛋白活性的SEQ ID NO 3序列的多 肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與ClpR4蛋白相同功能的、SEQ ID NO :3序列的變異形式。這些變 異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最 佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨 基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的 功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功 能。該術(shù)語(yǔ)還包括ClpR4蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突 變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與ClpR4蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗 ClpR4蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含ClpR4蛋白或其 片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了 ClpR4蛋白的可溶性片段。通 常，該片段具有ClpR4蛋白序列的至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸， 較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù) 氨基酸。發(fā)明還提供ClpR4蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然ClpR4蛋白的差別可 以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些 多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴 露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物 還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在 的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例 舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化 了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“ClpR4蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 3的氨基酸序列相比， 有至多20個(gè)，較佳地至多10個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近 的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表 1 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明ClpR4蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成 熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO :1或SEQID NO 2所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn) 并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID N0:3的蛋白 質(zhì)，但與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQ ID NO 3的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成 熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列) 以及非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包 括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或 非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多 核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫 度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C;或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50% (ν/ν) 甲酰胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在 90%以上，更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO 3所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至 少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核 苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼ClpR4蛋白 的多聚核苷酸。應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的ClpR4基因優(yōu)選獲自擬南芥，但是獲自其它植物的與擬南 芥ClpR4基因高度同源(如具有80%以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的 其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的， 例如BLAST。本發(fā)明的ClpR4蛋白核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或 人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi) 放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制 備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。—旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通 過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生
