專利名稱：：Hcv基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒(以下有時(shí)稱作"HCV")基因、來自該基因的復(fù)制子RNA、導(dǎo)入了復(fù)制子RNA的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞、以及使用了該復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞的藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
：HCV是丙型慢性肝炎的致病因子，根據(jù)WHO的統(tǒng)計(jì)，推測全球有1.7億感染者。HCV是分類為黃病毒科、黃病毒屬的病毒，認(rèn)為其經(jīng)由血液或血液成分而感染，在肝臟中增殖。雖然HCV感染者在感染初期僅出現(xiàn)較輕微的癥狀，但往往會(huì)轉(zhuǎn)為慢性，經(jīng)過一定期間的無癥候性期后，發(fā)展為慢性肝炎。而且，隨著長期感染，病情向肝硬化發(fā)展，往往會(huì)發(fā)展為肝癌。認(rèn)為肝癌中有95。/o與肝炎病毒有關(guān)，而其中的80%是由HCV感染引起的。在丙型慢性肝炎的治療中廣泛使用干擾素。近年來，通過改良干擾素的劑型、以及改善干擾素與利巴韋林聯(lián)用療法等給藥方法，HCV從體內(nèi)被驅(qū)除、治愈的比例也逐漸增加。但通過給予干擾素而得到的治愈率才50%左右，認(rèn)為存在多種對干擾素治療顯示出抵抗性的HCV。因此，人們希望開發(fā)對干擾素抵抗性病毒具有治療效果的藥物。在上述藥物的開發(fā)中，藥物的篩選系統(tǒng)是必需的。雖然有人報(bào)道了使HCV在試管內(nèi)感染來自人或猴的細(xì)胞并使其增殖，但上述增殖系統(tǒng)的感染效率、增殖效率均低，無法用作藥物的篩選系統(tǒng)。最近，脇田等人從丙型重癥肝炎患者體內(nèi)分離出基因型2a的HCV基因(專利文獻(xiàn)1)。在試管內(nèi)(體外)由上述分離的JFH1林合成全長RNA，并導(dǎo)入來自人肝癌的細(xì)胞(Huh7細(xì)胞)中時(shí)，可以得到在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的復(fù)制子RNA。并且，確認(rèn)感染性微粒被排放到導(dǎo)入有復(fù)制子RNA的細(xì)胞的培養(yǎng)上清中(非專利文獻(xiàn)1)。因此，通過將JFH1株的復(fù)制子RNA導(dǎo)入來自人肝癌的細(xì)胞(Huh7細(xì)胞)中，并將得到的感染性微粒再次與來自人肝癌的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以建立再感染增殖系統(tǒng)。通過使用該再感染增殖系統(tǒng)，開始了抗HCV藥物的篩選。但是，JFH1抹為基因型2a的HCV,是干擾素感受性的HCV。因此，不具有對干擾素顯示出抵抗性的HCV基因區(qū)，也無法特定在規(guī)定干擾素抵抗性的區(qū)域發(fā)揮作用的宿主側(cè)的因子。因此，有可能無法篩選對干擾素抵抗性的HCV有效的藥物。最近，Lemon等人報(bào)道了將基因型la的H77抹的復(fù)制子RNA導(dǎo)入來自人肝癌的細(xì)胞(Huh7細(xì)胞)中的感染增殖系統(tǒng)(非專利文獻(xiàn)2)。但是，雖然使由導(dǎo)入了該復(fù)制子RNA的細(xì)胞的培養(yǎng)上清得到的病毒顆粒再次感染來自人肝癌的細(xì)胞，但與上述JFH1抹的感染性顆粒相比，感染效價(jià)低約400倍，由此認(rèn)為H77抹的復(fù)制子RNA釋放了失去感染性的病毒顆粒。因此認(rèn)為可在試管內(nèi)復(fù)制的H77^f朱的RNA復(fù)制子失去了產(chǎn)生感染性顆粒的功能，并未保持本來的HCV的增殖功能。因此，使用了該H77的復(fù)制子RNA的感染增殖系統(tǒng)的篩選系統(tǒng)有可能無法篩選對在機(jī)體內(nèi)具有增殖功能的HCV有效的藥物。如上所述，由于HCV不存在高效率的試管內(nèi)培養(yǎng)系統(tǒng)，所以難以進(jìn)行對HCV治療有用的藥物的篩選。例如，對于目前廣泛用于HCV治療的干擾素，是以患者為受試體開發(fā)和改良了直接療法，對患者造成很大的負(fù)擔(dān)。上述脇田和Lemon所報(bào)道的復(fù)制子RNA雖然可以篩選一部分藥物，但這些復(fù)制子RNA存在上述問題，認(rèn)為其無法篩選可廣泛用于HCV治療的藥物。專利文獻(xiàn)1:日本特開2002-171978號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1:NatureMedicine,(美國)2005年，第11巻，第791~796頁非專利文獻(xiàn)2:ProceedingoftheNationalAcademyofScienceoftheUnitedStateofAmerica,2006年，第103巻，第23102315頁
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明人等為了得到可廣泛用于HCV治療的藥物，對HCV的高效率增殖系統(tǒng)、特別是對具有基因型lb型的基因、呈干擾素抵抗性、可產(chǎn)生感染性顆粒的試管內(nèi)增殖系統(tǒng)進(jìn)^f亍了深入研究。首先，爿t人重癥化肝炎患者的血清中分離出全長HCV基因，確定了具有9594堿基的核苷酸序列的SEQIDNO:1的全核苷酸序列。由該HCV基因制作復(fù)制子RNA，并將其導(dǎo)入來自人肝癌的細(xì)胞中時(shí)，確認(rèn)該復(fù)制子RNA在細(xì)胞內(nèi)自主增殖，可以進(jìn)行RNA的復(fù)制。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)通過向該復(fù)制子RNA的NS4B蛋白區(qū)導(dǎo)入2個(gè)氨基酸序列的突變，RNA的復(fù)制效率顯著提高，許多病毒顆粒4皮釋放到培養(yǎng)上清中。之后，通過將該HCV顆粒再次與來自人肝癌的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以建立再感染增殖系統(tǒng)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)使用了該復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞和感染性顆粒的再感染增殖系統(tǒng)作為HCV治療用藥物的篩選系統(tǒng)、特別是作為對干擾素抵抗性病毒的藥物的篩選系統(tǒng)是有用的。本發(fā)明基于上述知識(shí)而完成。解決課題的方法因此，本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒基因，該基因含有選自下述(A)(F)的多核香酸(A)包含SEQIDNO:5所示的核苷,列的多核苷酸；(B)包含SEQIDNO:7所示的核苷i^列的多核苷酸；(C)包含SEQIDNO:65所示的核苷^列的多核苷酸；(D)編碼包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(E)編碼包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(F)編碼包含SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽的多核苦酸。在本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因的優(yōu)選方式中，所述丙型肝炎病毒基因?yàn)榘琒EQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:10、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苷酸序列的多核苷酸。另外，本發(fā)明涉及基因型lb的丙型肝炎病毒基因，該基因含有編碼丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基S^列中第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的核普酸和編碼NS4B蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還涉及DNA，該DNA包括在包含上述丙型肝炎病毒基因的核苷酸序列中尿苷置換成胸腺嘧啶的核苷酸序列的單鏈DNA。本發(fā)明還涉及多肽，該多肽包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:66所示的氨基酸序列。并且，本發(fā)明還涉及丙型肝炎病毒多蛋白，其中NS4B區(qū)的肽為包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還涉及丙型肝炎病毒蛋白，該蛋白為選自包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:11、SEQIDNO:62或SEQIDNO:64所示的氨基酸序列中第1位第191位氨基酸序列的核心蛋白、包含第192位第383位氨基酸序列的El蛋白、包含第384位~第746位氨基酸序列的E2蛋白、包含第747位~第809位氨基酸序列的P7蛋白、包含第810位第1026位氨基酸序列的NS2蛋白、包含第1027位~第1657位氨基酸序列的NS3蛋白、包含第1658位第1711位氨基酸序列的NS4A蛋白、包含第1712位~第1972位氨基酸序列的NS4B蛋白、包含第1973位~第2419位氨基酸序列的NS5A蛋白、包含第2420位~第3010位氨基酸序列的NS5B蛋白中的至少一種。本發(fā)明還涉及復(fù)制子RNA,該復(fù)制子RNA包括選自下述(A)(G)的多核苷酸(A)包含SEQIDNO:5所示的核香酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQIDNO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸；(C)包含SEQIDNO:65所示的核苦酸序列的多核苷酸；(D)編碼包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(E)編碼包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽的多核香酸；(F)編碼包含SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(G)包含與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:65所示的核苷酸序列的同源性為卯％以上的核苷酸序列的多核苷酸。另夕卜，本發(fā)明涉及基因型lb的復(fù)制子RNA，該復(fù)制子RNA包括編碼丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基SW列中第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的核苷酸；以及編碼NS4B蛋白的多核苷酸。在本發(fā)明的復(fù)制子RNA的優(yōu)選方式中，所述復(fù)制子RNA包括(A)丙型肝炎病毒的5'非翻譯區(qū)的第1位第341位的多核苷酸、編碼丙型肝炎病毒的多蛋白中第1027位第3010位多肽的多核苷酸、以及3，非翻譯區(qū)的多核苷酸；或(B)5，非翻譯區(qū)的第1位第341位的多核苷酸、編碼包含3010個(gè)氨基酸的丙型肝炎病毒的多蛋白的多核苷酸、以及3，非翻譯區(qū)的多核苷酸。在本發(fā)明的復(fù)制子RNA的優(yōu)選方式中，所述復(fù)制子RNA為干擾素抵抗性。