專利名稱：：結(jié)合真菌應(yīng)激蛋白hsp90的新型抗體分子和核酸的制作方法結(jié)合真菌應(yīng)激蛋白HSP卯的新型抗體分子和核酸本發(fā)明涉及特異地結(jié)合真菌應(yīng)激蛋白hsp卯的新型抗體分子、編碼這樣的肽的核酸、藥物組合物及其用途。在例如WO01/76627或WO05/102386中已經(jīng)描述了結(jié)合真菌應(yīng)激蛋白hsp90的抗體片段以及它的治療用途。該抗體片段，也稱Mycograb(Efungumab)，是一種融合蛋白，包括由連接肽連接的免疫球蛋白VH和Vi結(jié)構(gòu)域。這種抗體片段也被稱為"單鏈可變片段"(scFv)。Mycograb是以包涵體的形式在E.coli中經(jīng)過發(fā)酵而產(chǎn)生，其中包涵體是從細胞群中提取、重折疊并隨后在變性條件下通過層析法的步驟純化。天然條件下進行的特征研究表明，efungumab蛋白質(zhì)有形成多聚體或聚合物(術(shù)語"多聚體，，和"聚集體"在本文可互換使用)的傾向。這樣的聚集體，尤其是高分子量的聚集體，對治療用途未必是可取的。因此，對于治療用途來說，可能期望消除或減少高分子量聚集體或者控制聚集，從而使大多數(shù)這樣的聚集體所包含的單體的數(shù)量在一定范圍內(nèi)，例如在10到100個單體之間，例如在11至73或26至57個單體之間。本發(fā)明現(xiàn)在提供了改進的結(jié)合真菌應(yīng)激蛋白hsp90的scFv肽，其對于如折疊性質(zhì)和/或聚集體形成方面具有有利的性質(zhì)。因此本發(fā)明的肽對于治療用途特別有用。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了scFv肽，其包括由氨基酸間隔物連接的Vh結(jié)枸域和Vl結(jié)枸域，其中該Vh結(jié)枸域包括與SEQIDN0.64的序列具有至少80%同一性的序列，該Vl結(jié)枸域包括與SEQIDNO.66的序列具有至少80%同一性的序列，其中該scFv肽包括另外的特征，所述特征選自(a)在VH結(jié)構(gòu)域中對應(yīng)于選自C28、I29、H68、N8S、(:97及其組合的位置上取代或者缺失氨基酸；(b)在VL結(jié)構(gòu)域中對應(yīng)于選自V2、V3、F10、F14、A39、N76及其組合的位置上取代或者缺失氨基酸；(c)該氨基酸間隔物包括序列(GGGGS)n,其中n是在4至6之間；(d)該VH結(jié)構(gòu)域還包括N-末端pelB信號序列，其包括SEQIDNO.68的序列或與其至少有80%序列同一性的序列；(e)該VL結(jié)構(gòu)域位于該VH結(jié)構(gòu)域的N-末端結(jié)尾；(f)特征U)到(e)的組合。優(yōu)選該VH結(jié)構(gòu)域包括與SEQ.IDNO.64的序列具有至少卯％、95%、99%或100%同一性的序列。還優(yōu)選該Vl結(jié)枸域包括與SEQ.IDNO.66的序列具有至少90%、95%、99%或100%同一性的序列。應(yīng)該了解的是，另外的特征的存在無關(guān)序列同一性的水平。例如，如果另外的特征是取代在C28位置的氨基酸，那么甚至在VH結(jié)構(gòu)域包含與SEQ.IDNO.64僅有80%序列同一性的序列的實施方案中，此取代仍存在。在VH結(jié)構(gòu)域中氨基酸取代方便地選自C28Y、C28S、I29S、H68R、N85S、C97Y、C97S及其組合。C2sY取代是特別優(yōu)選的。有利地，在VL結(jié)構(gòu)域中氨基酸取代選自V2I、V3Q、F10S、F14S、A39K、N76S及其組合。優(yōu)選的，該scFv肽包括的M酸序列選自SEQIDNO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62，其中Xaa表示除半胱氨酸以外的氨基酸殘基，且其中的N-末端蛋氨酸殘基可任選地被切除，優(yōu)選Xaa表示酪氨酸殘基。在一個實施方案中Xaa是Tyr(Y)。在另一實施方案中Xaa是Ala(A)、Leu(L)、He(I)、Val(V)、Pro(P)或Met(M);在又一實施方案中Xaa是Phe(F)或Try(W);在另一實施方案中Xaa是GIy(G);在又一實施方案中X是Ser(S)或Thr(T);在又一實施方案中Xaa是GIu(E)或Asp(D);在又一實施方案中Xaa是GIn(Q)或Asn(N);在又一實施案中Xaa是Arg(R)、Lys(K)或His(H)。優(yōu)選該scFv肽還包括純化標(biāo)記，更優(yōu)選在C末端的6組氨酸殘基序列。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供的scFv肽由這樣的M酸序列組成或基本上由這樣的^J^酸序列組成，如SEQIDNO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基酸序列，其中所述的肽可以任選地包括純化標(biāo)記例如，His-標(biāo)記(例如SEQIDNO.10、22或34中所示)。該純化標(biāo)記通常不提供分子的治療效果，因此可以在純化本發(fā)明的scFv片段后即除去。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供的scFv肽包括如SEQIDN0.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基斷列。在一個實施方案中，提供的scFv肽由這樣的M酸序列組成或基本上由這才羊的氨基,列組成，如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基酸序列，其中所述的肽也可以任選地包括純化標(biāo)記例如，His-標(biāo)記(例如，如SEQIDNO.2、4或20中所示)。如容易地被技術(shù)人員理解的一樣，本發(fā)明的肽的第一個Met殘基也可以在體內(nèi)被切除，如果在大腸桿菌中表達，則被大腸桿菌MAP(蛋氨酸氨肽酶)切除。本發(fā)明的scFv肽包括由氨基酸間隔物連接的兩個結(jié)構(gòu)域(術(shù)語"間隔物"和"接頭"交替使用)，該氛基酸間隔物例如具有M酸序列(GGGGS)n，其中n是從1到12的整數(shù)，例如1、2、3、4或5。其中一個命名為VH的結(jié)構(gòu)域，對應(yīng)于抗體片段的重鏈部刺對應(yīng)例如SEQIDNO.2和SEQIDNO.30中所示M餅列的scFv片段中的2至122氨基酸殘基，或在SEQIDNO.32中所示的132至152氨基酸殘基)。另一個命名為VL的結(jié)構(gòu)域，對應(yīng)于抗體片段的輕鏈部分(對應(yīng)例如SEQIDNO,2中的138至246氨基酸殘基，或SEQIDNO.12中的138-246^J^酸殘基，或SEQIDNO.32中的2至110氨基酸殘基)。該Vh或Vt結(jié)構(gòu)域可以位于的本發(fā)明的scFv肽的N-末端，即該分子可以按如下連接V『接頭-VL或Vl-接失-Vh。當(dāng)在大腸桿菌中表達時，該任選的pelB信號序列使肽亞細胞定位到周質(zhì)膜，以改善肽的溶解度。在一個實施方案中，提供了scFv片段，其包含SEQIDNO.30或32中所示的M酸序列。在另一實施方案中，提供了scFv肽，其由這樣的氨基酸序列組成或基本上由這樣的氨基酸序列組成，SEQIDNO.30或32中所示的氨基酸序列，其中該所述的肽也可以任選地包括純化標(biāo)記例如，His-標(biāo)記。