9物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載 體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或ClpR4蛋白 編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984 ；224 1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷 酸序列來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的ClpR4蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼ClpR4蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，ClpR4蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載 體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他 載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重 要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含ClpR4蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn) 錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組 技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表 達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母； 植物細(xì)胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將 會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用 于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔 的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械 方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方 法，例如噴灑法、葉盤(pán)法、水稻幼胚轉(zhuǎn)化法等。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī) 方法再生成植株，從而獲得葉片顏色性狀發(fā)生改變的植物。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)) 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
I=I O重組的ClpR4蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進(jìn)或?qū)笴lpR4蛋白 功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組ClpR4蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有價(jià)值的 能抑制或刺激ClpR4蛋白功能的多肽分子。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或 DNA芯片(又稱(chēng)為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析。用ClpR4蛋白 特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)ClpR4蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明提供了所述的ClpR4蛋白的用途，用于調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀(如促進(jìn) 植物葉片轉(zhuǎn)綠)；或用于篩選對(duì)于調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀有用的物質(zhì)(即所述物質(zhì)通過(guò) 調(diào)節(jié)ClpR4蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀)。作為一種優(yōu)選方式，所述的ClpR4蛋 白可用于促進(jìn)植物葉片轉(zhuǎn)綠或提高植物光合作用效率。比如，對(duì)于某些ClpR4蛋白表達(dá)低 下的植物或植株，可通過(guò)制備該種植物或植株的ClpR4蛋白提高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，來(lái)促 進(jìn)植物葉片轉(zhuǎn)綠或提高植物光合作用效率，達(dá)到改良植物的目的。所述的ClpR4蛋白還可用于制備促進(jìn)植物葉片轉(zhuǎn)綠或提高植物光合作用效率的 組合物。本發(fā)明還涉及ClpR4的激動(dòng)劑或拮抗劑及其用途。由于ClpR4的激動(dòng)劑或拮抗劑 可調(diào)節(jié)ClpR4的表達(dá)和/或調(diào)節(jié)ClpR4的活性等，因此，所述的ClpR4的激動(dòng)劑或拮抗劑也 可通過(guò)對(duì)ClpR4的影響來(lái)調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀或調(diào)節(jié)植物光合作用效率，從而達(dá)到改 良植物的目的。任何可提高ClpR4蛋白的活性、提高ClpR4蛋白的穩(wěn)定性、促進(jìn)ClpR4蛋白的表 達(dá)、延長(zhǎng)ClpR4蛋白有效作用時(shí)間、或促進(jìn)ClpR4的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作 為可用于促進(jìn)植物葉片轉(zhuǎn)綠或提高植物光合作用效率的有效物質(zhì)。任何可降低ClpR4蛋白 的活性、降低ClpR4蛋白的穩(wěn)定性、抑制ClpR4蛋白的表達(dá)、減少ClpR4蛋白有效作用時(shí)間、 或降低ClpR4的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為ClpR4的拮抗劑，如抗所述ClpR4 蛋白的抗體，干擾所述ClpR4蛋白的編碼基因表達(dá)的干擾分子(如可形成microRNA的干擾 分子)。所述的拮抗劑可用于制備葉片顏色性狀改變的植物，如葉片黃化的植物。在得知了 靶序列后，制備干擾特定基因表達(dá)的干擾分子的方法是本領(lǐng)域人員熟知的。