在本發(fā)明的復(fù)制子RNA的另一優(yōu)選方式中，所述復(fù)制子RNA包括(A)包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中第1位第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中第3420位第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中第3420位第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；(C)包含SEQIDNO:IO所示的核苷酸序列中第1位第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQIDNO:10所示的核苦酸序列中第3420位第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；(D)包含SEQIDNO:61所示的核苷酸序列中第1位第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQIDNO:61所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；(E)包含SEQIDNO:63所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQIDNO:63所示的核苷酸序列中第3420位第9594位的核普酸序列的多核苦酸；(F)包含相對于SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苦酸序列為卯％以上的同源性的核苦酸序列的多核苷酸和包含與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的同源性為卯°/。以上的核苦酸序列的多核苷酸；(G)包含相對于SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列為90。/。以上的同源性的核苷S吏序列的多核苷酸、和包含與SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苷酸；(H)包含相對于SEQIDNO:10所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苦酸序列為90%以上的同源性的核苷酸序列的多核苦酸、和包含與SEQIDNO:10所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苷酸；(I)包含相對于SEQIDNO:61所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列為卯％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、和包含與SEQIDNO:61所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苷酸；或(J)包含相對于SEQIDNO:63所示的核苷酸序列中第1位第341位的核苷酸序列為90%以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、和包含與SEQIDNO:63所示的核香酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苦酸。在本發(fā)明的復(fù)制子的另一優(yōu)選方式中，上述復(fù)制子RNA為包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苦S吏序列的多核苦酸；或包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:10、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苷酸。并且，在本發(fā)明的復(fù)制子的另一優(yōu)選方式中，所述復(fù)制子包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記基因或報(bào)道基因和至少一個(gè)IRES序列。本發(fā)明還涉及編碼上述復(fù)制子RNA的DNA。本發(fā)明還涉及包含上述DNA的載體。本發(fā)明還涉及復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，該復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞是通過將選自上述復(fù)制子RNA、上述DNA和上述載體的至少一種導(dǎo)入到細(xì)胞中而制作的。在本發(fā)明的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞的優(yōu)選方式中，上述細(xì)胞為來自肝細(xì)胞的細(xì)胞，優(yōu)選上述來自肝細(xì)胞的細(xì)胞為Huh-7細(xì)胞。本發(fā)明還涉及復(fù)制子RNA,該復(fù)制子RNA由上述復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生。并且，本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒蛋白，該蛋白為選自由上述復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生的CORE、El、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B中的至少一種。本發(fā)明還涉及丙型肝炎病毒顆粒，該顆粒由復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及篩選方法，其是篩選控制丙型肝炎病毒感染的物質(zhì)的方法，該方法包括使上述復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞與上述物質(zhì)接觸的步驟;以及分析復(fù)制子RNA的增加度的步驟。在本發(fā)明的篩選方法的優(yōu)選方式中，上述分析復(fù)制子RNA增加度是指^f企測復(fù)制子RNA或丙型肝炎病毒蛋白。在本說明書中，"復(fù)制子RNA，，是指根據(jù)病毒RNA制作的、在細(xì)胞內(nèi)具有自主復(fù)制能力的RNA，只要能夠引起RNA的復(fù)制，可以包括能夠產(chǎn)生病毒顆粒的物質(zhì)，也可以包括不能產(chǎn)生病毒顆粒的物質(zhì)。在本說明書中，"干擾素抵抗性"是指在試管內(nèi)和機(jī)體內(nèi)通過給予干擾素，HCV的復(fù)制或增殖沒有被顯著抑制。發(fā)明效果利用本發(fā)明的HCV基因，可以在試管內(nèi)分析能夠在機(jī)體內(nèi)復(fù)制的HCV基因。通過利用該HCV基因，可以制作本發(fā)明的RNA復(fù)制子。并且，利用導(dǎo)入了上述RNA復(fù)制子的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，可以進(jìn)行抗HCV藥物的篩選。由本發(fā)明的HCV基因制作的復(fù)制子RNA是基因型lb的干擾素抵抗性的RNA復(fù)制子。另外，可以由導(dǎo)入了該復(fù)制子RNA的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生感染性病毒顆粒。因此，可以提供與基因型lb且為干擾素抵抗性的HCV在機(jī)體內(nèi)的增殖機(jī)理相同的試管內(nèi)模型。而且，通過利用該HCV的增殖模型，可以進(jìn)行可抑制肝炎重癥化的藥物的篩選和藥品的開發(fā)。附圖簡述圖1顯示通過將本發(fā)明的復(fù)制子RNA導(dǎo)入到細(xì)胞中而產(chǎn)生核心蛋白。通過電穿孔將pTPFl和pTPFl/4B導(dǎo)入Huh-7細(xì)胞中，于4、24、48和72小時(shí)后測定培養(yǎng)上清中核心蛋白的濃度。圖2顯示由本發(fā)明的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生的感染顆粒對細(xì)胞的再感染。感染后，于4、24、48、72和96小時(shí)后測定培養(yǎng)上清中核心蛋白的濃度。圖3顯示使用本發(fā)明的篩選方法，環(huán)孢菌素A對核心蛋白的產(chǎn)生的抑制效果。在添加環(huán)孢菌素A和作為對照的未添加環(huán)孢菌素A的情況下導(dǎo)入復(fù)制子RNA，于4、24、48和72小時(shí)后測定培養(yǎng)上清中核心蛋白的濃度。圖4顯示通過將本發(fā)明的復(fù)制子RNA導(dǎo)入到細(xì)胞中而產(chǎn)生核心蛋白。通過電穿孔將pAHCl和pAHC/4Bm導(dǎo)入Huh-7細(xì)胞中，于4、24、48和72小時(shí)后測定培養(yǎng)上清中核心蛋白的濃度。實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下闡述本發(fā)明的最佳方式，^f旦本發(fā)明并不限于該方式。本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因只要是屬于基因型lb的HCV基因即可，對其沒有限定，但優(yōu)選包括本發(fā)明的編碼NS4B蛋白的多核苷酸。另外，優(yōu)選顯示干擾素抵抗性的HCV基因。HCV基因根據(jù)其核苷酸序列，至少可以分為6種基因型。其中屬于基因型1的HCV進(jìn)一步分為基因型la和基因型lb。具體而言，基因型lb的基因型包括具有多核苷酸的HCV,所述多核苷酸包含相對于SEQIDNO:5或7的核苷酸序列顯示出90°/。以上的同源性的核苷酸序列。作為本發(fā)明的NS4B蛋白，可以列舉出包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽。丙型肝炎病毒基因在5，非翻譯區(qū)(5，UTR)與3，非翻譯區(qū)(3，UTR)之間包含編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白一核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白""P7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的區(qū)域。丙型肝炎病毒基因感染后在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮mRNA的功能，合成一長約3000個(gè)氨基酸的多蛋白。之后，被宿主的信號(hào)肽酶、信號(hào)肽肽酶和HCV基因組所編碼的蛋白酶切斷，產(chǎn)生上述3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。上述10種HCV蛋白中，認(rèn)為NS4B蛋白與NS3NS5B的其他非結(jié)構(gòu)蛋白形成復(fù)合體，再與宿主蛋白一起形成RNA復(fù)制復(fù)合體，進(jìn)行基因組RNA的復(fù)制，在病毒的復(fù)制中發(fā)揮重要作用。編碼于由重癥肝炎患者取得的HCV基因的NS4B區(qū)的、包含本發(fā)明的SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽(以下稱作TPF1-NS4B多肽)、包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽(以下稱作TPFl-突變NS4B多肽)和包含SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽(以下有時(shí)稱作AHCl-突變NS4B多肽)、特別是TPFl-突變NS4B多肽和AHCl-突變NS4B多肽參與HCV基因的復(fù)制，顯示出顯著效果。因此，本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因優(yōu)選包括編碼TPF1-NS4B多肽或TPF1-突變NS4B多肽的多核苷酸，更優(yōu)選包括包含SEQIDNO:5所示的核苦酸序列的多核苷酸(以下稱作TPF1-NS4B多核苷酸)，最優(yōu)選包括包含SEQIDNO:7所示的核香酸序列的多核苷酸(TPFl-突變NS4B多核普酸)或包含SEQIDNO:65所示的核苷酸序列的多核苷酸(AHCl-突變NS4B多核苦酸)。但本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因只要參與HCV基因的復(fù)制并顯示出顯著效果即可，并不限于這些，可以列舉如含有多核苦酸的丙型肝炎病毒基因，所述多核苷酸包含相對于SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:65所示的核苷酸序列優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為99%以上的同源性的核苷S吏凈列。對本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因沒有限定，只要包括NS4B區(qū)的多核苷酸即可，可以包括含有HCV的部分多核苷酸的部分丙型肝炎病毒基因和包含全長HCV多核苷酸的丙型肝炎病毒基因。