一方面，本發(fā)明提供了scFv片段，其包括根據(jù)本發(fā)明的Vh和V^結(jié)構(gòu)域和接頭(例如在SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、30、32或34中所示)，其至少有一個M酸在下列的一個或多個位置被取代C29X、I30X、H69X、N86X、C98X、V139X、V140X、F147X、F151X、A176X、N213X，其中X表示除在SEQIDNO.2中所示的以外的氨基酸(編號方式如SEQIDNO.2中所示，且可以容易地確定在其他突變體中相應(yīng)的M酸位置)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了scFv片段，其至少有以下氨基酸取代中的一個C29Y或C29S、130S、H69R、N86S、C98Y或C98S、V139LV140Q、F147S、F151S、A176K、N213S。應(yīng)該意識到，涉及這方面的氨基酸的編號方式包括N-末端蛋氨酸殘基。在一個實施方案中，提供了scFv片段，其包括SEQIDNO.24、26或28中所示的M酸序列。在另一實施方案中，提供了scFv肽，其由這樣的氨基酸序列組成或基本上由這樣的^J^酸序列組成，如SEQIDNO.24、26或28中所示的氨基酸序列，其中所述的肽也可以任選地包括純化才示^己，j:i口His-才示i己。本發(fā)明的肽作為治療劑是有用的。因此，本發(fā)明的一個方面中，提供的藥物組合物包括根據(jù)本發(fā)明的scFv肽，例如包括如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的^j^紗列，其中Xaa如上定義，結(jié)合可藥用的賦形劑、稀釋劑或栽體。適當(dāng)賦形齊寸的詳'清載于Remington'sPharmaceuticalSciencesandUSPharmacopoeia,1984，MackPublishingCompany,Easton,PA,USA.。示例性的賦形劑包括藥物級(PhEur)尿素和L-精氨酸(PhEur)。例如，本發(fā)明的scFv肽的典型制劑是10mg純scFv肽，150mg藥物級(PhEur)尿素和174mgL-精氨酸(PhEur)，在5ml水中重構(gòu)。可以在劑量為0.1至10mg/kg病人體重的范圍內(nèi)施用本發(fā)明的scFv肽或藥物組合物。劑量在0.5至5mg/kg體重的范圍是優(yōu)選的，劑量約為lmg/kg是特別優(yōu)選的。該藥物組合物可以口服。本發(fā)明的肽可用于治療真菌感染，例如WO01/76627或WO05/102386中所公開的，其中每一項在此通過引用并入本文。例如，本發(fā)明的肽可用于治療系統(tǒng)性真菌感染，如侵入性念珠菌病或侵入性曲霉菌病或侵入性腦膜炎如劇毒念珠菌屬白色念珠菌(Cfl/6/CflWS)、熱帶念珠菌(CI^/7/Cfl/&)和克柔氏念珠菌(C./^"m;)以及毒性較弱近平滑假絲酵母念珠菌(C./7"f"/m7oWv)和光滑球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)。本發(fā)明的肽也可用于念珠菌、隱球菌、組織胞漿菌、曲霉菌、球擬酵母、毛霉菌病、芽生菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病生物或癡疾感染的治療。因此，本發(fā)明提供了治療真菌感染病人的方法，包括對病人施用有效量的本發(fā)明的scFv肽，例如包括如SEQIDNO，2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的^j^酸序列，其中Xaa如上定義。該N-末端Met可被/f壬選切除。本發(fā)明的肽對組合治療特別有用。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明scFv肽和抗真菌劑的組合物或組合的制劑，scFv肽例如包括如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的^J^酸序列(該N-末端Met可祐:任選切除)，其中Xaa如上定義，所述抗真菌劑如多烯抗真菌劑或棘球白素抗真菌劑或唑類抗真菌劑。作為本發(fā)明肽的組合搭檔的抗真菌劑的例子包括例如兩性霉素B、兩性霉素B的衍生物，如兩性霉素B脂質(zhì)體、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合物(Abelcet)、兩性霉素B膠體分?jǐn)溝?Amphocil)和兩性霉素B英脫利匹特乳劑；制霉菌素；5氟胞嘧啶；卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈、LY303366;唑類如艾沙康唑(isavuconazole)、伏立康峻、伊曲康峻、氟康唑、咪康唑、酮康唑、泊沙康唑、阿尼芬凈，米卡芬凈，灰黃霉素，特比萘芬。盡管這種組合一般可以是固定的劑量組合，但scFv肽及其組合搭檔并不打包成固定劑量組合。本發(fā)明的組合制劑在治療真菌感染時可以同時、分別或相繼^f吏用。本發(fā)明的肽也可以與一個以上的抗真菌劑結(jié)合^f吏用，例如，兩性霉素B和5氟胞嘧啶、菌纖維素和兩性霉素B、或棘球白素加唑類。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療真菌感染病人的方法，包括對病人施用有效量的本發(fā)明的scFv肽和至少一種上文所述的抗真菌劑，該scFv肽包括力口SEQIDN0.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的^J^酸序列(該N-末端Met可被任選切除)，其中Xaa如上定義。優(yōu)選的組合搭檔是兩性霉素B或兩性霉素B的衍生物、卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈、伏立康唑、伊曲康唑。組合搭檔可同時、分別或相繼施用。在本發(fā)明的一個實施方案中，引起感染的真菌對本發(fā)明肽的組合搭檔有抵抗力或者有部分抵抗力。本發(fā)明的肽還可用于治療癌癥，或涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病，如自體免疫性疾病或敗血癥，例如在WO06趣384或WO07/077454(PCT/GB2007/000029)中公開的，其各通過引用并入本文。例如，本發(fā)明的肽可用于治療白血病，如淋巴(淋巴細胞)白血病(CLL)、急性骨髓(成髓細胞)白血病(AML)、急性淋巴(成淋巴細胞)白血病(ALL)、慢性骨髓白血病(CML)、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤；或治療靼向人類hsp卯的敗血病(W007/077454)。因此，本發(fā)明提供的治療患有癌癥或涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病(如自身免疫性疾病、全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)或敗血病)病人的方法，包括對病人施用有效量的本發(fā)明的scFv肽，scFv肽例如包括如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基紗列(該N-末端Met可凈皮任選切除)，其中Xaa如上定義。在一些實施方案中，該自體免疫性疾病是克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。本發(fā)明多肽可用于與抗癌劑的組合治療。合適的抗癌劑的例子包括阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、赫賽汀、多西紫杉醇、順鉑、伊馬替尼(Gleevec⑧)、紫杉醇、阿糖胞苷或羥基脲。因此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的scFv肽和抗癌劑的組合物或組合制劑，scFv肽如包括如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基酸序列(該N-末端Met可被任選切除)，其中Xaa如上定義，所述抗癌劑選自阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、赫賽汀、多西紫杉醇、順鉑、伊馬替尼、紫杉醇和羥基脲。