本發(fā)明還涉及一種改良植物的方法，該方法包括調(diào)節(jié)所述植物中ClpR4基因或其 同源基因的表達(dá)。一方面，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)植物葉片轉(zhuǎn)綠或提高植物光合作用效率的方法， 所述的方法包括使所述植物過(guò)量表達(dá)ClpR4蛋白。另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備葉片具有黃化性狀的植物的方法，所述的方法包括降低所述植物中ClpR4蛋白的表達(dá)(包括使ClpR4蛋白不表達(dá)或低表達(dá))。在得知了所述的ClpR4蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)調(diào) 節(jié)所述的ClpR4蛋白的表達(dá)。比如可通過(guò)本領(lǐng)域人員已知的途徑將攜帶ClpR4基因的表達(dá) 單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性的ClpR4蛋白。此外，也可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)降低ClpR4蛋白的表達(dá)或使之缺 失表達(dá)，比如將攜帶反義ClpR4基因的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上， 使得細(xì)胞或植物組織不表達(dá)或降低表達(dá)ClpR4蛋白。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，將編碼ClpR4蛋白的基因通過(guò)常規(guī)的方法克隆到適 當(dāng)?shù)妮d體中，將所述的帶有外源基因的重組載體導(dǎo)入到可表達(dá)所述ClpR4蛋白的植物細(xì)胞 中，使所述的植物細(xì)胞表達(dá)ClpR4蛋白。可通過(guò)將所述植物細(xì)胞再生成植物，獲得過(guò)量表達(dá) ClpR4蛋白的植物。優(yōu)選的，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(1)將外源的ClpR4蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或組織，獲得轉(zhuǎn)化 入ClpR4蛋白的編碼基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了外源ClpR4蛋白的編碼基因的植物細(xì)胞、組織、器官 或種子再生成植物植株。作為一種優(yōu)選的實(shí)例，所述的方法包括步驟(si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有ClpR4蛋白的編碼基因；(s2)將植物細(xì)胞、組織、器官與步驟(si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使ClpR4蛋白的編 碼基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(S3)選擇出轉(zhuǎn)入ClpR4蛋白的編碼基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。其它增加ClpR4基因或其同源基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。例如，可通過(guò)用 強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)ClpR4基因或其同源基因的表達(dá)?；蛘咄ㄟ^(guò)增強(qiáng)子(如水稻waxy 基因第一內(nèi)含子、Actin基因第一內(nèi)含子等)來(lái)增強(qiáng)該ClpR4基因的表達(dá)。適用于本發(fā)明 方法的強(qiáng)啟動(dòng)子包括但不限于35s啟動(dòng)子，水稻、玉米的Ubi啟動(dòng)子等。優(yōu)選的，提供了一種制備葉片具有黃化性狀的植物的方法，包括降低植物中 ClpR4蛋白的表達(dá)量；或使植物中ClpR4蛋白不表達(dá)。更優(yōu)選地，所述的方法包括(1)將 干擾ClpR4基因表達(dá)的干擾分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入所述干擾分 子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述干擾分子的植物細(xì) 胞、組織、器官或種子再生成植物。其它抑制ClpR4基因或其同源基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。本發(fā)明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括轉(zhuǎn)入了 ClpR4 基因或其同源基因的轉(zhuǎn)基因植物；或者ClpR4蛋白表達(dá)量(包括低表達(dá)或不表達(dá))降低的 植物等?？刹捎萌魏芜m當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來(lái)實(shí)施所述的方法。此外，本發(fā)明還涉及利用植物葉片轉(zhuǎn)綠性狀作為一種基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標(biāo) 記。此外，還可利用ClpR4基因相關(guān)的葉片轉(zhuǎn)綠特性作為雜交制種過(guò)程中真雜種的指示標(biāo)記。
此外，本發(fā)明還提供篩選可調(diào)節(jié)植物葉片顏色性狀或植物光合作用效率的潛在物 質(zhì)的方法。在得知了所述的ClpR4蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來(lái)篩選 調(diào)節(jié)植物葉片顏色性狀或調(diào)節(jié)植物光合作用效率的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，提供一種篩選調(diào)節(jié)植物葉片顏色性狀或植物光合作 用效率的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達(dá)ClpR4蛋白的體系接觸，檢 測(cè)候選物質(zhì)對(duì)ClpR4蛋白的影響；若所述候選物質(zhì)可提高或降低ClpR4蛋白的表達(dá)，或促進(jìn) 或抑制ClpR4蛋白的活性，則表明其是可用于調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)植物葉片顏色性狀或植物光合作用 效率。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫(kù)，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)?于調(diào)節(jié)植物葉片顏色性狀或植物光合作用效率有用的物質(zhì)。