作為HCV的部分多核苷酸，可以列舉如包含SEQIDNO:1、3、10、61或63中的任意核苷酸序列部分的核苷酸，具體可以列舉5'U丁R(第1位第341位的核苷酸序列)、核心(第342位~第914位的核苷酸序列)、El區(qū)(第915位~第14卯位的核苷酸序列)、E2區(qū)(第1491位~第2579位的核苷酸序列)、P7區(qū)(第2580位第2768位的核苷酸序列)、NS2區(qū)(第2769位~第3419位的核苷酸序列)、NS3區(qū)(第3420位~第5312位的核苷酸序列)、NS4A區(qū)(第5313位~第5474位的核苷酸序列)、NS4B區(qū)(第5475位第6257位的核苷酸序列)、NS5A區(qū)(第6258位笫7W8位的核苷酸序列)、NSSB區(qū)(第75"位第93"位的核苷酸序列)、3，非翻譯區(qū)(第9372位~第9594位的核苷酸序列)的部分多核苷酸。另外，作為包含全長HCV多核苷酸的丙型肝炎病毒基因，可以列舉出包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苷酸序列的丙型肝炎病毒基因。本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因包括從重癥肝炎患者體內(nèi)分離的丙型肝炎病毒基因。重癥肝炎是指肝炎中癥狀出現(xiàn)后8周以內(nèi)呈現(xiàn)II度以上的腦癥和凝血酶原時(shí)間為40%以下，分為10日以內(nèi)出現(xiàn)腦癥的急性型和10日以后出現(xiàn)腦癥的亞急性型。本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因的克隆可如下進(jìn)行。采用酸性異硫氰酸胍.苯酚.氯仿法(例如ISOGEN-LS、日本-一》公司制備)等，由重癥丙型肝炎患者的血清制備總RNA。通過使用3'UTR特異性引物和小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptII、Lifetechnologies7>司制備)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，由總RNA合成cDNA。通過使用5，UTR3，UTR的特異性引物的PCR[PCRProtocols,AcademicPress(1990)]來擴(kuò)增所合成的HCV的cDNA。將所擴(kuò)增的HCV基因克隆到pGEM-TEASY載體(Promega公司制備)中，確定核苷酸序列。HCV基因的兩末端可以通過使用5'UTR特異性引物的5，-RACE和使用3，UTR特異性引物的3，-RACE[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998(1988)]而得到。將得到的cDNA片段連起來，可以獲得全長HCV基因。對本發(fā)明的DNA沒有限定，只要是相當(dāng)于作為RNA的上述丙型肝炎病毒基因的DNA即可，可以列舉如利用逆轉(zhuǎn)錄酶由丙型肝炎病毒基因合成的單鏈cDNA以及包含該單鏈cDNA和其互補(bǔ)鏈的雙鏈DNA。本發(fā)明的多肽只要是編碼于包含SEQIDNO:1、3、10、61或63所示的核苷酸序列的多核苷酸中的多肽、或者是包括丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基S餅列中第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的多肽即可，對其區(qū)域及長度沒有特別限定，但優(yōu)選為包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的丙型肝炎病毒蛋白可以包括包含SEQIDNO:2、4、11、62或64所示的氨基酸序列中第1位第191位的氨基酸序列的核心蛋白、包含第192位~第383位的氨基S臾序列的El蛋白、包含第384位~第746位的氨基酸序列的E2蛋白、包含第747位第809位的氨基酸序列的P7蛋白、包含第810位~第1026位的氨基酸序列的NS2蛋白、包含第1027位第1657位的氨基酸序列的NS3蛋白、包含第1658位~第1711位的氨基M列的NS4A蛋白、包含第1712位~第1972位的氨基酸序列的NS4B蛋白、包含第1973位~第2419位的氨基酸序列的NS5A蛋白、或包含第2420位第3010位的氨基酸序列的NS5B蛋白。本發(fā)明的復(fù)制子RNA只要是含有包含基因型1b的核苷酸序列的多核苷酸、在細(xì)胞內(nèi)具有自主復(fù)制能力的RNA即可，沒有特別限定。作為參與HCV的復(fù)制子RNA復(fù)制的核苷酸區(qū)，可以特別列舉出5'UTR、3'UTR和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白一NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的核苷酸區(qū)，在本發(fā)明的復(fù)制子RNA中，上述所有區(qū)都很重要，但在提高復(fù)制效率方面，編碼NS4B蛋白的區(qū)是最重要的。特別是作為NS4B蛋白，優(yōu)選作為包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽的TPF1-NS4B多肽，更優(yōu)選作為包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽的TPF1-突變NS4B多肽、或者作為包含SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽的AHCl-突變NS4B多肽。因此，本發(fā)明的復(fù)制子RNA優(yōu)選包括編碼TPF1-NS4B多肽的多核苷酸、特別是包含SEQIDNO:5所示的核苷酸序列的多核苷酸(TPF1-NS4B多核苷酸)的復(fù)制子RNA，更優(yōu)選包括編碼TPFl-突變NS4B多肽的多核苦酸、特別是包含SEQIDNO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸(TPF1-突變NS4B多核苷酸)、或編碼AHC1-突變NS4B多肽的多核苷酸、特別是包含SEQIDNO:65所示的核苷Sl/f列的多核苷酸(AHC1-突變NS4B多核苷酸)的復(fù)制子RNA。但本發(fā)明的復(fù)制子RNA并不限于上述包括NS4B區(qū)的多核普酸的復(fù)制子RNA,還包括含有下述多核苷酸的復(fù)制子RNA，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:65所示的核苦酸序列的同源性優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、最優(yōu)選為99%以上的核普酸序列。TPF1-突變NS4B多核香酸(SEQIDNO:7)是指TPF1-NS4B多核苦酸(SEQIDNO:5)的第278位的A置換成U、第763位的G被置換成A的多核香酸。另外，TPF1-突變NS4B多肽(SEQIDNO:8)是指TPF1-NS4B多肽(SEQIDNO:6)的第93位的谷氨酰胺(Q)置換成亮氨酸(L)、第255位的谷氨酸(E)被置換成賴氨酸(K)的多肽。作為本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因和復(fù)制子RNA的一個(gè)實(shí)施方式，可以包括編碼丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基S^列中第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的核苷酸。第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的位置是指在包含3010個(gè)氨基酸的基因型lb的丙型肝炎病毒基因中的位置。第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸是NS4B蛋白中所含的氨基酸，迄今為止含有上述氨基酸的NS4B蛋白還未見報(bào)道。因此，含有上述氨基酸的HCV多蛋白、含有編碼上述氨基酸的多核苷酸的RNA復(fù)制子也未見報(bào)道。對基因型lb的丙型肝炎病毒基因的核苷酸序列沒有特別限定，例如包括與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:10、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63所示的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列。本發(fā)明的復(fù)制子RNA的結(jié)構(gòu)只要可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制即可，對其沒有限定，可以列舉出包括丙型肝炎病毒的全長RNA的復(fù)制子RNA、或包括一部分RNA的亞基因組復(fù)制子RNA。例如，亞基因組復(fù)制子RNA可以包括5'非翻譯區(qū)(以下有時(shí)稱作5，UTR)、3，非翻譯區(qū)(以下有時(shí)稱作3'UTR)和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白^NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的核苷酸區(qū)，優(yōu)選可以包括包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苦酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列的多核香酸、以及包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的多核苷酸。在基因型lb的丙型肝炎病毒基因中，5，UTR通常包含341核苷酸，至于復(fù)制子RNA中所含的5'UTR,對其核苷酸序列沒有限定，但優(yōu)選包括其全長序列。就3'UTR而言，對其長度根據(jù)病毒林而不同，但通常包含41核香酸的可變區(qū)、長度根據(jù)林而不同的多U區(qū)和98核苷酸的3，X區(qū)，至于復(fù)制子RNA中所含的3'UTR，其核苷酸序列及長度沒有限定，但優(yōu)選包括該抹中的全長3'UTR。本發(fā)明的復(fù)制子RNA除了包括全長RNA和亞基因組RNA以外，還可以包括篩選標(biāo)記基因、報(bào)道基因或IRES序列，上述復(fù)制子RNA可以列舉如:包含SEQIDNO:9、SEQIDNO:67或SEQIDNO:68中記載的多核苷酸的復(fù)制子RNA。作為篩選標(biāo)記基因，可以列舉如抗生素耐性基因。在本發(fā)明中，優(yōu)選的篩選標(biāo)記基因的例子有新霉素耐性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素耐性基因、吡啶好u胺素耐性基因、腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因、Zeocin耐性基因、噪呤霉素耐性基因等，但優(yōu)選新霉素耐性基因、胸苷激酶基因，最優(yōu)選新霉素耐性基因。但本發(fā)明中的篩選標(biāo)記基因并不限于這些。作為報(bào)道基因，可以列舉如催化發(fā)光反應(yīng)或顯色反應(yīng)的酶的結(jié)構(gòu)基因。在本發(fā)明中，優(yōu)選的報(bào)道基因的例子有來自轉(zhuǎn)座子Tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、來自大腸桿菌的(3葡糖醛酸酶或(3半乳糖苦酶基因、螢光素酶基因、綠色螢光蛋白基因、來自水母的水母素H夕卩才乂，A叫uorin)基因、分泌型胎盤堿性磷酸酶(SEAP)基因等。但本發(fā)明中的報(bào)道基因并不限于這些。對IRES序列沒有限定，可以列舉如EMCVIRES(腦心月幾炎病毒的內(nèi)部核糖體結(jié)合部位)、FMDVIRES、HCVIRES等，但更優(yōu)選EMCVIRES和HCVIRES,最優(yōu)選EMCVIRES。本發(fā)明的復(fù)制子RNA優(yōu)選為干擾素抵抗性。利用干擾素對HCV患者進(jìn)行治療時(shí)，干擾素是否有效，這要考慮例如病毒側(cè)的因素和宿主側(cè)的因素。病毒側(cè)的因素可以列舉出對干擾素顯示抵抗性的HCV基因區(qū)，但本發(fā)明的復(fù)制子RNA優(yōu)選包括對干擾素顯示抵抗性的HCV基因區(qū)的復(fù)制子RNA。對干擾素顯示抵抗性的HCV基因區(qū)沒有特別限定，可以列舉如被i人為是NS5A區(qū)的IFN感受性指標(biāo)的ISDR區(qū)。本發(fā)明的復(fù)制子RNA優(yōu)選包括基因型lb的核苷S吏序列的多核苷酸的復(fù)制子RNA,可以列舉如含有包含與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:65所示的核普酸序列的同源性為卯％以上的核苷酸序列的多核香酸的RNA復(fù)制子。