還提供了治療癌癥病人的方法，包括對有需要的病人施用有效量的本發(fā)明的scFv肽和至少一種抗癌劑，scFv肽例如包含如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的tt酸序列(該N-末端Met可被任選切除)，其中Xaa如上定義，所述抗癌劑選自阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、赫賽汀、多西紫杉醇、順鉑、伊馬替尼、紫杉醇和羥基脲。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了改進的編碼所述的scFv肽的核酸分子和改進的核酸構(gòu)建體，其特別適用于這樣的scFv肽在例如大腸桿菌中的表達。例如本發(fā)明的核酸構(gòu)建體導(dǎo)致在大腸桿菌中scFv肽表達提高，例如在所表達的scFv肽的同質(zhì)性和滴度方面體現(xiàn)。優(yōu)選地，該核酸分子還包括序列(taa)n，其位于編碼scFv肽的序列的3，端，其中n為1或2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了核酸分子，其包括編碼VH結(jié)構(gòu)域和Vt結(jié)構(gòu)域的序列，該Vh結(jié)枸域包括與SEQIDN0.64具有至少80%的序列同一性的序列，該Vt結(jié)構(gòu)域包括與SEQIDNO.66具有至少80%的序列同一性的序列，以及還包括位于編碼VH或VL結(jié)構(gòu)域的序列的3'端的序列(taa)n，其中n為1或2。提供的3，端的多個終止密碼子避免了誤讀事件。在另一個方面，本發(fā)明提供了核酸分子，例如DNA或RNA分子，其包括如SEQIDNO.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的核苷酸序列，其中nnn表示編碼除半胱氨酸以外的氨基酸的密碼子。例如，在一個實施方案中，nnn可以編碼酪氨酸例如TAT。在另一個方面，本發(fā)明提供的核酸分子包括如SEQIDNO.l、3、5、11、15或19中所示的核苷^f列。如技術(shù)人員所知的，可以容易地修飾核^列而不改變所編碼的M酸序列。核酸分子基于這樣核苷酸序列，其包括如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的核苷酸序列，具有一個或多個(例如，高達IO、20、50或100個)這樣的沉默突變的序列也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還包含核酸分子，其(i)與SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61有至少80%的同一性，優(yōu)選地至少有90%、95%、99%或100%的同一性；或(ii)與具有如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示序列的核酸分子在高度嚴(yán)格的條件下雜交。術(shù)語高度嚴(yán)格的條件很容易被技術(shù)人員理解，可以指例如在37°C(對14堿基寡核苷酸)、48。C(對17堿基寡核苷酸)、55。C(對20g寡核苷酸)、60。C(對23堿基寡核苷酸)用6倍SSC/0.05。/。焦磷酸鈉洗滌。對不同組成的核酸，這種嚴(yán)格的條件的合適的范圍在Krause和Aaronson(1991)MethodsinEnzymology，200:546-556有所描述。在一個實施方案中，本發(fā)明提供的載體分子包括本發(fā)明的核酸分子的核普紗列，例如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示。優(yōu)選地，這樣的載體分子適合于在如大腸桿菌中表達如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的核酸分子。適當(dāng)?shù)谋磉_栽體很容易為技術(shù)人員所知。適當(dāng)?shù)妮d體的例子包括例如pGEX或pET。另一實施方案提供了包括這樣的載體分子的宿主細胞，例如大腸桿菌。在另一實施方案中，提供了生產(chǎn)本發(fā)明的scFv肽的方法，scFv肽如包括SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基酸序列(該N-末端Met可被任選切除)，其中Xaa如上定義，所述方法包括培養(yǎng)已在其中引入表達載體的宿主細胞，該栽體包含在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控元件控制下的本發(fā)明的核酸分子的核酸序列，核酸序列例如SEQIDNO.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所述，在足以表達該宿主細胞如大腸桿菌中的所述肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，從而引起所述肽的生產(chǎn)；回收由所述細胞產(chǎn)生的肽。兩個序列之間的百分比"同一性"，利用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul，StephenF.，ThomasL.Madden,AlejandroA.Schaffer，JinghuiZhang,ZhengZhang,WebbMiller,和David丄Lipman(1997),"GappedBLASTandPSI陽PLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",NucleicAcidsRes.25:3389-3402)使用默認(rèn)參數(shù)測定。特別地，該BLAST算法可以在因特網(wǎng)上使用互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/訪問。附圖簡述圖1概略圖示了野生型MycograbscFv肽和Mycograb突變體序列。編碼各自肽的核酸分子的終止密碼子也顯示在C-末端尾部。圖2圖示了實施例2的ELISA測定的原理。圖3是圖表，其中的黑色的條顯示用NLS溶解所有研究的突變體后的產(chǎn)量。誤差條顯示分析了兩次的樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差。白色的條是所有研究的突變體經(jīng)NLS重折疊后的質(zhì)量平衡的圖示。突變體按重折疊回收值的漸增排序。圖4顯示的圖表示，5個所選突變體在用尿素和DTT作為增溶劑(A)和用鹽酸胍(GuHCl)和DTT作為增溶劑(B)時，重折疊后的回收率。白條當(dāng)用IB.SOL溶液中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量用于計算時的回收率(1當(dāng)量)黑條當(dāng)用IB.RES溶液中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量用于計算時的重折疊回收率。圖5圖表，顯示了所有試驗的突變體在增溶溶液中添加了4。/。NLS后可見開始澄清所需要的時間(白條)，以及直到觀察不到進一步的澄清所需要的時間(黑條)。突變體按照其開始時間的升序排列。圖6溶解響應(yīng)起始的變異性圖表，并顯示半胱氨酸數(shù)、連接元件數(shù)以及重鏈(VH)或輕鏈(VL)片段是否在N末端。1:突變體Mycl06具有最快的溶解開始，但包含5個半胱氨酸。