因此，本發(fā)明還包括通過(guò)所述的篩選方法獲得的物質(zhì)，所述的物質(zhì)可用于調(diào)節(jié)植 物葉片顏色性狀或植物光合作用效率。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了 一種獲自擬南芥的ClpR4基因(AtClpR4)，該基因 的基因組序列全長(zhǎng)2681bp，cDNA序列全長(zhǎng)918bp，編碼305AA的一條多肽，所述的基因如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示。其編碼的蛋白如SEQ IDNO :3所示。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)植物葉片顏色性狀的效果明顯，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物 或者園藝植物提供了很好的基因資源。(2)使用本發(fā)明的基因可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物的產(chǎn)量或者快速培育出植物 葉片顏色性狀改變(如葉片顏色變綠或黃化)的新品種。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、植物葉片轉(zhuǎn)綠調(diào)控基因的鑒定本發(fā)明人用0. 2% (V/V)的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變擬南芥野生型Col-O生態(tài)型 (獲自美國(guó) ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center))，經(jīng)M2代篩選與M3代鑒定， 獲得一個(gè)穩(wěn)定的葉色逐漸轉(zhuǎn)綠株系(突變體)。與Col-O相比，突變體的新葉為黃色，而老 葉則轉(zhuǎn)為綠色，在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中均如此，并且其葉緣呈鋸齒型，植株生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢。將野生型Col-O作為父本、突變體作為母本雜交得到的Fl代或?qū)⑼蛔凅w作為父 本、野生型Col-O作為母本雜交得到的Fl代，植株均同野生型一樣，無(wú)葉片黃化表型，表明 該基因?yàn)榧?xì)胞核編碼的隱性基因。播種從Fl代植株上收獲的種子得到F2代植株，在隨機(jī)取 的植株中，葉片逐步轉(zhuǎn)綠植株與正常植株的比例為1比3，表明該基因?yàn)閱挝稽c(diǎn)隱性突變。將該突變體與擬南芥野生型Ler生態(tài)型(獲自美國(guó)ABRC (ArabidopsisBiological Resource Center))雜交得到Fl代，F(xiàn)l代自交獲得F2代圖位克隆群體，利用基于擬南 芥DNA多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)中簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(simplesequence length polymorphism, SSLP)的InDel標(biāo)記對(duì)突變基因進(jìn)行定位。隨機(jī)選取60 個(gè)突變植株抽提DNA，每30個(gè)突變體DNA混成一個(gè)DNA池，進(jìn)行基因的BSA (分群分析法， Bulk segregate analysis)分析。用覆蓋基因組的20對(duì)分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)擴(kuò)增 Col-O,Ler.Fl的DNA作為對(duì)照，將突變基因初步定位在4號(hào)染色體下臂。然后擴(kuò)大群體進(jìn) 行精細(xì)定位，檢測(cè)到一個(gè)點(diǎn)突變，該突變位點(diǎn)位于ClpR4基因第二個(gè)內(nèi)含子的第一個(gè)堿基， 從而影響到RNA前體的剪切。在突變體中，可以檢測(cè)到3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中最小的一條的錯(cuò)誤 剪切導(dǎo)致多于野生型5個(gè)氨基酸，推測(cè)其可能會(huì)有部分功能。ClpR4蛋白是葉綠體Clp蛋白 酶體的核心亞基之一，此復(fù)合體參與葉綠體蛋白的降解。ClpR4基因在各種組織與發(fā)育時(shí)期 都能檢測(cè)到表達(dá)。AtClpR4 基因編碼區(qū)基因組(genomic DNA)序列如下(SEQ ID NO 1)(注明小寫(xiě)斜體字為5’UTR，內(nèi)含子和3’UTR，大寫(xiě)正體字為外顯子序列(SEQ ID NO 2))agatcgttatcgtttcggggtcacagggactttcactctttctctctctctgcaacaaagaagaaATGG AGGTAGCAGCAGCGACTGCGACGAGCTTCACAACGCTTCGAGCTCGTACGTCAGCGATTATCCCGTCTTCTACACGT AATCTGAGATCTAAACCGAGATTTTCTTCATCTTCATCTCTCAGAGCTTCTCTTTCGAATGGCTTTCTTTCGCCGTA TACCGGAGGAAGCATCTCTAGTGACTTATGCGGCGCTAAGCTTCGTGCGGAATCGCTTAATCCGTTAAATTTTTCCA GTTCCAAGCCTAAACGCGGAGTTGTCACTATGgtactcgaatttatactttttttcagtttcttaattaacgagctc cctattctgttaggattttgaaattgaggttttcgttgctatagctgagatttatgcttctgtggtagtgaattttc agaaattgtatttgtcgagaaatggtgttccttagttttgaaccaatggattagattgactctagatataggctatt agattgcaagggggagtaatgctcattcattctatagctgagatttatgcttctgtggtggtgtaattgagggaaaa tttatgggtcgaatcttaccaacggttgctacttagctttaaacggcgaattaatggattagagttactattgatat atgcaattagatagcaaagacggctcattcatttctgttgtttaattgatcggaaatggtacatgtttagttagaga gttgagtatgaagattaaataatgcagtttcggaagaaattatgctgtgtgtttggctggtaaggaagaagttgagt tattatgtggcagaggtttcacttgattgtgtgtgccacttataatatgcatcaattgctctgattatgattatgat agagaatttggaggctgctatattcttcacatatagtcttttgtttattgttgttattatatgattcttatcttcgt