對本發(fā)明的DNA沒有限定，只要是直鏈狀DNA的形態(tài)、且編碼上述復(fù)制子RNA的DNA即可，例如還可以包括用于產(chǎn)生復(fù)制子RNA的RNA啟動(dòng)子。本發(fā)明的復(fù)制子RNA可以采用任意的基因工程學(xué)方法來制作。雖然沒有限定，但復(fù)制子RNA例如可以利用以下方法進(jìn)行制作。利用常規(guī)方法將編碼上述復(fù)制子RNA的DNA插入克隆載體中，制作DNA克隆。將該DNA插入RNA啟動(dòng)子的下游，制作可以產(chǎn)生復(fù)制子RNA的DNA克隆。優(yōu)選上述RNA啟動(dòng)子為質(zhì)?？寺≈兴腞NA啟動(dòng)子。對RNA啟動(dòng)子沒有限定，可以列舉出T7RNA啟動(dòng)子、SP6RNA啟動(dòng)子、SP3RNA啟動(dòng)子，特別優(yōu)選T7RNA啟動(dòng)子。對插入DNA的載體沒有特別限定，可以列舉如質(zhì)粒載體、直鏈狀雙鏈DNA載體、以及腺病毒載體、腺病毒伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體等病毒載體，但優(yōu)選為質(zhì)粒載體。本發(fā)明的復(fù)制子RNA可以由上述插入有DNA的載體來制作。以DNA克隆為模板，利用RNA聚合酶合成RNA。RNA的合成可以利用常規(guī)方法從5'非翻譯區(qū)開始。當(dāng)模板DNA為質(zhì)?？寺r(shí)，還可以通過限制酶從該質(zhì)?？寺∏谐鲞B接在RNA啟動(dòng)子下游的上述DNA區(qū)，使用其DNA片段作為模板來合成RNA。需要說明的是，優(yōu)選所合成的RNA的3'末端與病毒基因組RNA的3，非翻譯區(qū)一致，優(yōu)選不添加其他序列也不刪除其他序列。例如，在本發(fā)明的全長復(fù)制子RNA的一個(gè)優(yōu)選方式中，將其插入到在5'UTR的上游具有T7RNA啟動(dòng)子、在3，UTR末端具有限制酶Xbal部位的載體中，經(jīng)XbaI消化后，利用T7RNA聚合酶可以合成HCV基因組RNA。本發(fā)明的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞可以通過將上述RNA復(fù)制子導(dǎo)入到任意的細(xì)胞中來制作。對導(dǎo)入復(fù)制子RNA的細(xì)胞沒有特別限定，優(yōu)選來自人肝臟的細(xì)胞、來自小鼠肝臟的細(xì)胞或來自猴肝臟的細(xì)胞，特別可以列舉出來自人肝癌的細(xì)胞^Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞或Hep3B細(xì)胞、或者IMY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、Vero細(xì)胞或293細(xì)胞。向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入復(fù)制子RNA可以利用任意的轉(zhuǎn)染法來進(jìn)行。上述導(dǎo)入法可以列舉如電穿孔法、粒子槍法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，但特別優(yōu)選電穿孔法。制子RNA時(shí)，利用選擇標(biāo)記基因或報(bào)道基因的表達(dá)，可以選擇導(dǎo)入有該復(fù)制子RNA并持續(xù)進(jìn)行復(fù)制的細(xì)胞。例如，當(dāng)復(fù)制子RNA中含有新霉素耐性基因作為選擇標(biāo)記基因時(shí)，將轉(zhuǎn)染了該復(fù)制子RNA的細(xì)胞播種在培養(yǎng)皿中，按0.05毫克/毫升~3.0毫克/毫升的濃度添加G418(新霉素)。之后，每周交換2次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，自播種時(shí)起23周后可以看到集落。本發(fā)明的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生復(fù)制子RNA、丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒顆粒。因此，使用復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，可以產(chǎn)生復(fù)制子RNA、丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒顆粒。在復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制子RNA可以通過任意的RNA提取法從細(xì)胞內(nèi)提取出來。從細(xì)胞中提取的RNA通過再次導(dǎo)入到細(xì)胞中，可以發(fā)揮復(fù)制子RNA的功能。本發(fā)明的丙型肝炎病毒蛋白可以使用分泌在細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)上清中的蛋白。所產(chǎn)生的丙型肝炎病毒蛋白可以通過公知的方法進(jìn)行提取、純化。另外，由復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生的丙型肝炎病毒顆?？梢允褂梅置谠诩?xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中的病毒顆粒。本發(fā)明的丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒顆粒通過在復(fù)制子RNA中加入改變，以修飾RNA、病毒蛋白或病毒顆粒、降低病原性，從而還可用作疫苗。通過使用上述復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，可以篩選控制丙型肝炎病毒感染的物質(zhì)。"控制丙型肝炎病毒的感染，，是指例如控制HCVRNA的復(fù)制(例如促進(jìn)或抑制)、控制由RNA向蛋白質(zhì)的翻譯(例如促進(jìn)或抑制)。具體而言，使試驗(yàn)物質(zhì)與復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞接觸，并分析復(fù)制子RNA的增加度，從而可以進(jìn)行試驗(yàn)物質(zhì)的篩選。復(fù)制子RNA的增加度是指復(fù)制子RNA的復(fù)制速度或量的變化。具體而言，通過檢測或測定復(fù)制子細(xì)胞中的復(fù)制子RNA的量，并與對照的沒有和被檢物質(zhì)接觸的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞的復(fù)制子RNA的量進(jìn)行比較，可以篩選被檢物質(zhì)。另外，通過檢測或測定細(xì)胞中或上清中的丙型肝炎病毒蛋白的量，并與對照的沒有和被檢物質(zhì)接觸的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞的量進(jìn)行比較，也可以篩選被檢物質(zhì)。對篩選中可以檢測或測定的丙型肝炎病毒蛋白沒有特別限定，但優(yōu)選為核心蛋白，還可以使用市售的試劑盒來測定核心蛋白。另外，通過使篩選方法自動(dòng)化，還可適應(yīng)于高通量篩選(High-throughputScreening)方法。并且，本發(fā)明的篩選方法作為評(píng)價(jià)所篩選的藥物的效果的方法也有效。必需按照該篩選方法進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)時(shí)，該篩選方法還可用作制造藥物的方法?！蹲饔谩冯m然關(guān)于包括編碼丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的核苷酸的丙型肝炎病毒基因和復(fù)制子RNA并未完全闡明，但可作如下推論。但是，本發(fā)明并不限于以下的說明。本發(fā)明人等使用編碼其他3010個(gè)氨基酸的基因型lb的林代替后述的實(shí)施例9中使用的AHC1抹，重復(fù)實(shí)施例9的操作，得到了與實(shí)施例9相同的結(jié)果。但是，作為具有NS4B蛋白以外的適應(yīng)突變的亞基因組復(fù)制子，得到了下述復(fù)制子堿基數(shù)第5308位的T突變?yōu)镃,且3010個(gè)HCV多蛋白的第1656位的氨基酸由V(纈氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)的復(fù)制子；和除上述突變外，堿基數(shù)第6846位的A突變?yōu)镚，且3010個(gè)HCV多蛋白的第2169位的氨基酸由T(酪氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)的復(fù)制子。根據(jù)由TPF1抹、AHC1林和上述基因型lb的林得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以考慮以下情況。包括編碼第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的核苷酸的基因型lb的復(fù)制子RNA與不含該核苷酸的復(fù)制子RNA相比，RNA的復(fù)制效率提高。即，基因型lb的丙型肝炎病毒的復(fù)制子RNA通過具有上述兩個(gè)適應(yīng)突變，使RNA的復(fù)制效率提高。通過使用上述的具有NS4B蛋白中的兩個(gè)上述適應(yīng)突變的復(fù)制子RNA，并轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，確實(shí)可以得到復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞。由該復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞得到的復(fù)制子RNA除了NS4B蛋白中的兩個(gè)上述適應(yīng)突變之外，有時(shí)還導(dǎo)入有一個(gè)以上的其他適應(yīng)突變。即，除了NS4B蛋白中的兩個(gè)上述適應(yīng)突變之外，有時(shí)通過導(dǎo)入一個(gè)以上的其他適應(yīng)突變，復(fù)制子RNA的復(fù)制效率也會(huì)提高。作為上述NS4B蛋白中的兩個(gè)上述適應(yīng)突變以外的適應(yīng)突變，包括已知的適應(yīng)突變和未知的適應(yīng)突變。作為已知的適應(yīng)突變，有人才艮道了表1所示的突變。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>實(shí)施例《實(shí)施例1:重癥丙型肝炎病毒全長基因的分離和解析》(A)從血清中提取RNA使用HighPureViralNucleicAcidKit(Rochediagnosticscorporation),按照生產(chǎn)商推薦的方法，從在重癥肝炎患者的急性期采取的250,L血清中純化RNA。(B)cDNA的合成和通過PCR進(jìn)行的cDNA的擴(kuò)增向已純化的RNA中加入XR58R引物，利用SuperSucriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)，按照生產(chǎn)商推薦的方法進(jìn)行42°C、1小時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。向所得反應(yīng)液中加入RNaseH(Invitrogen),使之在37。C下反應(yīng)30分鐘，分解RNA。使用HC-LongAl引物、lb9405R引物和TakaraLATaqDNA聚合酶(寶酒造)，對上述反應(yīng)液進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(以94°C、20秒、68°C、9分鐘為一次熱循環(huán)反應(yīng)，重復(fù)進(jìn)行30次熱循環(huán)反應(yīng))，擴(kuò)增cDNA。再使用HC85F和HC9302R引物，對所得的一部分反應(yīng)液進(jìn)行PCR，擴(kuò)增HCVcDNA。(C)cDNA的克隆已擴(kuò)增的DNA片段用0.7%瓊脂糖凝膠通過電泳進(jìn)行分離，使用QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN公司)，按照生產(chǎn)商推薦的方法回收DNA片段。使回收的DNA片段與pGEM-Teasy載體(Promega公司)發(fā)生連接反應(yīng)，利用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a林。