圖7顯示突變體MYC135、Myc130、Myc133、Myc119、Myc123野生型和Myc116的REFend樣品重疊的色譜圖。圖8顯示突變體MYC134、Myc137、Myc138、Myc106、Myc136、Myc123和Myc139的REFend樣品重疊的色語圖。圖9顯示了下列參數(shù)的標(biāo)度估計(scaledestimate)和預(yù)測分布圖(predictionprofiler):突變體的保留時間對于接頭長度、半胱氨酸數(shù)量和VH/VL排列的響應(yīng)。標(biāo)度估計預(yù)測，當(dāng)該^從中心點(預(yù)測分布圖X軸上繪制的紅色數(shù)字)增加到更高水平時，保留時間會變換到什么程度。圖10對試驗的突變體用接頭長度對RP-HPLC(RPC2)中測量的保留時間作圖。對比于其他突變體，MYC130的早保留時間突出。圖11顯示了圖7和8中所有REF.END樣品的歸一化重疊，以估計峰2中的峰面積。圖12顯示8M尿素+DTT、8M尿素、6M鹽酸胍+DTT溶解的MYC119的REF.End樣品的RP-HPLC2色i普圖重疊，6M鹽酸胍用包含20mMTris、2mM半胱氨酸、1%NLS，pH9.0的緩沖液1:50稀釋。圖13用6M尿素和5mMDTT溶解并隨后由1:10稀釋重折疊的MYC119的REF.End樣品的RPC2色語圖。圖14用6M尿素溶解并分別由1:10和1:50稀釋而重折疊的MYC119的REF.IM和REF.END樣品的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的凝膠圖像。1-8泳道非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，9-14泳道還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。R^還原；n-F非還原。圖15用6M尿素(黑色)和4。/。NLS(藍色)溶解后的突變體MYCn9的包涵體樣品的RP-HPLC色譜圖(RPC2)重疊。圖16顯示了左側(cè)凝膠突變體MYC118、119、130、133、134、135和137的還原(r)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖像；以及右側(cè)凝膠相同樣品的非還原(n-r)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖像。圖17顯示了左側(cè)凝膠突變體MYC106、123野生型、136、138、139和140的還原(r)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖像；以及右側(cè)凝膠相同樣品的非還原(n-r)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖像。圖18突變體Myc118、Myc119、Myc130、Myc133和Myc135的REF.End樣品的SECHPLC0.5%NLS色i普圖的重疊。源自這些突變體的包涵體以實驗室規(guī)^莫分離。圖19突變體Myc134、Myc136、Myc137、Myc138、Myc139、Myc140、Myc106和Myc123野生型的REF.End樣品的SECHPLC0.5%NLS色鐠圖的重疊。源自這些突變體的包涵體在中試工廠分離。圖20顯示了所有突變體的REF.End樣品的測量的MW對理論MW的散點圖和線性回歸(連續(xù)線)。還顯示了擬合的95%的置信區(qū)間(虛線)。左上的點表示MYC130。虛線內(nèi)的點是在95%置信區(qū)間(CI)內(nèi)的，因此與野生型沒有顯著差異。兩條虛線下面的點代表具有比預(yù)期低的平均MW的突變體，兩條虛線上面的點代表測得的平均MW比預(yù)期高的突變體。圖21顯示了經(jīng)過50mMTris，pH9.0緩沖液UFDF后的Myc119、Myc106-origami、Myc123野生型和Myc137的REF.END樣品的SEC-HPLC(制劑)色鐠圖。每次體積重建后取樣品。UFDF處理前的樣品(5)，第一次緩沖液交換步驟(2)、第二次緩沖液交換步驟(3)、第三次(4)和最后(5)步驟后。圖22顯示了所有試驗的突變體的REF.IM、REF.3T和REF.END樣品的RP-HPLC2色i普圖。序列表簡述SEQIDNO.1是Mycl23SEQIDNO.2是SEQIDNO.1編碼的肽序列SEQIDNO.3是Myl02，Mycograb-6H-TAASEQIDNO.4是SEQIDNO.3編碼的肽序列SEQII)NO.5是Mycl01、Mycograb-TAASEQIDNO.6是SEQIDNO.5編碼的肽序列SEQIDNO,7是MycC29X-TAA,例如Myl05、MycC29Y-TAASEQIDNO.8是SEQIDNO.7編碼的肽序列SEQIDNO.9是MycC29X-6H-TAA，例如Mycl06、MycC29Y-6H-TAA、Mycl13、MycoC29S-6H-TAASEQIDNO.10是SEQIDNO.9編碼的肽序列SEQIDNO.11是Mycl07、Myco-4-TAASEQIDNO.12是SEQIDNO.11編碼的肽序列SEQIDNO.13是MycoC29X-4-TAA，例如Mycl08、MycoC29Y-4-TAA;Mycl14、MycoC29S-4-TAASEQIDNO.14是SEQIDNO.13編碼的肽序列SEQIDNO.15是Mycl09、NMyco-4-TAASEQIDNO.16是SEQIDNO.15編碼的肽序列SEQIDNO,17是N-MycoC29X-4-TAA，例如Mycl10、N-MycoC29Y-4-TAASEQIDNO.18是SEQIDNO.17編碼的肽序列SEQIDNO.19是Mycl11、N-Myco-6H-TAASEQIDNO.20是SEQIDNO.19編碼的肽序列SEQIDNO.21是N-MycoC29X-6H國TAA，例如Mycl12、N-MycoC29Y-6H-TAASEQIDNO.22是SEQIDNO.21編碼的肽序列SEQIDNO.23是Mycl15、MycYSSSSEQIDNO.24是SEQIDNO.23編碼的肽序列SEQIDNO.25是Mycl16、MycYSIQSSSEQIDNO,26是SEQIDNO.25編碼的肽序列SEQIDNO.27是Mycl17、MycSIQKSSEQIDNO.28是SEQIDNO.27編碼的肽序列SEQIDNO.29是Mycl18、VH畫2Bam-2VLSEQIDNO.30是SEQIDNO.29編碼的肽序列SEQIDNO.31是Mycl19、VL-2Bam-2VHSEQIDNO.32是SEQIDNO.31編碼的肽序列SEQIDNO.33是Mycl45、MycC98X-6H-TAASEQIDNO.34是SEQIDNO,33編碼的肽序列SEQIDNO.35是Mycl29(MycYSRIQSS)SEQIDNO.36是SEQIDNO.35編碼的肽序列SEQIDNO.37是Mycl30(MycYSRSIQSSKS)SEQIDNO.38是SEQIDNO.37編碼的肽序列SEQIDNO.39是Mycl33SEQIDNO.40是SEQIDNO.39編碼的肽序列SEQIDNO.41是Mycl34SEQIDNO.42是SEQIDNO.41編碼的肽序列SEQIDNO.43是Mycl35SEQIDNO.44是SEQIDNO.43編碼的肽序列SEQIDNO.45是Mycl36SEQIDNO.46是SEQIDNO.45編碼的肽序列SEQIDNO.47是Mycl37SEQIDNO.48是SEQIDNO.47編碼的肽序列SEQIDNO.49是Mycl38SEQIDNO.50是SEQIDNO.49編碼的肽序列SEQIDNO.51是Mycl39SEQIDNO.52是SEQIDNO.51編碼的肽序列SEQIDNO.53是Mycl40SEQIDNO.54是SEQIDNO.53編碼的肽序列SEQIDNO.55是Mycl41SEQIDNO.56是SEQIDNO.55編碼的肽序列SEQIDNO.57是Mycl42SEQIDNO.58是SEQIDNO.57編碼的肽序列SEQIDNO.59是Mycl43SEQIDNO.60是SEQIDNO.59編碼的肽序列SEQID肌61是Mycl44SEQIDNO.62是SEQIDNO.61編碼的肽序列SEQIDNO.63是編碼野生型Mycl23scFv肽重鏈的核苷酸序列。