gcttccgtcttatcaacagGTTATACCTTTCTCAAAGGGAAGTGCACACGAACAACCTCCTCCTGATTTGGCATCAT ATTTGTTCAAGAACCGAATTGTATATTTGGGAATGTCTCTCGTACCTTCAGTTACTGAGTTGATACTTGCGGAGTTT CTTTACCTTCAGTATGAAGACGAGGAAAAGCCTATTTACCTTTACATAAACTCGACTGGGACAACCAAGgtgggctt ccattatgtagtccatcatattaagaacgcatactgaatagtaaaattgaaactgtggtttgtttcaaatgaatgac taaaagcttagaaatcattacctatcgttcaaactgtttttaagagaatttatcttctcccttttcagAATGGTGAA AAGTTGGGCTATGATACTGAGGCTTTTGCAATCTATGATGTCATGGGgtaattgatcttcatctctttcctcaactt acttcttcccgtaatagcatcgataacaagacttggatacttaaactgctttcccaaatattcaaaattgcacttgg agacagttttcatatccagcatattttggggagaacgaccaattatcaatgcaacaatcaactcttaccttatcttt gaatttcagGTATGTCAAACCACCAATCTTTACTCTTTGCGTCGGGAATGCTTGGGGTGAAGCTGCTTTGCTTCTGA CTGCTGGTGCAAAAGGAAATCGATCTGCGTTGCCCTCATCAACTATTATGATAAAGCAGgttctttctgatcgtttc ttttaaatattaggtggcgtcttttccccctgctagaagattttggttttctttttcaagttggaagaatctaaggt ttatgattcttaattctgtgcatgcacctttttacttatcaatatattttctcttgcatgttaactttgtagCCCAT TGCTCGATTTCAAGGCCAAGCAACTGATGTTGAAATTGCAAGGAAAGAAATCAAGCACATAAAGACAGAAATGgtga gaagataaacttgatatgaattcacatagtagagaatcaaacccttgtgatgtacgtagaatatcttagtttgatcttcattatgcaacagtgtccagttgtgtgtgttatttgggtcttttaagggggagatataaataaatggaacttgcag gcaatgggtgtatatacttgcagacatcttaatattcatcagttagccattaatagtatgcacatgctagcaaatct caaatcatgctatcattctctgtccgcaacttttcacttttaccttcaaacttatctgaaagatgtgtctctattct atgtaatgttatgctcaagGTCAAGCTGTATTCAAAGCATATTGGTAAATCCCCGGAGCAGATTGAAGCTGACATGA AACGCCCGAAATATTTTAGTCCCACTGAGGCTGTTGAATATGGGATCATTGATAAGgtacgataaaatgtcagaaaa atccgtaaaacgtatgagcgattttgttttcctgtcaacatagagttattatcttctgcatgattgaatcattctct ttctgtaatctgtgtgcagGTGGTTTACAATGAAAGGGGCAGCCAAGACAGAGGAGTTGTGTCTGACCTTAAAAAGG CACAACTCATTTGAatgtcagaactgtcttccgaaatcccatgattaacaggtaaaagctaaaatttgctcaAtClpR4 蛋白序列如下(SEQ ID NO:3)MEVAAATATSFTTLRARTSAIIPSSTRNLRSKPRFSSSSSLRASLSNGFLSPYTGGSISSDLCGAKLR AESLNPLNFSSSKPKRGVVTMVIPFSKGSAHEQPPPDLASYLFKNRIVYLGMSLVPSVTELILAEFLYLQYEDEEK PIYLYINSTGTTKNGEKLGYDTEAFAIYDVMGYVKPPIFTLCVGNAWGEAALLLTAGAKGNRSALPSSTIMIKQP IARFQGQATDVEIARKEIKHIKTEMVKLYSKHIGKSPEQIEADMKRPKYFSPTEAVEYGIIDKVVYNERGSQDRG VVSDLKKAQLI實(shí)施例2、擬南芥AtClpR4功能缺失的表型與遺傳互補(bǔ)鑒定1.遺傳互補(bǔ)鑒定為證實(shí)葉色逐步轉(zhuǎn)綠的表型確實(shí)與ClpR4基因有關(guān)，本發(fā)明人進(jìn)行了遺傳互補(bǔ)分 析。通過(guò)PCR擴(kuò)增，克隆了它的全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的重 組表達(dá)載體。以 5，-CACCATGGAGGTAGCAGCAGCGACT-3，(SEQ ID NO 5)和 5，-AGTTCTGACATTCAAAT GAGTTGTGC-3，(SEQ ID NO 6)為引物，從擬南芥野生型Col-O生態(tài)型的cDNA文庫(kù)中PCR擴(kuò) 增獲得ClpR4基因的全長(zhǎng)cDNA，利用Getaway克隆系統(tǒng)導(dǎo)入pENTR/SD/D-TOPO克隆載體(購(gòu) 自 Invitrogen 公司)，測(cè)序正確后通過(guò) LR 反應(yīng)(LR CLONASE Enzyme Mix，購(gòu)自 Invitation 公司)至表達(dá)載體PGWB2(Invitr0gen)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒常規(guī)方法轉(zhuǎn)入 農(nóng)桿菌 GV3101 (購(gòu)自 Invitrogen)。擬南芥轉(zhuǎn)化采用噴灑法，將含有重組表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌均勻噴灑擬南芥，至葉片 上有液滴落下，將植物避光過(guò)夜。之后將植物轉(zhuǎn)移到正常條件下生長(zhǎng)。7天后按上述方法重 復(fù)轉(zhuǎn)化1次。待種子成熟后將植株混合采收，在干燥器中放置7天。Tl代種子消毒后播種 在含有50μ g/ml Kan的V2XMS培養(yǎng)基上，4°C放置72h，然后正常光照培養(yǎng)。結(jié)果，在實(shí)施例1獲得的突變體植物中轉(zhuǎn)化野生型的ClpR4基因后，獲得了多個(gè)葉 色轉(zhuǎn)綠恢復(fù)的轉(zhuǎn)基因株系，其表型見(jiàn)圖l(ClpR4 in clpr4)。2.功能缺失表型的建立針對(duì)AtClpR4基因的序列特異性，根據(jù)WMD 2-ffeb MicroRNA Designer設(shè)計(jì)了產(chǎn) 生人工microRNA(AmiRNA)的PCR引物如下MIR-VAR2-I miR-s(SEQ ID NO 7)5， -GaTAAACTCGGAAAGAATTGCGCtctctcttttgtattcc-3，；MIR-VAR2-II miR_a(SEQ ID NO 8)5， -GaGCGCAATTCTTTCCGAGTTTAtcaaagagaatcaatga-3，；MIR-VAR2-III miR*s(SEQ ID NO 9)