選擇氨芐青霉素耐性轉(zhuǎn)化體，用2YT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。使用WizardPlusSVMiniprepDNA純化系統(tǒng)從培養(yǎng)的菌體中純化質(zhì)粒。(D)核苷酸序列的確定HCVcDNA的核苷酸序列使用根據(jù)HCV的基因型lb的核脊酸序列設(shè)計(jì)的引物來確定。使用CEQDTCSQuickStart試劑盒(《少夕t》r一^夕一)，按照生產(chǎn)商推薦的方法進(jìn)行反應(yīng)，利用CEQ2000XLDNA分析系統(tǒng)(軟件4.0.0版、《少夕》■=r一A夕一)進(jìn)行分析。利用S叫uencher(4.1.2版、GeneCodesCorporation)分析所得的數(shù)據(jù)。將得到的HCV克隆命名為pTPFl-0193。(E)5'非翻譯區(qū)的cDNA的獲得和核苷酸序列的確定再利用5'RACE法，由上述步驟(A)中得到的RNA獲得5，非翻譯區(qū)的末端cDNA。使用用于cDNAEnds快速擴(kuò)增的5'RACE系統(tǒng)(SystemforRapidAmplificationofcDNAEnds),2.0片反(Invitrogen公司)試劑盒，按照附錄的說明書進(jìn)行實(shí)施。用于cDNA合成的反義引物使用Chiba-as。使用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)來合成cDNA,并用S.N.A.P柱進(jìn)行純化，之后對cDNA進(jìn)行TdT-tailing反應(yīng)，添加dCTP。利用試劑盒中附帶的5'RACE精簡的錨定引物(AbridgedAnchorPrimer)和KY78引物，使用TakamLATaqDNA聚合酶(寶酒造)進(jìn)行第一次PCR。以一部分該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，利用試劑盒中附帶的UTP引物和KM2引物，使用TakamLATaqDNA聚合酶(寶酒造)進(jìn)行第二次PCR，得到PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體中，按照上述步驟(D)來確定核苷酸序列。將所得的包括SEQIDNO:1中第1位第709位的HCVcDNA克隆命名為pTPF1-0007。(F)3'非翻i奪區(qū)的cDNA的獲得和核苷酸序列的確定利用3'RACE法，由上述步驟(A)中得到的RNA獲得3'非翻譯區(qū)的末端cDNA。首先，使用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion),按照附錄說明書向患者的RNA中添加Poly(A)。除了使用dT-Adp引物代替XR58R引物、使用3UTR-1F引物和Adp引物作為第一PCR的引物、以及使用XR58F和Adp引物作為第二PCR的引物以外，重復(fù)上述步驟(B)(D)的操作。將得到的HCVcDNA克隆命名為pTPFl-8994。將得到的HCV林命名為TPFl抹。TPFl林是全長為9594堿基的HCV，其核苷酸序列見SEQIDNO:1。所得TPFl林的多核苷酸在其342位9374位之間具有編碼一長3010個(gè)氨基酸的翻譯區(qū)。TPFl才朱的多蛋白的氨基S^f列見SEQIDNO:2。以下顯示用于克隆和確定核香酸序列的引物。XR58R(SEQIDNO:12):5,-tcatgcggctcacggacctttcacagctag-3'HClongAl(SEQIDNO:13):5'-atcgtcttcacgcagaaagcgtctagccat-3'lb9405R(SEQIDNO:14):5'-gcctattggcctggagtgtttagctc-3，HC85F(SEQIDNO:15):5'-atggcgttagtatgagtgtcgtgcagcct-3，HC9302R(SEQIDNO:16):5，-tcgggcacgagacaggctgtgatatatgtct-3，chiba-as(SEQIDNO:17):5'-tgcacggtctacgagacct-3，KY78(SEQIDNO:18):5，-ctcgcaagcaccctatcagccagt-3'KM2(SEQIDNO:19):5，陽aggcattgagcgggtttat-3，dT-Adp(SEQIDNO:20):5，扁ctagactcgagtcgacatcgtttttttttttttttttt-3，3UTR-1F(SEQIDNO:21):5,-atcttagccctagtcacggc-3，Adp(SEQIDNO:22):5'-ctagactcgagtcgacatcg-3，XR58F(SEQIDNO:23):5,-ctagctgtaaaggtccgtgagccgcatga畫3，Ml3PrimerM3(SEQIDNO:24):5,-gtaaaacgacggccagt畫3，MBPrimerRV(SEQIDNO:25):5'畫caggaaacagctatgac-3'104(SEQIDNO:26):5，畫aggaagacttccgagcggto-3，HC841S(SEQIDNO:27):5，-ggaacttgcccggttgctctttctctatcttc-3'El(SEQIDNO:28):5，畫attccatggtggggaactgggctaa陽3，HC2069S(SEQIDNO:29):5，-taacaataccttgacctgccccacggactg-3，HC2430S(SEQIDNO:30):5，-aacatcgtggacgtgcaatacctgtacgg-3，HC2461AS(SEQIDNO:31):5，-gaccctacaccgtacaggta畫3，HC2769S(SEQIDNO:32)HC3632F(SEQIDNO:33)HC3928S(SEQIDNO:34);，-ttggaccgggagatggctgcatcgtg-3';，-cacccaaatgtacaccaatgt-3，;,-tacccgttgagtctatggaaac-3'HC4016AS(SEQIDNO:35):5，-cacttggaatgtctgcggta-3，HC4498S(SEQIDNO:36)HC4888F(SEQIDNO:37)HC5381F(SEQIDNO:38)HC5692S(SEQIDNO:39)5'陽agggggggaggcatctcattttctg-3'5，-tgctatgacgcgggctgtgcttggta-3'5，-ggtcattgtgggcaggatcat-3，55-ctgcctgg肌accccgcgat-35HC5858F(SEQIDNO:40):5'隱tggcagcataggccttgggaaggt-3，HC6315F(SEQIDNO:41):5，隱aagacctggctccagtccaag-3，5A-1(SEQIDNO:42):5，-ttccatgctcaccgacccctc-3'HC7090S(SEQIDNO:43):5，-gtggagtcagagaataaggt-3，HC7743F(SEQIDNO:44):5，-cagaagaaggtcacctttgac-3'HC8192S(SEQIDNO:45):5,-gcagcgggtcgagttcctggtgaat-3,HC8939F(SEQIDNO:46):5，-ctacggggcctgttactccattgaac-3，《實(shí)施例2:亞基因組RNA復(fù)制子的制作》將丙型肝炎病毒TPF1林的全長多核苷酸插入pBluescriptIISK(+)的T7RNA啟動(dòng)子序列的下游(以下稱作pTPFl)。接下來，將pTPFl的編碼結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)的一部分替換成新霉素耐性基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、NPT-II)和EMCV-IRES(腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體結(jié)合部位)，建立質(zhì)粒DNApRepTPFl。其建立順序遵照已經(jīng)報(bào)道的順序(Lohmann等，Science,(1999)285,第110~113頁)。具體而言，首先將pTPFl用限制酶AgeI和BsrGI切斷，在該切斷部位連接插入以下片段將來自pTPFl的5'UTR核心區(qū)的序列和來自pcDNA3.1(+)的新霉素耐性基因通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增，并用限制酶Agel和Pmel切斷而得到的片段；以及將EMCV-IRESNS3區(qū)的序列通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行結(jié)合，并用限制酶Pmel和BsrGI切斷而得到的片段。以將該質(zhì)粒DNApRepTPFl用Xbal切斷的產(chǎn)物為模板，使用MegascriptT7試劑盒(Ambion)來合成RNA。按照生產(chǎn)商推薦的方法純化RNA。向Dulbecco，s改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM,IWAKI)中加入10%胎牛血清(FBS)，并加入青霉素和鏈霉素，使分別達(dá)到50U/mL和50^g/mL的濃度，以所得培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，添加5%二氧化碳，在37。C下培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞(Huh7、JCRB0403)。將形成融合之前的細(xì)胞通過胰蛋白酶、EDTA處理，從培養(yǎng)皿上剝離，并再懸浮于添加了血清的培養(yǎng)基中，從而使胰蛋白酶失活。用PBS清洗2次，之后再懸浮于添加有1.25%DMSO的Cytomix(120mM氯化鉀、10mM磷酸鉀、5mM氯化鎂、25mMHEPES、0.15mM氯化4丐、2mMEGTA、pH7.6)中，之后移入間隔為0.4cm的電穿孔小槽中。將適量的RNA加入到細(xì)胞中，之后在冰上充分冷卻5分鐘。使用電穿孔儀(Bio-Rad),以960uF、250V施加脈沖。立即再懸浮于8mL培養(yǎng)基中，將一部分播種在皿中。培養(yǎng)一定時(shí)間后，以lmg/mL的濃度向培養(yǎng)jmi中添加G418(新霉素)。之后，每間隔4天交換培養(yǎng)液一次繼續(xù)培養(yǎng)。自播種時(shí)起培養(yǎng)約20天后，從培養(yǎng)皿中克隆存活細(xì)胞的集落，繼續(xù)培養(yǎng)。通過克隆上述集落，可以建立pRepTPFl復(fù)制子RNA自主復(fù)制的細(xì)胞。至于復(fù)制子RNA是否進(jìn)行復(fù)制，這要通過定量RT-PCR法分析細(xì)胞性RNA中所含的復(fù)制復(fù)制子RNA的拷貝數(shù)來確定。負(fù)鏈的定量方法復(fù)制子RNA發(fā)生自主復(fù)制，這要根據(jù)細(xì)胞中是否可以檢測到HCVRNA的5'UTR區(qū)的負(fù)鏈來研究。負(fù)鏈的特異性定量法按照與曰本特愿平08-187097號(hào)公報(bào)中記載的負(fù)鏈RNA的特異性檢測法相同的方法來進(jìn)4亍。將以pRepTPF-l為模板、在體外合成的RNA通過電穿孔導(dǎo)入到細(xì)胞中，由該細(xì)胞可以檢測出顯著量的負(fù)鏈，確認(rèn)到在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制子RNA進(jìn)行了自主復(fù)制?！秾?shí)施例3:適應(yīng)突變的分析》按照實(shí)施例2，將以pRepTPFl為模板、在體外合成的RNA轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中，由此建立復(fù)制子RNA復(fù)制細(xì)胞抹。使用ISOGEN(曰本^、一按照生產(chǎn)商推薦的條件，從上述復(fù)制細(xì)胞抹中提取細(xì)胞內(nèi)RNA。按照與實(shí)施例1中由TPF1獲得基因的步驟相同的步驟，由上述細(xì)胞內(nèi)RNA擴(kuò)增幾乎遍及復(fù)制子RNA的全區(qū)的DNA。具體而言，以提取的細(xì)胞內(nèi)RNA為模板，利用SuperSucriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和XR58R引物，合成與復(fù)制子RNA相符的cDNA。使用上述cDNA中的一部分，在EMCV-S1引物5'-tgcacatgctctacatgtgtttagtcgagg-3，(SEQIDNO:60)和HC9405R引物的存在下，使用TakaraLATaqDNA聚合酶(寶酒造)，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(以94°C、20秒、68°C、6分鐘為一次熱循環(huán)反應(yīng)，重復(fù)進(jìn)行30次熱循環(huán)反應(yīng))，從而進(jìn)行HCVcDNA的擴(kuò)增。