專利名稱：一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的動物蛋白質(zhì)樣品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的動物蛋白質(zhì)樣品的制備方法，尤其是一種用于土壤污染生物標(biāo)記物篩選的動物蛋白質(zhì)樣品的制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來興起的一門新興學(xué)科，其主要的技術(shù)為雙向凝膠電泳Q-DE) 和質(zhì)譜分析技術(shù)，可從總體水平上揭示細(xì)胞內(nèi)蛋白的差異表達(dá)情況。目前雙向電泳一般只能分辨到1000 3000個蛋白質(zhì)(spot)，而樣品中的蛋白種類可達(dá)到10萬種以上，因此在做雙向電泳之前對樣品的處理非常重要。樣品制備是雙向電泳中最關(guān)鍵的步驟，這一步處理的好壞將直接影響2-DE結(jié)果。但就目前來說，并沒有一個比較標(biāo)準(zhǔn)或者通用的樣品制備方法。現(xiàn)在常用的樣品制備方法都采用三步法樣品破碎、沉淀蛋白和去除雜質(zhì)?，F(xiàn)有采用的樣品破碎手段極易造成樣品中蛋白的丟失或?qū)е碌鞍妆恍揎?。此外，在蛋白沉淀的步驟也極易引起蛋白的降解和被修飾。去除雜質(zhì)的技術(shù)關(guān)鍵也是盡量減少蛋白丟失和蛋白修飾。由此可見，迄今，蛋白質(zhì)組學(xué)分析中蛋白質(zhì)樣品的制備方法尚沒有一個通用的技術(shù)，需要經(jīng)過大量的實驗摸索和經(jīng)驗積累才能確保實驗結(jié)果的可信準(zhǔn)確。在研究蛋白的過程中， 既需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募夹g(shù)流程但又不能拘泥于經(jīng)驗。因此，改進(jìn)實驗流程和樣品制備技術(shù)，減少蛋白丟失、降解(或破壞)和減少對蛋白質(zhì)的人為修飾或被修飾，減少蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。實現(xiàn)低豐度目標(biāo)蛋白點的高效分離具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種通過組織原位采集和顯微放大捕獲切割的方法，可以大大減少雜蛋白含量和降解丟失，減少蛋白的人為修飾，在雙向凝膠電泳0-DE)實現(xiàn)動物組織低豐度目標(biāo)蛋白點的高效分離上效果非常好。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的動物蛋白質(zhì)樣品的制備方法，所述方法包括(1)組織標(biāo)本獲取剝離蚯蚓的表皮組織，清洗、用濾紙吸去多余液體，所得組織標(biāo)本于液氮中速凍后移至-80°C冰箱保存；生物的選擇和組織確定土壤無脊椎動物—— 蚯蚓，確定組織為表皮組織。(2)冰凍切片組織標(biāo)本從-80°C冰箱取出后，用-30°C的冰凍切片機(jī)切片，切片厚度10 μ m，每例標(biāo)本第1張切片用HE染色，以后每張切片只做蘇木精染色。第1張切片HE 染色主要用于組織的識別定位，以后每張切片的蘇木精染色是為了確保目標(biāo)蛋白質(zhì)在染色的同時還處于完全變性狀態(tài)；(3)顯微捕獲切割將制備好的切片放在顯微鏡的載物臺上，直視下比較觀察選定要切割的區(qū)域，按最大捕獲效率設(shè)定參數(shù)，具體為光束直徑(beam diameter)60 μ m, 光束能量(beam power) 80mV，激光傳遞脈沖(transfer pulses)為1.6ms，捕獲切割取得40000 50000個細(xì)胞，通過軟件對所獲取的細(xì)胞計數(shù)；(4)樣本制備切割下來的細(xì)胞加入組織裂解緩沖液中，冰浴振蕩30 40min， 再1 5°C下超聲處理2 5次后，離心O0000 X g，lh)，取上清，即得蚯蚓蛋白質(zhì)樣品， 貯存于-80°C冰箱備用，同時用考馬斯亮藍(lán)法測定提取液中的蛋白質(zhì)濃度；所述組織裂解緩沖液組成如下8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS, 65mmol/L DTT，0. 2 %兩性電解質(zhì) (Ampholyte 電泳級，pH3. 0 9· 5, Amresco 公司),10ml/L cocktail。