15
5， -GaGCACAATTCTTTCGGAGTTTTtcacaggtcgtgatatg-3，；MIR-VAR2-IV miR*a(SEQ ID NO: 10)5，-GaAAAACTCCGAAAGAATTGTGCtctacatatatattcct-3，。通過(guò)對(duì)出發(fā)質(zhì)粒pRS300 (Tubingen University, Germany)的 PCR 突變(參見(jiàn) Tubingen University 提供的使用說(shuō)明書(shū)，或 The Plant Cell, Vol. 18，1121—1133，May 2006提供的方法)，獲得了含針對(duì)AtClpR4的人工回文序列的片段，然后用A、B引物擴(kuò)增出 含有ClpR4靶向序列的片段克隆到pENTR/SD/D-TOPO載體，LR反應(yīng)至表達(dá)載體PGWB2。A 引物(SEQ ID NO 11)5， -CACCCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3，；B 引物(SEQ ID NO 12)5 ’ -GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’。將上述載體通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型Col-O生態(tài)型，結(jié)果獲得了多個(gè)葉片轉(zhuǎn)綠明顯 變慢的轉(zhuǎn)基因Tl株系，其表型見(jiàn)圖l(Ami-clpr4)，其新生葉片顯示黃色。其中，ClpR4TargetmicroRNA 的特異性序列為(SEQ ID NO 4)5’ -TAATCGCTGACGTACGAGGTC-3’。實(shí)施例3、擬南芥AtClpR4_GFP融合蛋白定位于葉綠體中本發(fā)明人用前述的方法克隆AtClpR4不含終止子的全長(zhǎng)cDNA到pENTR/SD/D-TOPO 載體，引物序列為 5，-CACCATGGAGGTAGCAGCAGCGAC T-3’ (SEQ ID NO 5)和 5，-AATGAGTTGT GCCTTTTTAAGGTCAG(SEQ ID NO 13)-3，，LR反應(yīng)至PGWB5表達(dá)載體。將此融合表達(dá)載體通 過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型Col-O生態(tài)型。轉(zhuǎn)化ClpR4_GPF的陽(yáng)性植株后代5天的小苗用于觀察亞細(xì)胞定位，GFP熒光通過(guò) 激光共聚焦掃描顯微鏡(FITC488，Zeiss LSM500)觀察。GFP熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為488nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為505至545nm。葉綠素自發(fā)熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為585nm。結(jié)果如圖2所示，可見(jiàn)擬南芥AtClpR4_GFP融合蛋白定位于葉綠體中。實(shí)施例4、擬南芥AtClpR4功能缺失對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響利用透射電鏡對(duì)野生型Col-O和突變體擬南芥的葉綠體進(jìn)行觀察，Col-O的葉綠 體可以觀察到完整的雙層膜結(jié)構(gòu)，以及內(nèi)部相互連接的基粒與間質(zhì)類(lèi)囊體；來(lái)自突變體擬 南芥外周(ClpR4 outer)葉色正常葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)與野生型沒(méi)有明顯區(qū)別，但來(lái)自 內(nèi)周(ClpR4 inner)黃色葉片的葉綠體發(fā)育有缺陷，葉綠體變小。見(jiàn)圖3。實(shí)施例5、AtClpR4基因表達(dá)的組織特異性為了了解AtClpR4基因表達(dá)的特點(diǎn)，本發(fā)明人分別檢測(cè)了抽薹時(shí)期植株中的根、 莖、莖生葉、花及果莢等組織中的基因轉(zhuǎn)錄水平。另外，還對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期(10天、30天、60 天)的植株葉片進(jìn)行了分析，其中生長(zhǎng)60天的植物葉片被分成外周和內(nèi)周葉片兩組。常規(guī)方法提取樣品中的RNA，并常規(guī)方法制備cDNA文庫(kù)?；虮磉_(dá)的檢測(cè)通過(guò)設(shè) 計(jì)基因特異性引物ClpR4-RT-F(SEQ ID NO: 14) :5，-TCAGCGATTATCCCGTCTTCTAC-3，；ClpR4-RT-R(SEQ ID NO 15) :5，-AGCCTCAGTATCATAGCCCAAC-3，。經(jīng)PCR擴(kuò)增基因產(chǎn)物，然后由瓊脂糖凝膠電泳分離，圖像分析通過(guò)GIS-2010 (天 能)進(jìn)行。將Actin的表達(dá)水平作為內(nèi)標(biāo)，為了預(yù)防DNA污染，同時(shí)將基因組的DNA作為目
16的帶擴(kuò)增對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ClpR4在地上部組織中的表達(dá)水平比地下根中的表達(dá) 明顯要高。但是，地上部各組織之間的表達(dá)量沒(méi)有很大的差異。實(shí)施例6、AtClpR4基因的變異基因及其功能重復(fù)實(shí)施例2中第1部分，不同點(diǎn)在于額外地對(duì)實(shí)施例2中第1部分中獲得的重 組質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)誘變，其中所含有的外源cDNA序列即SEQ ID NO 2序列中第910位由c變 為a (從而使得第304位氨基酸由Leu變?yōu)閘ie)的基因，構(gòu)成可表達(dá)AtClpR4基因的變異 基因Mut. 1的重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并噴灑實(shí)施例1獲得的突變體擬南芥， 制備后代轉(zhuǎn)基因植物。觀察上述獲得的轉(zhuǎn)基因植物的葉片性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物的葉片 轉(zhuǎn)綠情況與野生型植物相同。本發(fā)明人在擬南芥AtClpR4基因功能研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，基因下調(diào)及上調(diào)植株表型 明顯，性征可以遺傳。并且，對(duì)ClpR4基因的調(diào)節(jié)作用還可用于其它植物例如水稻、煙草、蔬 菜、油菜等的葉片顏色調(diào)控。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>調(diào)節(jié)植物葉片轉(zhuǎn)綠過(guò)程的蛋白、其編碼基因及應(yīng)用<130)092439<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2681<212>DNA<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1