確定克隆到pGEM-Teasy載體中的克隆的序列時(shí)，確認(rèn)石威基數(shù)第5752位的A置換成T、第6237位的G置換成A。其結(jié)果，相當(dāng)于SEQIDNO:2的氨基酸序號(hào)1804的氨基酸由Q(谷氨酰胺)突變?yōu)長(亮氨酸)、相當(dāng)于氨基酸序號(hào)1966的氨基酸由E(谷氨酸)突變?yōu)镵(賴氨酸)。接下來，就上述氨基酸置換對復(fù)制子RNA的復(fù)制造成的影響進(jìn)行研究。首先，4吏用QuickMutagenesis試劑盒(Stratagene)，4姿照生產(chǎn)商推薦的方法，將氨基酸序號(hào)1804(Q—L)和氨基酸序號(hào)1卯6(E—K)的適應(yīng)突變導(dǎo)入實(shí)施例2中制作的HCVRNA復(fù)制子pRepTPFl中。將導(dǎo)入了該氨基酸置換的復(fù)制子RNA命名為pRep4B。將不具有引起突變的核苷酸序列的pRepTPFl和具有氨基酸突變的pRep4B的質(zhì)粒DNA用Xbal切斷，以所得產(chǎn)物為模板，使用MegascriptT7試劑盒(Ambion)來合成RNA。按照生產(chǎn)商推薦的方法純化RNA。將純化的各RNA轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中，在G418的存在下培養(yǎng)約20天，用結(jié)晶紫對存活細(xì)胞進(jìn)行了染色。計(jì)測被染色的集落數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染的每1,g復(fù)制子RNA量的集落數(shù)。轉(zhuǎn)染1^gRepTPFlRNA時(shí)，選擇1個(gè)G418耐性集落，而轉(zhuǎn)染1pgRep4BRNA時(shí)，選擇104個(gè)集落。即，認(rèn)為引起復(fù)制子RNA中的氨基酸突變的堿基突變在Huh7細(xì)胞中是提高復(fù)制子RNA的復(fù)制效率的適應(yīng)突變?！秾?shí)施例4:適應(yīng)突變對HCVRNA復(fù)制的效果》將實(shí)施例2中制作的完全長HCVDNApTPFl用限制酶Sfil切斷，在其切斷部位連接插入將pRep4B用限制酶Sfil切斷的片段，從而制作插入有適應(yīng)突變的完全長HCVDNApTPFl/4B。將由插入有該適應(yīng)突變的pTPFl/4B合成的完全長HCVRNA在Huh7細(xì)胞中的復(fù)制效率與pTPFl的情形進(jìn)行比較。具體而言，利用與實(shí)施例2相同的方法在體外合成完全長HCVRNA,并轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中。將進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞立即再懸浮于10mL培養(yǎng)基中，以每孔1mL的量向12孔平板的各孔(直徑為22.1mm)中播種，開始培養(yǎng)。于4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)回收培養(yǎng)上清。將回收的培養(yǎng)上清以2krpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，回收上清。使用HCV核心抗原試劑盒(富士k匕'才、AS乂V"久)測定100〃L的上清。如圖1所示，在導(dǎo)入有適應(yīng)突變的pTPFl/4B的上清中，核心抗原的測定值在每一點(diǎn)均高于不具有適應(yīng)突變的對照pTPFl的情形。這表明通過將本發(fā)明的適應(yīng)突變導(dǎo)入到完全長HCVRNA復(fù)制子中，HCVRNA復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)高效率地進(jìn)行復(fù)制，并將核心蛋白分泌到上清中。這顯示出與在肝臟中復(fù)制的結(jié)構(gòu)相同的全長型基因組可以在體外進(jìn)行復(fù)制。特別是在本發(fā)明的TPF1-NS4B多肽中，認(rèn)為通過將編碼具有上述適應(yīng)突變的TPFl-突變NS4B多肽的多核苷酸用于復(fù)制子RNA,RNA的復(fù)制效率得以提高。《實(shí)施例5:可以再感染的HCV顆粒的建立》在實(shí)施例4中，分泌在培養(yǎng)上清中的核心抗原形成病毒顆粒，研究該病毒顆粒在體外能否再感染。具體而言，將由pTPFl/FL4B合成的完全長HCVRNA轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中，培養(yǎng)72小時(shí)后回收培養(yǎng)上清。將回收的培養(yǎng)上清以2krpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，之后進(jìn)行濾器過濾(0.45/mi、Millipore)，除去破碎的細(xì)胞等。使進(jìn)行了濾器過濾的上清與在12孔平板(直徑為22.1^m)中培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞在4。C的低溫條件下反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)后添加5%二氧化碳，移入37。C的培養(yǎng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。于4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)用lmMEDTA-PBS剝離細(xì)胞，通過離心分離進(jìn)行回收。將沉淀細(xì)胞溶解于50//LRIPA緩沖液(20mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，1mMEDTA,1%NP40,0.1%脫氧膽酸鹽，0.1%SDScompleteproteaseinhibitorcocktail(蛋白酶承卩制劑)(Rochediagnosticscorporation))中，通過以10krpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘來回收上清。使用HCV核心抗原試劑盒(富士k匕'才、》;、乂V^義)測定5〃L的上清。如圖2所示，在經(jīng)pTPFl/4B的培養(yǎng)上清處理的細(xì)胞內(nèi)核心抗原在4小時(shí)~24小時(shí)曾經(jīng)一度減少，之后從48小時(shí)起開始上升，96小時(shí)后仍在增加。這表明在本發(fā)明的完全長HCVRNA在細(xì)胞中復(fù)制而釋放的培養(yǎng)上清中，含有新型的可感染Huh7細(xì)胞的病毒顆粒。《實(shí)施例6:由干擾素感受性急性肝炎患者獲得丙型肝炎病毒全長基因》嘗試著從用干擾素治療見效的急性肝炎患者的血清中獲得丙型肝炎病毒全長基因。使用RNA提取試劑ISOGEN-LS(日本夕一乂)，按照附錄說明書從患者血清中提取RNA。利用與實(shí)施例1中由TPF1獲得全長基因的方法相同的方法，從上述RNA中獲得第85位第9302位的HCV基因。將其克隆到pGEM-Teasy載體中，在確定其序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)該基因是屬于基因型lb的典型的全長基因。接著，確定3，非翻譯區(qū)的核酸序列。向提取的2.5〃LRNA中加入5pmole(0.5^L)引物8913F,在70。C下保持3分鐘，之后在水中驟冷。向其中加入2〃L5xFirst-StrandBuffer、1//L0.1M的DTT、0.5//L20mM的dNTP、20單位RNaseInhibitor(寶酒造)、0.5SuperSucriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen),再加入經(jīng)焦碳酸二乙酯處理過的滅菌水，使總量達(dá)到10〃L。使該混合液在42。C下反應(yīng)60分鐘。為了破壞RNA，加入12URNaseH(寶酒造、60UL),在37。C下保持30分鐘，之后在72。C下失活3分鐘，用作cDNA。使用引物8913F和RP2,按照與上述相同的方法對2,L的該cDNA進(jìn)行PCR。使用一部分該P(yáng)CR產(chǎn)物，利用8939F和R1的引物進(jìn)行第二次PCR，得到約600堿基的PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到pGEM-TEasy載體中，確定其序列。一方的HCVcDNA的5'末端如下分離，并確定其序列。使用HCLongHl、HC705R和TakaraEXTaqDNA聚合酶(寶酒造)，對上述的一部分經(jīng)RNaseH處理過的cDNA反應(yīng)液進(jìn)行PCR(以94°C、20秒、55°C、30秒、72°C、1分鐘為一次熱循環(huán)反應(yīng)，重復(fù)進(jìn)行35次熱循環(huán)反應(yīng))，從而使已經(jīng)報(bào)道的相當(dāng)于HCVcDNA的第l位709位的片段擴(kuò)增。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體中，確定其序列。通過以上操作獲得全病毒基因組序列，將其命名為AHC1抹。所得AHC1林的全長為9594堿基長，所確定的全病毒基因組的核苷酸序列在其342位9374位之間具有編碼一長3010個(gè)氨基酸的翻譯區(qū)。其核苷酸序列見SEQIDNO:10、氨基酸序列見SEQIDNO:11。以下顯示用于克隆和基因解析的引物。XR58R(SEQIDNO:12):5，-tcatgcggctcacggacctttcacagctag-3，HClongAl(SEQIDNO:13):5，-atcgtcttcacgcagaaagcgtctagccat國3，lb9405R(SEQIDNO:14):5'-gcctattggcctggagtgtttagctc-3，HC85F(SEQIDNO:15):5'-atggcgttagtatgagtgtcgtgcagcct-3，HC9302R(SEQIDNO:16):5，-tcgggcacgagacaggctgtgatatatgtct-3，HC8913F(SEQIDNO:47):5，-cttgaaaaagccctggattgtcagat匿3，HC8939F(SEQIDNO:46):5'-ctacggggcctgttactccattgaac-3，Rl(SEQIDNO:48):5'畫acatgatctgcagagaggccagtatcagcactctc-3HClongHl(SEQIDNO:49):5'-gccagccccctgatgggggcgacactccacc-3，HC705R(SEQIDNO:50):5'-agccgcatgtaagggtatcgatgac畫3"RP2(SEQIDNO:51):5，-acatgatctgcagagaggcc畫3，M13PrimerM3(SEQIDNO:24):5'-gtaaaacgacggccagt-3，M13PrimerRV(SEQIDNO:25):5,-caggaaacagctatgac-3，HC161S(SEQIDNO:52):5，-gagtacaccggaattgccaggacgaccggg-3，104(SEQIDNO:26):5，-aggaagacttccgagcggtc-3'HC841S(SEQIDNO:27):5'-ggaacttgcccggttgctctttctctatcttc-3'HC1405S(SEQIDNO:53):5,-attccatggtggggaactgggccaa-3，El(SEQIDNO:28):5，-attccatggtggggaactgggctaa-3，HC2006AS(SEQIDNO:54):5，-catccatgtgcagccgaaccaatt-3，HC2199AS(SEQIDNO:55):5，-aggggtagtgccaaagcctgtatgggtagt-3，HC2430S(SEQIDNO:30):5，-aacatcgtggacgtgcaatacctgtacgg隱3，HC2769S(SEQIDNO:32):5'誦ttggaccgggagatggctgcatcgtg-3，HC3111AS(SEQIDNO:56):5，-ataatgacccccggcgactttccgcactaac-3HC3591AS(SEQIDNO:57):5'-catggtagacagtccagcac-3，HC4016AS(SEQIDNO:35):5'隱cacttggaatgtctgcggta-3，HC4498S(SEQIDNO:36):5，-agggggggaggcatctcattttctg國3，HC4888F(SEQIDNO:37):5，-tgctatgacgcgggctgtgcttggta畫3，lb5290AS(SEQIDNO:58):5，-gacatgcatgtcatgatgtatttg-3，HC5950AS(SEQIDNO:59):5'畫ctcatgaccttaaaggccac-3，HC5858F(SEQIDNO:40):5，畫tggcagcataggccttgggaaggt畫3，HC6315F(SEQIDNO:41):5'-aagacctggctccagtccaag-3，5A-1(SEQIDNO:42):5'-ttccatgctcaccgacccctc-3'HC7090AS(SEQIDNO:43):5，-accttattctctgactccac-3，HC7743F(SEQIDNO:44):5'陽cagaagaaggtcacctttgac-3，HC8192S(SEQIDNO:45):5'-gcagcgggtcgagttcctggtgaat-3，《實(shí)施例7:干擾素抑制HCVRNA復(fù)制子的復(fù)制》使用完全長HCVRNA復(fù)制子，嘗試著評(píng)價(jià)干擾素對HCV復(fù)制的抑制作用。