優(yōu)選的，步驟(4)組織裂解緩沖液組成如下8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS,65mmol/L DTT，0· 2%兩性電解質(zhì)，10ml/L cocktail。在土壤動物生物標(biāo)記物篩選過程中，可采用上述方法獲得蛋白質(zhì)樣品，再按照下述方法進(jìn)行進(jìn)一步分析(A)雙向凝膠電泳取上述蛋白質(zhì)樣品100 μ g加入重泡脹液至終體積350 μ 1混勻。將樣本均勻加入持膠槽中，膠面向下放入17cm IPG干膠條，滴加礦物油，置于等電聚焦儀上，重泡脹過夜，等電聚焦在19 °C下自動進(jìn)行。等電聚焦后，IPG膠條分別在平衡液A (含 20g/L DTT)和平衡液B (含25g/L碘乙酰胺)中各平衡15min，將平衡后的IPG膠條置于 12%的均勻SDS聚丙烯酰胺凝膠上方，膠條端滴加寬范圍的蛋白標(biāo)記物，低溶點瓊脂糖封閉，電泳參數(shù)5mA/膠lh，待溴酚藍(lán)前沿移入SDS膠時，以30mA/膠他直至溴酚藍(lán)前沿抵達(dá)距膠底邊緣約0. 5cm時為止。(B)硝酸銀染色40%乙醇+10%冰乙酸固定60min — 6. 8%乙酸鈉+30%乙醇 +0. 2% Na2S2O3敏化30min —去離子水漂洗5minX3次一0. 2%硝酸銀染色20min —去離子水漂洗IminX 2次一2. 5%無水碳酸鈉+0. 04%甲醛顯色5%冰乙酸終止IOmin — 10%甘
油保存。(C)凝膠圖像采集與分析應(yīng)用掃描儀MICROTEK 4850II采集凝膠圖像，在相同條件下，對兩種細(xì)胞的總蛋白樣品分別進(jìn)行3次雙向電泳及圖像分析，在同種細(xì)胞的蛋白質(zhì)電泳圖譜中選擇蛋白質(zhì)點清晰的圖像作為參照，與其他2次電泳的圖像進(jìn)行匹配，然后將3 次電泳所得的蛋白質(zhì)點圖譜在PDQuest2Dversi0n 7. 4軟件中創(chuàng)建平均膠，對2種細(xì)胞的平均膠進(jìn)行匹配，選取表達(dá)水平(相對體積)增加2倍及2倍以上的點，得出差異表達(dá)點。(D)質(zhì)譜鑒定選取膠上差異蛋白質(zhì)點，用刀片沿斑點染色邊緣切下，置于 Eppendof管中，進(jìn)行蛋白質(zhì)膠內(nèi)消化，然后進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜鑒定。借助互聯(lián)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索程序 NCBInr (http //prospector, ucs. f edu)。(E)生物標(biāo)志物的篩選與確定分析表皮組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)圖譜，研究蛋白質(zhì)圖譜的特征及其與土壤中污染物的種類與含量的關(guān)系，確定表征污染物的差異表達(dá)點，找出對應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，篩選確定生物標(biāo)記物。上述土壤生物標(biāo)記物的篩選，可以適用在PCffs單一和復(fù)合污染土壤生態(tài)毒性的早期診斷和生態(tài)風(fēng)險評估中本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過組織冰凍實現(xiàn)蛋白原位固定，對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行顯微捕獲切割，將切割下來的細(xì)胞通過組織裂提取總蛋白，改進(jìn)了實驗流程和樣品制備技術(shù)，大大地減少了蛋白丟失、降解(或破壞)以及對蛋白質(zhì)的人為修飾，減少了蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并可使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)，為實現(xiàn)低豐度目標(biāo)蛋白點的高效識別分離效果很好，適用于蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的篩選與確定。