0190]agatcgttatCgtttCggggtcacagggactttcactctttctctctctctgcaacaaag600191]aagaaatggaggtagcagcagcgactgcgacgagcttcacaacgcttcgagctcgtacgt1200192]cagcgattatcccgtcttctacacgtaatctgagatctaaaccgagattttcttcatctt1800193]catctctcagagcttctctttcgaatggctttctttcgccgtataccggaggaagcatct2400194]ctagtgacttatgcggcgctaagcttcgtgcggaatcgcttaatccgttaaatttttcca3000195]gttccaagcctaaacgcggagttgtcactatggtactcgaatttatactttttttcagtt3600196]tcttaattaacgagctccctattctgttaggattttgaaattgaggttttcgttgctata4200197]gctgagatttatgcttctgtggtagtgaattttcagaaattgtatttgtcgagaaatggt4800198]gttccttagttttgaaccaatggattagattgactctagatataggctattagattgcaa5400199]gggggagtaatgctcattcattctatagctgagatttatgcttctgtggtggtgaattga600
17
<22l>外顯子
<222>(1)．．(918)
<400>2
atggaggtag cagcagcgac tgcgacgagc ttcacaacgc ttcgagctcg tacgtcagcg60
attatcccgt cttctacacg taatctgaga tctaaaccga gattttcttc atcttcatct1 20
ctcagagctt ctctttcgaa tggctttctt tcgccgtata ccggaggaag catctctagt180
gacttatgcg gcgctaagct tcgtgcggaa tcgcttaatc cgttaaattt ttccagttcc240
aagcctaaac gcggagttgt cactatggtt atacctttct caaagggaag tgcacacgaa300
caacctcctc ctgatttggc atcatatttg ttcaagaacc gaattgtata tttgggaatg360
tctctcgtac cttcagttac tgagttgata cttgcggagt ttctttacct tcagtatgaa420
gacgaggaaa agcctattta cctttacata aactcgactg ggacaaccaa gaatggtgaa480
aagttgggct atgatactga ggcttttgca atctatgatg tcatggggta tgtcaaacca540
ccaatcttta ctctttgcgt cgggaatgct tggggtgaag ctgctttgct tctgactgct600
ggtgcaaaag gaaatcgatc tgcgttgccc tcatcaacta ttatgataaa gcagcccatt660
gctcgatttc aaggccaagc aactgatgtt gaaattgcaa ggaaagaaat caagcacata720
aagacagaaa tggtcaagct gtattcaaag catattggta aatccccgga gcagattgaa780
gctgacatga aacgcccgaa atattttagt cccactgagg ctgttgaata tgggatcatt840
gataaggtgg tttacaatga aaggggcagc caagacagag gagttgtgtc tgaccttaaa900
aaggcacaac tcatttga9 18
<2 10>3
<211>305
<2 l 2>PRT
<213>擬南芥(ArabidopsiS thaiiana)
<400>3
Met Gh Val Ala Ala Ala Thr Ala Thr Set Phe Thr Thr Leu Arg Ala
l5lo15
Arg Thr Set Ala Ile Ile Pro Set Set Thr Arg Asn Leu Arg Set Lys
202530
Pro Arg Phe Set Set Set Set Set Leu Arg Ala Set Leu Set Asn Gly
354045
Phe Leu Set Pro Tyr Thr Gly Gly Set I le Set Set Asp Leu Cys Gly
505560
Ala Lys Leu Arg Ala Gh Set Leu Asn Pro Leu Asn Phe Set Set Set
65707580
Lys Pro Lys Arg Gly Val Val Thr Met Val I le Pro Phe Set Lys Gly
859095
Set Ala HiS Gh Gin Pro Pro Pro Asp Leu Ala Set Tyr Leu Phe Lys
100105110
Asn Arg Ile Val Tyr Leu Gly Met Set Leu Val Pro Set Val Thr Gh
115120125
Leu lie Leu AlaGluPheLeuTyrLeuGlnTyrGluAspGluGluLys
130135140
Pro lie Tyr LeuTyrlieAsnSerThrGlyThrThrLysAsnGlyGlu
145150155160
Lys Leu Gly TyrAspThrGluAlaPheAlalieTyrAspValMetGly
165170175
Tyr Val Lys ProProliePheThrLeuCysValGlyAsnAlaTrpGly
180185190
Glu Ala Ala LeuLeuLeuThrAlaGlyAlaLysGlyAsnArgSerAla
195200205
Leu Pro Ser SerThrlieMetlieLysGlnProlieAlaArgPheGln
210215220