SEQIDNO.64是SEQIDNO.63編碼的肽序列SEQIDNO.65是編碼野生型Mycl23scFv肽輕鏈的核苷酸序列。SEQIDNO.66是SEQIDNO.65編碼的肽序列SEQIDNO.67是pdB信號序列的核苷酸序列SEQIDNO.68是SEQIDNO.67編碼的肽序列。SEQIDNO.69是念珠菌hsp90的表位，SEQIDNO.2的scFv肽(Mycograb)是對于該表位特異的。SEQIDNO.70是在實施例2中用于結(jié)合測定的亂序(scrambled)的肽的表位。實驗實施例1大腸桿菌宿主細胞用表達栽體轉(zhuǎn)化，并在浸沒培養(yǎng)(submersculture)中培養(yǎng)。在適宜的OD600，scFv的表達通過可誘導(dǎo)啟動子的抑制或激活所誘導(dǎo)(即tac、trc或T7-lac啟動子)。該豫導(dǎo)導(dǎo)致了scFv在宿主細胞中的積累，使得不溶性包涵體產(chǎn)生，其主要是由聚集的scFv形成。經(jīng)過適當(dāng)?shù)谋磉_時期后，通過離心收獲細胞，并進行破裂。隨后通過重量分析方法分離不溶性的包涵體。將SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的DNA序列插入到適合大腸桿菌的表達栽體中(即pET)。蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主中表達，然后通過親和色鐠法純化。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)流程(見例如，Harlow&Lane,同上；Sambrook，J.等，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Sambrook，J.&Russell,D.，2001，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor)。在細胞內(nèi)表達后，scFv肽以包涵體的形式在大腸桿菌細胞中累積。為了純化，分離包涵體并通過溶解和重折疊作用提取產(chǎn)物。通過離子交換色譜法和固定金屬親和層析(IMAC)使純化達到純度95%以上。實施例2-ELISA活性測定1.概要用ELISA檢測MYC123("野生型"Mycograb)和突變Mycograb肽的結(jié)合活性，其中使用hsp90的肽表位作為抗原。Myeograb或Mycograb突變體與生物素化肽結(jié)合，生物素化肽再結(jié)合鏈霉抗生素涂布的微滴定板。使用亂序的肽作為對照序列。使用綴合了過氧化物酶的抗-His抗體來完成檢測，其結(jié)合到MYC123蛋白質(zhì)的His區(qū)域。該過氧化物酶與ABTS底物反應(yīng)產(chǎn)生綠色物質(zhì)，在405nm測量該綠色物質(zhì)的吸收。該405nm處的吸收與溶液中的MYC123活性成比例。該活性用參考標(biāo)準(zhǔn)物的6點標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，并與該參考物對比以％活性表示。在圖2中描述了ELISA的原理，其中鏈霉抗生素1涂在平板上并與生物素2結(jié)合。生物素2再與hsp90肽3結(jié)合，該hsp卯肽3位于MYC123scFv肽5的hsp卯結(jié)合位點4。該scFv肽5具有His標(biāo)記6，抗-His-過氧化物酶檢測抗體7與His標(biāo)記6結(jié)合。2.方法原理及來源使用的ELISA是一種直接檢測方法，其利用生物素化抗原肽(生物素-NKILKVIRKNIVKK:念珠菌hsp卯的表位序列)涂布的鏈霉抗生素表面微滴定板捕獲Mycograb或Mycograb突變體。然后使用綴合辣根過氧化物酶的抗-His標(biāo)記抗體檢測Mycograb或Mycograb突變體的存在。然后將辣根過氧化物酶的底物ABTS加到孔中，存在的Mycograb的濃度與405nm處測量的吸光度成比例。Mycograb或Mycograb突變體才羊品的活性直接由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是利用先存在的Mycograb藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的。3.材料3.1設(shè)備StreptawellHighBind孩￡滴定板是由Roche供應(yīng)(目錄號11989685001)。使用Bio-RadModel680微板讀板器進行分析。使用微板管理(MicroplateManager)軟件版本5.2.1(Bio-Rad，USA)執(zhí)行硬件控制。使用微軟的Excel進行數(shù)據(jù)分析。3.2化學(xué)藥品和試劑3.2.1化學(xué)藥品除非另有說明，所有化學(xué)藥品均為分析級。Tris..........................................SigmaT6791牛血清白蛋白.................................SigmaA7030濃鹽酸.......................................Sigma32033-1磷酸鹽緩沖鹽片劑........................SigmaP4417吐溫20.......................................SigmaUltraP7949抗-His標(biāo)記抗體HRP綴合物...............SigmaA7958ABTS..........................................SigmaA3219生物素-NKILKVIRKNIVKK(SEQ.IDNO:69)…Pepceuticals，UK生物素-SFKWGVTTSLSYFPK(SEQ.IDNO:70)...Pepceuticals,UK水、超純(Milli-Q)水18.2MQ過濾0.22jim孔徑。3.2.2試劑封閉緩沖儲液l(超純水中5。/。w/v牛血清白蛋白)牛血清白蛋白(BSA)...........................................2.5g稱取2.5gBSA加到50mL的超純水中。在4。C儲存1周。1MpH值7.8的Tris緩沖液Tris....................................121.24g稱取121.24gTris溶于950ml超純水并攪拌。檢查pH并逐滴加入濃鹽酸調(diào)整pH值至7.8。用超純水加到1升。通過0.22fun的過濾器(Sartorius)過濾并在室溫下保存達1個月。樣品稀釋緩沖液(20mMTris，pH值7.8，0.1%w/vBSA)將lmL的1MTris儲液加入48ml超純水和lmL封閉緩沖儲液1。每次實驗新制。洗滌緩沖液(PBS+吐溫200.1%v/v)在卯0mL超純水中溶解5片PBS片劑，加入lmL吐溫20,攪拌直到片劑溶解并加入超純水至1000mL。在4。C儲存達1周。封閉緩沖儲液2(洗滌液+5%w/vBSA)BSA.................................2.5g稱取2.5gBSA并溶解在50mL洗滌緩沖液中。在4。C儲存1周。肽稀釋緩沖液(PBS+0.1Q/qv/v吐溫20+0.1%w/vBSA)將lmL封閉緩沖儲備2加到49mL洗滌緩沖液中。每次實驗新鮮制備?？乖娜芤荷锼?NKILKVIRKNIVKK肽..............................10mg。