在評(píng)價(jià)干擾素的抑制作用中使用的完全長HCVRNA,使用了實(shí)施例4中可在Huh7細(xì)胞中高效率復(fù)制的pTPFl/4B和實(shí)施例6中獲得的AHC1與pTPFl/4B的嵌合體。嵌合載體如下制作將完全長HCVDNApTPFl用限制酶Agel和BsrGI切斷，在其切斷部位連接插入將AHC1用限制酶Agel和BsrGI切斷的片段，從而制作插入有AHC1的結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)的HCVDNApTPFl/AHC1—AgeBsr。利用與實(shí)施例2相同的方法，合成pTPFl/4B和pTPFl/AHC1—AgeBsr的完全長HCVRNA,并轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中。將進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞立即再懸浮于15mL培養(yǎng)基中，以每孔1mL的量向12孔平板的各孔中(直徑22.1mm)播種，開始培養(yǎng)。培養(yǎng)開始24小時(shí)后，與溶解有各種濃度(O.lRJ/mL300IU/mL)的干擾素的培養(yǎng)基交換。再培養(yǎng)24小時(shí)后，用1mMEDTA-PBS剝離細(xì)胞，通過離心分離進(jìn)行回收。將沉淀細(xì)胞溶解于50/^LRIPA緩沖液(20mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,1mMEDTA,1%NP40,0.1%脫氧月旦酸鹽，0.1%SDScompleteproteaseinhibitorcocktail(Rochediagnosticscorporation))中，通過以10krpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘來回收上清。使用HCV核心抗原試劑盒(富士k匕'才、A;、乂VL義)測定的上清。通過曲線算出細(xì)胞內(nèi)的抗原量相對于對照(干擾素未添加區(qū))顯示出50%的核心抗原量的干擾素濃度，作為IC50。結(jié)果見表2。[表2<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>上述試驗(yàn)結(jié)果顯示pTPFl/4B為干擾素抵抗性，而一方的pTPFl/AHCl_AgeBsr為干擾素感受性。由此認(rèn)為本發(fā)明的完全長HCVRNA復(fù)制子是干擾素抵抗性的RNA復(fù)制子，對開發(fā)顯示出干擾素抵抗性的丙型肝炎病毒的治療藥有用。《實(shí)施例8:環(huán)孢菌素A抑制HCVRNA復(fù)制子的復(fù)制》嘗試著評(píng)價(jià)環(huán)孢菌素A對HCVRNA復(fù)制子復(fù)制的抑制作用。評(píng)價(jià)中使用了pTPFl/4B。利用與實(shí)施例2相同的方法，對Huh7細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，播種在12孔平板中。培養(yǎng)4小時(shí)后，交換為溶解有l(wèi)pg環(huán)孢菌素A的培養(yǎng)基。交換為含有環(huán)孢菌素A的培養(yǎng)基后，對于培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后的細(xì)胞，利用與實(shí)施例7相同的方法，使用HCV核心抗原試劑盒(富士k匕'才、》;、乂VL義)測定細(xì)胞內(nèi)的HCV核心抗原量。如圖3所示，確認(rèn)到環(huán)孢菌素A(CsA)添力。區(qū)在轉(zhuǎn)染后4小時(shí)達(dá)到最大值，之后減少。而對照(CsA未添加區(qū))在4小時(shí)~24小時(shí)間曾經(jīng)一度減少，之后從48小時(shí)起開始上升，72小時(shí)后仍在增加。由此確認(rèn)了CsA具有抗丙型肝炎病毒活性。這表明本發(fā)明的完全長HCVRNA可以用作迄今為止報(bào)道的丙型肝炎治療藥的試驗(yàn)系統(tǒng)(篩選方法)。其還可用作用于篩選對HCV的復(fù)制和/或HCV蛋白的翻譯產(chǎn)生影響的各種物質(zhì)的試驗(yàn)系統(tǒng)?！秾?shí)施例9:TPF1株的NS4B蛋白中的適應(yīng)突變的效果》研究由使用了TPF1抹的RNA復(fù)制子得到的NS4B蛋白中的兩個(gè)氨基酸的適應(yīng)突變對其他基因型lb的HCV基因中的復(fù)制子RNA的復(fù)制的影響。按照向?qū)嵤├?中得到的AHC1株的3010個(gè)氨基酸的NS4B區(qū)蛋白中導(dǎo)入適應(yīng)突變的方式，向核苷酸中導(dǎo)入突變。具體而言，使用QuickMutagenesis試劑盒(Stratagene)，4姿照生產(chǎn)商推薦的方法導(dǎo)入核香酸的突變，使第1804位的氨基酸由Q(谷氨酰胺)向L(亮氨酸)突變、37使第1966位的氨基酸由E(谷氨酸)向K(賴氨酸)突變。所得克隆的RNA的核苷酸序列見SEQIDNO:61、氨基酸序列見SEQIDNO:62。以外，重復(fù)實(shí)施例2的操作，獲得具有適應(yīng)突變的質(zhì)粒DNApRepAHCl/4B。以將該pRepAHCl/4B用限制酶XbaI切斷的產(chǎn)物為模板，獲得RepAHCl/4B復(fù)制子RNA，并轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞(Huh7、JCRB0403)中，建立RepAHCl/4B復(fù)制子RNA自主復(fù)制的細(xì)胞抹。使用未導(dǎo)入適應(yīng)突變的AHC1抹的全長多核苷酸作為對照，重復(fù)相同的操作時(shí)，可以建立復(fù)制子RNA自主復(fù)制的細(xì)胞株，但效率為RepAHCl/4B復(fù)制子的約千分之一。由此可知通過向基因型lb的HCV基因中導(dǎo)入編碼NS4b蛋白的2個(gè)適應(yīng)突變的核苷酸的突變，復(fù)制子RNA高效率地進(jìn)行自主復(fù)制。接下來，除了使用所得細(xì)胞林以外，重復(fù)實(shí)施例3的操作，確定復(fù)制的復(fù)制子RNA的核苷酸序列。其結(jié)果，堿基數(shù)第3685位的C突變?yōu)門、對應(yīng)于SEQIDNO:11的氨基酸序號(hào)1115的氨基酸由P(脯氨酸)突變?yōu)長(亮氨酸)。將該突變導(dǎo)入上述pRepAHCl/4B中，得到質(zhì)粒pRepAHCl/4Bm。將由pRepAHCl/4B得到的復(fù)制子RNA即RepAHCl/4B和由pRepAHCl/4Bm得到的復(fù)制子RNA即RepAHCl/4Bm轉(zhuǎn)染到Huh7中，計(jì)算得到的集落數(shù)。RepAHCl/4B的核苷酸序列見SEQIDNO:67，RepAHCl/4Bm的核苷酸序列見SEQIDNO:68。轉(zhuǎn)染1的RepAHCl/4BRNA時(shí)，選擇約10E3個(gè)G418耐性集落，而轉(zhuǎn)染1的RepAHCl/4BmRNA時(shí)，選擇約10E6個(gè)集落。由此可知除了NS4B蛋白中的上述兩個(gè)適應(yīng)突變外，通過導(dǎo)入一個(gè)以上的其他適應(yīng)突變，復(fù)制子RNA的復(fù)制效率得以提高。接下來，作為完全長HCVDNA，除了使用pAHC1代替pTPF1、以及使用pRepAHC1/4Bm代替pRep4B以外，重復(fù)實(shí)施例4的操作，制作完全長HCVDNA即pAHCl和pAHCl/4Bm,將由pAHCl制作的復(fù)制子RNA即AHC1和由pAHCl/4Bm制作的復(fù)制子RNA即AHCl/4Bm轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中，之后測定培養(yǎng)上清中的核心抗原量。結(jié)果見圖4。如圖4所示，轉(zhuǎn)染了具有適應(yīng)突變的AHCl/4Bm的復(fù)制子RNA的細(xì)胞，其24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后的培養(yǎng)上清中的核心抗原測定值高于對照的轉(zhuǎn)染了AHC1的細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的核心抗原測定值。需要說明的是，作為復(fù)制子RNA的AHCl/4Bm的核苷酸序列見SEQIDNO:63、所編碼的氨基酸序列見SEQIDNO:64。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的復(fù)制子RNA，通過將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，可以進(jìn)行自主復(fù)制，產(chǎn)生丙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒蛋白和感染性顆粒。以導(dǎo)入了該復(fù)制子RNA的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞作為丙型肝炎病毒感染的試管內(nèi)模型，反映出HCV在機(jī)體內(nèi)的增殖機(jī)制，可以將該復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞用于HCV治療藥的篩選方法。并且，上述篩選方法除了用于篩選HCV治疔藥以外，還可在治療藥的制造步驟中用于品質(zhì)管理，可以用作藥品的制造方法。以上，雖然按照特定方式說明了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員自明的變形或改良也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.丙型肝炎病毒基因，該基因包括選自下述(A)～(F)的多核苷酸(A)包含SEQIDNO5所示的核苷酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQIDNO7所示的核苷酸序列的多核苷酸；(C)包含SEQIDNO65所示的核苷酸序列的多核苷酸；(D)編碼包含SEQIDNO6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(E)編碼包含SEQIDNO8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(F)編碼包含SEQIDNO66所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。2.權(quán)利要求l所述的丙型肝炎病毒基因，該基因?yàn)榘琒EQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:10、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苷酸序列的多核苷酸。3.基因型lb的丙型肝炎病毒基因，該基因包括編碼丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的核苷酸和編碼NS4B蛋白的多核苷酸。4.DNA，該DNA包括在包含上述權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的丙型肝炎病毒基因的核苷酸序列中尿普置換成胸腺嘧啶的核苷酸序列的單鏈DNA。5.多肽，該多肽包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:66所示的氨基酸序列。