Gly Gln Ala ThrAspValGlulieAlaArgLysGlulieLysHislie
225230235240
Lys Thr Glu MetValLysLeuTyrSerLysHislieGlyLysSerPro
245250255
Glu Gln lie GluAlaAspMetLysArgProLysTyrPheSerProThr
260265270
Glu Ala Val GluTyrGlylielieAspLysValValTyrAsnGluArg
275280285
Gly Ser Gln AspArgGlyValValSerAspLeuLysLysAlaGlnLeu
290295300
lie
305
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>寡核苷酸
<400>4
taatcgctga cgtacgaggt c21
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5caccatggag gtagcagcag cgact25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<223> 引物<400>6agttctgaca ttcaaatgag ttgtgc26<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<223> 引物<400>7gataaactcg gaaagaattg cgctctctct tttgtattcc 40<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<223> 引物<400>8gagcgcaatt ctttccgagt ttatcaaaga gaatcaatga 40<210>9<211 >40<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<223> 引物<400>9gagcacaatt ctttcggagt ttttcacagg tcgtgatatg 40<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature
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<221>misc_feature<223> 引物<400>15agcctcagta tcatagccca ac2權(quán)利要求
一種分離的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO3所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述多肽的功能的由(a)衍生的多肽。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，所述的多核苷酸選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼SEQIDNO :3所示 氨基酸序列的多肽。
4.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞 含有權(quán)利要求4所述的載體；或基因組中整合有權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸。
6.一種權(quán)利要求1所述的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；(b)從培養(yǎng)物中分離出權(quán)利要求1所述的多肽。
7.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀是調(diào)節(jié)植 物葉片的轉(zhuǎn)綠。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)將權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入權(quán) 利要求2或3所述的多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官 或種子再生成植物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸；(s2)將植物細(xì)胞、組織、器官或種子與步驟(si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使權(quán)利要求2或 3所述的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(s3)選擇出轉(zhuǎn)入了權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
11.一種權(quán)利要求1所述的多肽或其編碼基因的激動(dòng)劑或拮抗劑。
12.如權(quán)利要求11所述的激動(dòng)劑或拮抗劑，其特征在于，所述的多肽的拮抗劑是含有 SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的干擾分子。
13.一種制備植物的方法，所述植物的葉片具有黃化的性狀，其特征在于，所述的方法 包括降低植物中權(quán)利要求1所述的多肽的表達(dá)量；或使植物中權(quán)利要求1所述的多肽不表達(dá)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)將干擾權(quán)利要求2所述的多核苷酸表達(dá)的干擾分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種 子，獲得轉(zhuǎn)化入所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種調(diào)節(jié)植物葉片轉(zhuǎn)綠過(guò)程的蛋白、其編碼基因及應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了利用所述的基因制備葉片轉(zhuǎn)綠性狀改變的植物的方法。本發(fā)明的蛋白對(duì)于植物培植領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，可用于調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀，或調(diào)節(jié)植物光合作用效率，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物或者園藝植物提供了很好的基因資源。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101906154SQ200910052370
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者吳文娟, 黃繼榮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院