圖1為蚯蚓菲污染暴露7天和14天表皮組織蛋白雙向凝膠電泳圖，Control為空白對照；treatment為污染暴露組(Phe 12. 5mg · kg-1 ；箭頭指示可能的差異蛋白點)；圖2差異蛋白點971的肽質(zhì)量指紋圖譜，對差異蛋白點971切膠，trypsin消化， MALDI-T0F/T0F分析；A，MS分析圖，1222. 608離子星號標(biāo)記；B，1222. 608離子MS/MS分析圖。圖3為蚯蚓菲、芘復(fù)合污染暴露14天表皮組織蛋白雙向凝膠電泳圖， (Phe20. Omg · kg^+Pyr 300. Omg · kg-1 ；箭頭指示可能的差異蛋白點)；圖4為差異蛋白點四的肽質(zhì)量指紋圖譜，對差異蛋白點四切膠，trypsin消化， MALDI-T0F/T0F 分析。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例1 菲污染土壤生物標(biāo)志物的篩選(1)蚯蚓的慢性毒性試驗采用人工配制的菲單一污染的土壤，設(shè)置對照組和實驗組，實驗組菲的濃度為 12. 5mg -kg^Phe,設(shè)3個平行組。分別于培養(yǎng)開始后7d和14d從每個實驗組和對照組中隨機(jī)取各種試驗動物的3個個體。(2)生物標(biāo)志物的篩選與確定1)蛋白樣品的準(zhǔn)備剝離被抽取的動物表皮組織，于冰鹽水(含0. lmmol/L PMSF) 中清洗干凈，濾紙吸去多于液體，立即置于液氮中速凍，然后移至-80°C冰箱保存。組織標(biāo)本從_80°C冰箱取出后，立即移入溫度設(shè)置為-30°C的冰凍切片機(jī)中，切片厚度10 μ m,每例標(biāo)本第1張切片用HE染色，以后每張切片只做蘇木精染色。將制備好的切片放在顯微鏡的載物臺上，直視下觀察選定要切割的區(qū)域，按最大捕獲效率設(shè)定參數(shù)。具體為光束直徑 (beam diameter) 60 μ m,光束能量(beam power) 80mV,激光傳遞脈沖(transfer pulses)為 1. 6ms,按此法取得40000 50000個細(xì)胞，并通過軟件對所獲取的細(xì)胞計數(shù)。切割下來的細(xì)胞通過組織裂解緩沖液(8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS, 65mmol/LDTT, 0. 2%兩性電解質(zhì)(Ampholyte 電泳級，ρΗ3· 0 9. 5，Amresco 公司)，10ml/Lcocktail)提取總蛋白， 加入裂解液后，冰浴振蕩30min，再低溫超聲數(shù)次后，給予4°C，20 OOOXg離心lh，取上清， 分裝，貯存于-80°C冰箱，同時用考馬斯亮藍(lán)法測定提取液中的蛋白質(zhì)濃度。2)雙向凝膠電泳取上述蛋白質(zhì)樣品100 μ g加入重泡脹液至終體積350 μ 1混勻。將樣本均勻加入持膠槽中，膠面向下放入17cm IPG干膠條，滴加礦物油，置于等電聚焦儀上，重泡脹過夜，等電聚焦在19°C下自動進(jìn)行。等電聚焦后，IPG膠條分別在平衡液A(含 20g/L DTT)和平衡液B (含25g/L碘乙酰胺)中各平衡15min，將平衡后的IPG膠條置于 12%的均勻SDS聚丙烯酰胺凝膠上方，膠條端滴加寬范圍的蛋白標(biāo)記物，低溶點瓊脂糖封閉，電泳參數(shù)5mA/膠lh，待溴酚藍(lán)前沿移入SDS膠時，以30mA/膠他直至溴酚藍(lán)前沿抵達(dá)距膠底邊緣約0. 5cm時為止。
3)硝酸銀染色40%乙醇+10%冰乙酸固定60min — 6. 8%乙酸鈉+30%乙醇 +0. 2% Na2S2O3敏化30min —去離子水漂洗5minX3次一0. 2%硝酸銀染色20min —去離子水漂洗IminX2次一2. 5%無水碳酸鈉+0. 04%甲醛顯色5%冰乙酸終止IOmin — 10%甘
油保存。4)凝膠圖像采集與分析應(yīng)用掃描儀MICROTEK 4850II采集凝膠圖像，在相同條件下，對兩種細(xì)胞的總蛋白樣品分別進(jìn)行3次雙向電泳及圖像分析，在同種細(xì)胞的蛋白質(zhì)電泳圖譜中選擇蛋白質(zhì)點清晰的圖像作為參照，與其他2次電泳的圖像進(jìn)行匹配，然后將3 次電泳所得的蛋白質(zhì)點圖譜在PDQuest2Dversi0n 7. 4軟件中創(chuàng)建平均膠，對2種細(xì)胞的平均膠進(jìn)行匹配，選取表達(dá)水平(相對體積)增加2倍及2倍以上的點，得出差異表達(dá)點。5)質(zhì)譜鑒定選取膠上差異蛋白質(zhì)點，用刀片沿斑點染色邊緣切下，置于 Eppendof管中，進(jìn)行蛋白質(zhì)膠內(nèi)消化，然后進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜鑒定。借助互聯(lián)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索程序 NCBInr (http //prospector, ucs. f edu)。