通過稱取10mg肽并將其溶解在5ml超純水中，制備2mg/ml的常規(guī)合成的抗原肽溶液。將50-100^1的小份分裝到1.5mlEppendorf管中并冷凍保存于-80。C達一年?？乖牟僮魅芤?4fig/mL肽，處于肽稀釋緩沖液中)將25nL抗原肽溶液(2mg/mL)添加到12.475mL肽稀釋緩沖液中，得到4照/mL的溶液。每次實驗新鮮制備。3.2.3樣品制備對照力口在5ml超純水中，重懸1x10mgMycograb對照品批次(BN270603)輕輕混合，以確保所有在小瓶中的粉末均摻入并溶解。在13，000rpm離心5分鐘，以除去任何顆粒物。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)UV蛋白質(zhì)濃度方法測定該溶液的蛋白質(zhì)濃度。試驗品在5ml超純7jC中重懸1x10mgMycograb或Mycograb突變體試驗材料，并以與對照品同樣的方式處理。校準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)物在樣品稀釋緩沖液中稀釋對照品材料，得到5mL5照/mL的最高濃度樣品。然后用此溶液來產(chǎn)生2倍連續(xù)稀釋樣品，每個樣品的最終體積是2mL，濃度范圍是5-0.156jig/mL。4,操作1.從冷凍庫取出一份2mg/ml的抗原肽儲液，并用含0.r/。(w/v)BSA和0.1。/。(v/v)吐溫20的PBS緩沖液以1:500(25^1肽于12.5ml緩沖液中)稀釋，來產(chǎn)生4jig/ml肽的操作溶液。96孔的高結(jié)合Str印taWell板(Roche)的B-H行涂布100nl處于0.1%(w/v)BSAPBS-0.1%(v/v)吐溫20中的4ng/ml的生物素-NKILKVIRKNIVKK肽。在A4亍所有孔的每孔中加入100^1的0.1%(w/v)BSAPBS-0,1%(v/v)吐溫20，然后將該板在4。C過夜儲存。2.然后在ThermoWellWashAC洗板機上，用200^1PBS0.1%(v/v)吐溫20緩沖液洗滌該板孔3x30秒。3.上樣前制備Mycograb和Mycograb突變體樣品，通過將重懸的Mycograb瓶裝儲液用20mMTris緩沖液pH7.8、0.1%(w/v)BSA稀釋至5pg/ml制備。然后從該5ng/ml起始溶液制備Mycograb⑧樣品，通過用20mMTris緩沖液pH7.8、0.1%(w/v)BSA將其連續(xù)2倍稀釋至0.15625ng/ml。所有的每次稀釋取決于該實驗所需的數(shù)量，在1.5mlEppendorf管(VWR目錄號211-2139)或7mlBijoux容器(VWR目錄號215-0328)中進行。然后將每個稀釋樣品的100nl上樣到平板上，一式三份。包含100nl20mMTrispH7.8、0.1%(w/v)BSA的空白孔的對照組也包括在H行中。4.將該板在室溫放1小時，然后如步驟2中所述用PBS-0.1%(v/v)吐溫20洗滌孑L3次。5.將100nl小鼠單克隆抗-HisHRP綴合物(SigmaA7058)上樣至各孔，濃度為1:2000，處于0.1%(w/v)BSAPBS-0.1%(v/v)吐溫20中，并在室溫;故置1小時。6.然后按如上所述洗滌孔，通過加入lOOjilABTS⑧試劑檢測結(jié)合的Mycograb⑧。當(dāng)二次校準(zhǔn)曲線中最高濃度樣品的吸光度達1.3AU時取得讀數(shù)，在405nm處讀取比色顯色。Mycograb⑧濃度與A405nm處的吸收成比例。7.將該參考物A405nm的吸光度結(jié)果轉(zhuǎn)移到Excel表格中，用參考樣品A405nm減去空白后的值對于Mycograb⑧的濃度(ng/ml)作六點二次校準(zhǔn)函數(shù)y=a+bx+cx2，其相關(guān)系數(shù)^0.99。如果觀察到"鉤狀"效應(yīng)(hookeffect)存在，則將最高濃度點從圖中除去，得到5-點校準(zhǔn)曲線。只要每一式三份的測量值中的異常值不超過一個，則在一些情況下每板有兩個孔異常值(目測)從數(shù)據(jù)分析中除去。使用非線性回歸分析計算百分比活性，以使用適當(dāng)?shù)奈舛确椒ㄓ嬎銟悠返谋碛^濃度。在研究中獲得的ELISA結(jié)果列于表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>樣品1和3-6是包涵體預(yù)純化、重折疊并移除洗涂劑NLS(通過Dowex層析法或透析過濾)后獲得的處理過程中間體(并非最終的藥物物質(zhì))，。樣品2是Biomeva/Thymoorgan生產(chǎn)的原始野生型藥物產(chǎn)品，并在臨床試驗第III期(PhaseIIItrial)中使用。原始藥物產(chǎn)品的規(guī)格為參考標(biāo)準(zhǔn)的75-125%。所有樣品被評定為有活性的(結(jié)合)。實施例3-新型隱球菌(Oy/;似co"附w^/^附a附)最低抑菌濃度的測定概述在最低抑菌濃度(MIC)測定中，利用新型隱球菌作為模型生物，測定MYC123的抗真菌活性。這種分析測量抗真菌活性并可以模擬MYC123在臨床環(huán)境中的作用。MYC123的MIC是根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化文件(theNationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandardsdocument)M27-A2(2002)利用微量肉湯稀釋法測定。簡言之向RPMI培養(yǎng)基接種103CFU/ml新型隱球菌。將濃度遞減的MYC123加到培養(yǎng)基中(1024jig/ml、512jig/ml、256照/ml...)。將MIC板塊在37。C孵育72小時。終點確定為產(chǎn)生光學(xué)澄清的孑L(MIC-O)的濃度和導(dǎo)致混濁度相對于生長對照顯著降低(S50%生長抑制，MIC-2)的濃度。方法測定前的制備安全櫥SAB板接種新型隱球菌并在35。C培養(yǎng)48-72小時。該板用石蠟封口膜密封。工作臺制備RPMI。按照NCCLS方法學(xué)(M27-A2)制備抗真菌劑-處于RPMI生長培養(yǎng)基中，總共ll個濃度。濃度是單個MIC所需終濃度的2倍。MIC板在一個U型96孔板中，將待測試的IO(HU的最高藥物濃度(2倍所需濃度)加到A和B行的孔1中(一式兩份進行測定)。將此步驟在板上按列以逐減的濃度進行重復(fù)，例如下一個濃度A+B行的孔2，下一個濃度A+B行的孔3，孔12中只包含生長培養(yǎng)基。安全櫥接種物制備-直接菌落懸液。新型隱球菌的直接菌落懸液來自48-72小時齡的板，于RMPI培養(yǎng)基中制成。將其調(diào)整到0.5MacFarlands標(biāo)準(zhǔn)(約lxl0、5xl06cfu/ml)。制備1:50的稀釋液。進一步制備1:20稀釋液(約Ixl03-5xl03cfu/ml，2倍接種物所需)。安全櫥平板接種。該板從孔12至孔1操作。這避免了藥物移行。用移液管向每個孔中加100nl接種物懸浮液(最終接種物(0.5xl03-2.^103cfu/ml)。用石蠟封口膜密封板。將MIC板在37。C孵育72小時。為了檢查接種物，將接種物懸液連續(xù)稀釋，并將10pl稀釋液涂至SAB板上，在37。C孵育72小時。讀取結(jié)果使用鏡測讀數(shù)；增長與無藥物對照(孔12)的增長相比較，增長值如下0-光學(xué)上澄清1-輕孩史混濁2-生長顯著降低(約50%)3-混濁度稍有減少4-混濁度不減少研究中得到的MIC結(jié)果如表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>樣品1和3-6是包涵體預(yù)純化、重折疊并移除洗滌劑NLS(通過Dowex層析法或透析過濾)后獲得的處理過程中間體(并非最終的藥物物質(zhì))，。樣品2是Biomeva/Thymoorgan生產(chǎn)的原始野生型藥物產(chǎn)品，并在臨床試驗第III期中使用。