6.丙型肝炎病毒多蛋白，其中NS4B區(qū)的肽為包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽。7.丙型肝炎病毒蛋白，該蛋白為選自包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:11、SEQIDNO:62或SEQIDNO:64所示的氨基酸序列中第l位第191位氨基酸序列的核心蛋白、包含第192位第383位氨基酸序列的E1蛋白、包含第384位第746位氨基酸序列的E2蛋白、包含第747位第809位氨基酸序列的P7蛋白、包含第810位第1026位氨基酸序列的NS2蛋白、包含第1027位~第1657位氨基酸序列的NS3蛋白、包含第1658位第1711位氨基酸序列的NS4A蛋白、包含第1712位第1972位氨基酸序列的NS4B蛋白、包含第1973位第2419位氨基酸序列的NS5A蛋白、包含第2420位~第3010位氨基酸序列的NS5B蛋白中的至少一種。8.復(fù)制子RNA,該復(fù)制子RNA包括選自下述(A)(G)的多核苷酸(A)包含SEQIDNO:5所示的核苷酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQIDNO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸；(C)包含SEQIDNO:65所示的核苷S吏序列的多核苷酸；(D)編碼包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(E)編碼包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(F)編碼包含SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(G)包含與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:65所示的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷S1^列的多核苷酸。9.基因型lb的復(fù)制子RNA，該復(fù)制子RNA包括編碼丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中笫1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的核苷酸；以及編碼NS4B蛋白的多核苷酸。10.權(quán)利要求8或9所述的復(fù)制子RNA，該復(fù)制子RNA包括(A)丙型肝炎病毒的5'非翻i奪區(qū)的第1位~第341位的多核苷酸、編碼丙型肝炎病毒的多蛋白中第1027位~第3010位多肽的多核苷酸、以及3，非翻譯區(qū)的多核苷酸；或(B)5，非翻譯區(qū)的第l位第341位的多核苷酸、編碼包含3010個(gè)氨基酸的丙型肝炎病毒的多蛋白的多核苷酸、以及3，非翻譯區(qū)的多核苷酸。11.權(quán)利要求810中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子RNA,該復(fù)制子RNA為干擾素抵抗性。12.權(quán)利要求8~11中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子RNA，該復(fù)制子RNA包括(A)包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中第1位第341位的核苦酸序列的多核苷酸、以及包含SEQIDNO:l所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQIDNO:3所示的核苷S吏序列中第1位第341位的核苷酸序列的多核苷酸、以及包含SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；(C)包含SEQIDNO:10所示的核苷S^f列中第1位~第341位的核苷酸序列的多核苷酸、以及包含SEQIDNO:10所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的多核苦酸；(D)包含SEQIDNO:61所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列的多核苷酸、以及包含SEQIDNO:61所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苦酸序列的多核苦酸；(E)包含SEQIDNO:63所示的核苷酸序列中第1位第341位的核苷酸序列的多核苷酸、以及包含SEQIDNO:63所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；(F)包含相對于SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苦酸序列為90%以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、以及包含與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苷酸；(G)包含相對于SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中第1位第341位的核苷酸序列為90%以上的同源性的核苦酸序列的多核苦酸、以及包含與SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中第3420位第9594位的核苷酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苷酸；(H)包含相對于SEQIDNO:10所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列為卯％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、以及包含與SEQIDNO:10所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核香酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苦酸；(I)包含相對于SEQIDNO:61所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列為卯％以上的同源性的核苷酸序列的多核香酸、以及包含與SEQIDNO:61所示的核苷酸序列中第3420位第9594位的核香酸序列的同源性為90%以上的核苷酸序列的多核苷酸；或(J)包含相對于SEQIDNO:63所示的核苷酸序列中第1位第341位的核苷酸序列為卯％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、以及包含與SEQIDNO:63所示的核苷酸序列中第3420位第9594位的核苦S臾序列的同源性為90。/。以上的核苦酸序列的多核苦酸。13.權(quán)利要求812中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子RNA，其中上述復(fù)制子RNA為包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苷酸序列的多核苷酸；或者包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:10、SEQIDNO:61或SEQIDNO:63所示的核苷酸序列的同源性為90%以上的核普酸序列的多核芬酸。14.權(quán)利要求813中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子RNA，該復(fù)制子RNA包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記基因或報(bào)道基因和至少一個(gè)IRES序列。15.DNA，該DNA編碼權(quán)利要求814中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子RNA。16.載體，該載體包括權(quán)利要求15所述的DNA。17.復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，該復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞是通過將選自杈利要求8~14中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子RNA、權(quán)利要求15所述的DNA和權(quán)利要求16所述的載體的至少一種導(dǎo)入到細(xì)胞中而制作的。18.權(quán)利要求17所述的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，其中上述細(xì)胞為來自肝細(xì)月包的細(xì)刀包。19.權(quán)利要求18所述的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，其中上述來自肝細(xì)胞的細(xì)胞為Huh-7細(xì)胞。20.復(fù)制子RNA,該復(fù)制子RNA是由權(quán)利要求1719中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生的。21.丙型肝炎病毒蛋白，該蛋白為選自由權(quán)利要求1719中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生的CORE、El、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B中的至少一種。22.丙型肝炎病毒顆粒，該顆粒是由權(quán)利要求1719中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生的。23.篩選方法，該篩選方法是篩選控制丙型肝炎病毒感染的物質(zhì)的方法，該方法包括使權(quán)利要求1719中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞與上述物質(zhì)接觸的步驟；以及分析復(fù)制子RNA的增加度的步驟。24.權(quán)利要求23所述的篩選方法，其中上述分析復(fù)制子RNA增加度是指檢測復(fù)制子RNA或丙型肝炎病毒蛋白。全文摘要本發(fā)明提供丙型肝炎病毒基因、來自該基因的復(fù)制子RNA、導(dǎo)入了復(fù)制子RNA的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞、以及使用了該復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞的藥物的篩選方法。通過將含有下述(A)、(B)、(C)、(D)或(E)的多核苷酸的復(fù)制子RNA、或含有編碼丙型肝炎病毒的多蛋白氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的賴氨酸的核苷酸以及編碼NS4B蛋白的多核苷酸的基因型1b的復(fù)制子RNA導(dǎo)入細(xì)胞中，可以制作復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，利用該復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞可以進(jìn)行藥物的篩選。所述(A)～(E)的多核苷酸為(A)包含SEQIDNO5所示的核苷酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQIDNO7所示的核苷酸序列的多核苷酸；(C)編碼包含SEQIDNO6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(D)編碼包含SEQIDNO8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(E)包含與SEQIDNO5或SEQIDNO7所示的核苷酸序列的同源性為90％以上的核苷酸序列的多核苷酸。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101688197SQ20088001394公開日2010年3月31日申請日期2008年4月28日優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日發(fā)明者大植千春,森健一,升槙,深井浩未申請人:株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所