6)生物標(biāo)志物的篩選與確定分析表皮組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)圖譜，研究蛋白質(zhì)圖譜的特征及其與土壤中污染物的種類與含量的關(guān)系，確定表征污染物的差異表達(dá)點，找出對應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，篩選確定生物標(biāo)記物。通過比較分析蛋白質(zhì)圖譜，結(jié)果第7天暴露找到48個差異蛋白點，第14天暴露找到73個差異蛋白點，通過表達(dá)豐度分析和質(zhì)譜鑒定，篩選出31種有意義的蛋白，其中17種蛋白在蚯蚓表皮細(xì)胞表達(dá)明顯增高，14種蛋白表達(dá)下調(diào)，結(jié)果詳見圖1、圖2 ；表1、表2。篩選出的31種有意義的蛋白即可確定為低濃度菲污染的土壤生物標(biāo)志物，可用于生態(tài)毒性的早期診斷和生態(tài)風(fēng)險評估。實施例2 菲、芘復(fù)合污染土壤生物標(biāo)志物的篩選(1)蚯蚓的慢性毒性試驗采用人工配制的菲、芘單一污染以及復(fù)合污染的土壤，按下表進(jìn)行污染物的濃度梯度設(shè)置，設(shè)3個平行組。分別于培養(yǎng)開始后7d和14d從每個實驗組和對照組中隨機(jī)取各種試驗動物的3個個體。表3 污染物的濃度梯度設(shè)置
權(quán)利要求
1.一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的動物蛋白質(zhì)樣品的制備方法，所述方法包括(1)組織標(biāo)本獲取剝離蚯蚓的表皮組織，清洗、用濾紙吸去多余液體，所得組織標(biāo)本于液氮中速凍后移至-80°C冰箱保存；(2)冰凍切片組織標(biāo)本從-80°C冰箱取出后，用-30°C的冰凍切片機(jī)切片，切片厚度 10 μ m,每例標(biāo)本第1張切片用HE染色，以后每張切片只做蘇木精染色；(3)顯微捕獲切割將制備好的染色切片放在顯微鏡的載物臺上，直視下比較觀察選定要切割的區(qū)域，按最大捕獲效率設(shè)定參數(shù)，具體為光束直徑60 μ m，光束能量80mV，激光傳遞脈沖為1.6ms，捕獲切割取得40 000 50 000個細(xì)胞，通過軟件對所獲取的細(xì)胞計數(shù)；(4)樣本制備切割下來的細(xì)胞加入組織裂解緩沖液中，冰浴振蕩30 40min，再1 5°C下超聲處理2 5次后，離心，取上清，即得蚯蚓蛋白質(zhì)樣品，貯存于-80°C冰箱備用；所述組織裂解緩沖液組成如下8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS, 65mmol/LDTT, 0. 2%兩性電解質(zhì)，10ml/L cocktail。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟⑷組織裂解緩沖液組成如下8mol/L 尿素，2mol/L 硫脲，4% CHAPS，65mmol/L DTT，0. 2%兩性電解質(zhì)，10ml/L cocktail。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的動物蛋白質(zhì)樣品的制備方法，通過組織冰凍實現(xiàn)蛋白原位固定，對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行顯微捕獲切割，將切割下來的細(xì)胞通過組織裂提取總蛋白，改進(jìn)了實驗流程和樣品制備技術(shù)，大大地減少了蛋白丟失、降解(或破壞)以及對蛋白質(zhì)的人為修飾，減少了蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并可使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)，為實現(xiàn)低豐度目標(biāo)蛋白點的高效識別分離效果很好，適用于蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的篩選與確定。
文檔編號G01N1/30GK102288467SQ20111020484
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者吳石金, 沈飛超, 趙士良, 邱樂泉, 鐘衛(wèi)鴻 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)