將獲得的樣本的MIC結(jié)果與相應(yīng)的緩沖液獲得的結(jié)果進行對比。除了樣品3之外，所有樣品相對于參考070602也視為有活性的。樣品3和緩沖液6得到了相同的結(jié)果，表明該不含MYC123的緩沖液對試驗生物是有毒的。樣品1和4-6的值與Tris緩沖液的值差距很大，表明了數(shù)據(jù)的可靠性提高。實施例4概述該Mycograb突變體的目的是獲得與野生型Mycograb相比具有改進的結(jié)構(gòu)特性的突變體scFv肽。人們相信，通過點突變，特別是由酪氨酸取代游離的半胱氨酸，應(yīng)可減少下游加工過程中的聚集和不正確的二硫鍵的形成。人們還相信，交換重鏈片段和輕鏈片段的定位，以及移除His-標(biāo)記對Mycograb分子天然3D結(jié)構(gòu)的形成是有益的?？寺『?，在發(fā)酵前對構(gòu)建體進行測序。擴大發(fā)酵的規(guī)3莫，從而為包涵體(IB)的分離和進一步的下游加工遞送足夠的材料。到重折疊結(jié)束步驟，根據(jù)修改以適合(此研究)的Biomeva方法純化突變體的表達構(gòu)建體。以實施例5至12z^布的方式對一些突變Mycograb肽的物理參數(shù)進行測試。所測試的突變體及其突變的概述在表3中給出。研究中包含了野生型以作對比。表3:12個所研究的Mycograb突變體和野生型(mycl23)的名稱及結(jié)構(gòu)特性<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>現(xiàn)在描述試驗測定中所使用的方法包涵體(IB)的分離由突變體Myc118、119、130、133和Myc135的搖瓶培養(yǎng)物于LVA(Laborversuchsanstalt)中獲得4L發(fā)酵液，發(fā)酵液用高壓勻漿器(LAB40-15RBF1)在RPP4中分裂，于700巴進行兩個循環(huán)，每個15分鐘。用瓶離心，于4。C在10000rpm離心20分鐘，從細胞碎片中分離試驗量的包涵體。用實驗室用水(WFL)洗滌包涵體兩次，隨后在WFL中制備20%(w/v)懸浮液。分裝懸浮液，儲存在-20。C。因為這些突變體的發(fā)酵是在生物反應(yīng)器中以30升的規(guī)模進行的，在RPP4中從突變體Myc134、137、138、106、136、139、140和Myc123(wt)中分離出中試^!^莫的包涵體。用碟片離心機(discstackcentrifuge)從細胞碎片中分離包涵體。在WFL中制備20。/Q(w/v)懸浮液。分裝懸浮液，儲存在-20。C。用NLS溶解(根據(jù)修改以適合的Biomeva方法)。通過用WFL將20。/。包涵體懸浮液稀釋至蛋白質(zhì)濃度為8mg/ml，然后用100mMTris堿、4%NLS、pH9.0緩沖液以l:2稀釋，以使20D/。包涵體懸浮液溶解。在室溫下在燒杯中攪拌溶液直至澄清，但至少30分鐘。紀(jì)錄直至開始澄清和澄清結(jié)束的時間。使用尿素、鹽酸胍、DTT的備選溶解方案。該備選溶解方案是用20mMTris8M尿素+/-5mMDTT或者20mMTris、6M鹽酸胍+/-5mMDTT，二者都在pH9.0，以1:10稀釋各體積的20%包涵體懸浮液。產(chǎn)生的尿素和鹽酸胍的濃度分別是7.2M和5.2M，取決于包涵體懸浮溶液的體積。溶解的包涵體的重折疊用NLS重折疊。用50mMTris堿緩沖液以1:4稀釋溶解的溶液進行重折疊。NLS的終濃度為0.5%。加入50nMCuCl2以起始重折疊。在加入CuCl2前和之后，還有加入CuCl2后大約24、48、72和96小時取^f羊品并立即進行RPC2分析。用尿素、鹽酸胍溶解后的重折疊。在用8M尿素或6M鹽酸胍+/-01^溶解后，Mycograb溶液用包含20mMTris堿、1%NLS和2mM胱氨酸、pH9.0的緩沖液以1:50稀釋進行重折疊。對于一些突變體，也在用尿素溶解后，用含有20mMTris堿、0.5ML-精氨酸和2mM胱氨酸、pH9.0的緩沖液以1:10稀釋Mycograb溶液。分別在4。C攪拌重折疊溶液96小時或者在室溫攪拌重折疊溶液24小時。重折疊動力學(xué)記錄突變體Myc119的重折疊動力學(xué)以確定所需的重折疊時間。如上所述溶解Myc119的20%的包涵體懸浮液樣品。如上所述進行重折疊，但在各時間間隔提取樣本，用RPC2分析。通過UF/DF從重折疊溶液中移除NLS。如上所述溶解和重折疊突變體Myc119、Myc137、Myc106和Myc123(wt)。重4斤疊后，用Amicon攪拌裝置(stircell)以10kDa分子量的截斷值，進行REF.END溶液的緩沖液更換。每經(jīng)過一個更新體積(turnover)，即用反相高效液相色i瞽法(RP-HPLC)測定NLS的濃度。50mlREF.END溶液,皮濃縮至25ml，然后再次用透析過濾緩沖液補至50ml。這一程序進行了4次。用運轉(zhuǎn)制劑緩沖液(formulationbuffer)的SEC-HPLC(體積排阻色譜)來測量移除NLS后的聚集趨勢。十二烷基琉酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPage)分析使用NuPAGE4-12BisTris凝膠和MOPS作為跑膠緩沖液進行SDSPage。在200伏，跑膠時間為65分鐘。每個泳道應(yīng)用0,2-0.4^ig質(zhì)量的Mycograb。電泳后凝膠用銀染色。對于還原SDSPage，在樣品中加入100mMDDT。結(jié)果用表4所列的分析方法在下游過程的不同階段分析突變體的表達構(gòu)建體。表4.過程中間體的代碼和描述以及各自的分析測定法代碼中間體描述L分析方法舊.RES舊's重懸液(20。/。w/v)RPC1舊.SOL溶解的舊'sRPC1,RPC2REF.IM加入CuCI2之前的重折疊中間體RPC1,RPC2REF.END重折疊溶液，終點RPC1,RPC2,SEC0,5%NLS,SDSPAGE還原/非還原，肽圖，變性SEC表5給出了表4所列的用于評價突變體的分析方法的描述。包括描述具體方法特異性的注釋。表5:分析方法，用于評價突變體樣本的分析的各自反應(yīng)和測量單位(UoM)。分析方法響應(yīng)測量單位注釋RPC1蛋白總量mg/ml此測定法對于用SDS、DTT和尿素'溶解的Mycograb才羊品并不是特異的。RPCII色譜[min僅可通過色i普重疊評估此測定法。"單體峰"的移動表示重折疊SEC0.5%NLS平均分子量kDa對于含0.5%NLS的樣品，最大值的RT與MW相關(guān)。寬洗脫峰從43-900kDaSDSPage，還原單體/二聚體條帶;雜質(zhì)含量條帶非共價聚集體通過還原溶解；與非還原膠相比，可進行聚集體含量的半定量評估SDSPage，非還原單體和聚集體條帶條帶肽圖二硫鍵無信號，信號弱、強和非常強檢測肽的能力取決于測量裝置的靈敏度SEC制劑平均分子量kDa對于處于與制劑緩沖液相似的基質(zhì)中的樣品，最大值的RT與MW相關(guān)。RPCNLSNLS濃度mg/ml在以下的實施例5至12中，總結(jié)和討論了對所研究的突變體各個測定的進一步詳細資料。實施例5-溶解和重折疊后的質(zhì)量平衡-結(jié)果RPC1滴定測定用滴定分析測定溶解和重折疊之前和之后包涵體的蛋白質(zhì)濃度。由于這一分析檢測樣品中存在的所有可溶性蛋白質(zhì)，質(zhì)量平衡應(yīng)得到100%。溶解的質(zhì)量平衡用等式1計算。0/"^，'"".'舊.SOL等式l其中mgRPC1IB.SOL是包涵體溶解溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，通過RPC1方法的濃度測量和IBSOL溶液體積計算出來。mgrpC1IB.RES是20%包涵體懸浮液中的質(zhì)量，是由RPC1方法的濃度測量和DI中分離的包涵體重懸后的溶液體積計算出來的。利用等式2計算重折疊的質(zhì)量平衡，并以％回收率表示。在3.3.1和3.3.2中分別描述了用4%NLS、8M尿素+/-5mMDTT或者6M鹽酸胍+/-5mMDTT溶解的包涵體的稀釋和重折疊。。/。Ref=，^^^等式2呵,",門舊.sol其中mgrpciRef.END是根據(jù)用RP-HPLC在重折疊溶液中測量得到的濃度，乘以重折疊溶液的體積，得到的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。mgRPC1IB.SOL是包涵體溶解物(solubmsate)中的發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的質(zhì)量，％REF是重折疊后的回收率。等式1和2計算出的所有突變體在用4%NLS溶解以及隨后的重折疊之后的質(zhì)量平衡如圖3所示。原始數(shù)據(jù)可以在表6和7中找到。表6顯示了所有測試的突變體的IBRES懸浮液用NLS溶解后的回收和重折疊后的回收，由RPCI分析方法算得。還顯示了通過RPCl分析方法測定的IB-RES溶液中的蛋白質(zhì)濃度和重折疊溶液中的蛋白質(zhì)濃度。表7顯示了由RPCI測定的用尿素(SOL:尿素)和鹽酸胍(SOL:鹽酸胍)溶解后的IB—RES、IB—SOL和REF.END樣品的蛋白質(zhì)濃度。重折疊時間是4。C下96小時。IB—RES和IB—SOL的稀釋因子分別是500和50,以產(chǎn)生REF.END溶液。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>12個所研究突變體中10個的溶解質(zhì)量平衡超過100%。這可能是由于，包涵體懸浮液的是原液類樣品，且最終，取樣品的時候包涵體沒有徹底溶解，產(chǎn)生不均勻的溶液，從而低估了總的蛋白質(zhì)濃度。數(shù)據(jù)的變異性高，對6個突變體分析兩次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍從2.6%(Mycl38)到42.9%(Myc133)。重折疊后的回收率°/。在72%(Myc138)和99%(Myc134)之間。預(yù)期回收率為100%(類似溶解后回收)。重折疊后回收率均低于100%,且不及溶解后的回收率分軟。這表明，在IB.SOL和REF.end樣品中對蛋白質(zhì)濃度的估計比IB.RES樣品中的準(zhǔn)確。然而，回收率的計算主要作為溶解和重折疊試驗的對照。當(dāng)用8M尿素和6M鹽酸胍作為溶劑時，與溶解溶液IB.SOL和包涵體懸浮液IB.RES相關(guān)的重折疊產(chǎn)量如圖4所示?；厥諒?4%到230%的變化反映了蛋白質(zhì)濃度測量的問題，特別是在IB.SOL和IB.RES樣品中，可能由于取樣之前均質(zhì)不充分。盡管平均高出了1.2倍，尿素溶解后在REF，END樣品中的濃度可與鹽酸胍溶解后在REF.END樣品中的濃度相較(見表6和7)。因此稀釋是一致的。實施例6-溶解時間研究了所有的突變體用NLS溶解的時間。記錄溶液開始變清的時間和直到不再可以觀察到進一步澄清的時間，在圖5中說明。相對于使用2°/。的NLS，用尿素+ADTT和鹽酸胍+Z-DTT的溶解要快2-3倍。我們發(fā)現(xiàn)了半胱氨酸的數(shù)量和開始澄清所需的時間之間的關(guān)聯(lián)。除了突變體134(5個半胱氨酸)，有4個半胱氨酸殘基的突變體溶解速度快于有5個半胱氨酸殘基的突變體。圖6顯示了變異性圖，其中澄清開始(時間)分鐘1按3個類別作圖N末端的重鏈或輕鏈片段的排列，接頭元件數(shù)量和半胱氨酸殘基數(shù)量。除了在圖6中用1表示的Mycl34，與有5個半胱氨酸的類別中的數(shù)據(jù)點相比，有4個半胱氨酸的類別中的數(shù)據(jù)點散布在更早的溶解起始時間周圍?；貧w模型(不包括Myc134時，R2=0.72)預(yù)測，對于有4個而非5個半胱氨酸的Mycograb構(gòu)建體，溶解開始(時間)會從20分鐘減少至11.3分鐘(模型未顯示)。實施例7-RPC2-NLS重折疊MycograbREF.END樣品根據(jù)Biomeva修改以適合的方法(例4中描述)的溶解和重折疊，突變體由RPC2分析。圖7和圖8中顯示了，包括野生型(MYC123)的所有被研究的突變體REF.END樣品的重疊。早些時候在DSP-DEV1實驗室篩選突變體Myc116，并為了對比而包括在重疊中。在圖7中顯示了以實驗規(guī);f莫分離的包涵體產(chǎn)生的REF.END樣品的色譜圖，圖8中顯示了在中試工廠中以較大規(guī)模分離的包涵體產(chǎn)生的REF.END樣品的色鐠圖。于以下方面比較洗脫鐠1.保留時間峰l，反映了疏水性2.峰l形狀，反映了二聚體的存在和當(dāng)峰尖銳時單體的均一性3.單體/二聚體峰(峰1)與聚集體/雜質(zhì)峰(峰2)的面積比，反映聚集體/雜質(zhì)含量保留時間峰l，反映了疏水性表8中列出了試驗的突變體的單體/二聚體峰的保留時間表8:試驗的突變體在RPC2中峰l的保留時間f分鐘j和分子特性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>保留時間隨分子構(gòu)建體而大有不同。保留時間(反映疏水性)沒有像預(yù)期那樣有隨著接頭長度而增加的趨勢。一個連接元件由四個甘氨酸和一個絲氨酸殘基組成。與親水性的絲氨酸不同，甘氨酸是疏水的。然而，由RPC2中測量的保留時間來看，接頭中包含的多4倍的甘氨酸似乎沒有顯著增加疏水性。Myc130的保留時間比其余的突變體短。有10個M酸被性質(zhì)更親水(5個絲氨酸)的氨基酸所代替，從而減少分子的疏水性，并因此導(dǎo)致較早的保留時間。統(tǒng)計分析中去除這個數(shù)據(jù)點，產(chǎn)生的模型顯示，當(dāng)Vl定位在N-末端時相對于其定位于C-末端時，保留時間有顯著性差異。當(dāng)Vl元件定位在N-末端時相對于其定位于C-末端時保留時間增加0.41分鐘。圖9顯示了，以半胱氨酸數(shù)量、接頭長度和鏈片段定位作為因子，保留時間作為響應(yīng)的模型的標(biāo)度估計和預(yù)測分布圖。請注意，Mycl30的保留時間從才莫型中排除。圖10中顯示了保留時間對接頭長度作的圖，其表明這一構(gòu)建體的保留時間比其它突變體低，因為點突變導(dǎo)致更多的親水性質(zhì)，如上所述。峰l形狀假定沒有或者僅有很少的肩部的尖銳的峰1反映了單體的Mycograb的均一性。通過所有突變體REF.End樣品的RPC2色譜圖重疊評估峰形，并確定突變體Myc137、Myc138和Myc139的最尖峰。峰1比野生型Myc123尖銳且峰1和2幾乎基線分離。這可能表示這些構(gòu)建體表達的單體/二聚體蛋白質(zhì)比野生型更均一。單體/二聚體峰的面積比對于Myc116和MYC123野生型，與單體/二聚體相關(guān)的雜質(zhì)/聚集體含量最低，如圖7所示(Myc123野生型)。然而，3個月前另一個實驗室進行了這兩個樣品的分析，且注意到峰2隨著時間增加。與所檢測的突變體的REF.End樣品同月制備和分析了Myc123的REF.End樣品的色譜圖如圖8中所示。圖7中所示的MYC123的色譜圖與圖8中的所示的對比，得到的結(jié)論是，樣品制備和分析方法不是可準(zhǔn)確重復(fù)的。單體/二聚體峰與聚集體峰的面積比，是由將峰l歸一化至同樣的最大峰值測定。歸一化后的峰2的峰面積利用可視面積估計根據(jù)其大小升序排列。歸一化后的概況如圖11所示。可以確立以下順序Myc116、Myc139、Myc136<Myc119、Myc12、Mycl40<Mycl37、Myc135、Mycl38<Mycl06<Mycl30<Myc134<Mycl18<Mycl33在中試工廠對突變體Myc106、134、136-139的包涵體產(chǎn)生的REF.End樣品的RPC2色譜圖進行處理，并顯示比試驗臺規(guī)模分離的突變體Myc118-135的包涵體的雜質(zhì)/聚集體峰(參見圖8)低。實施例8RPC2尿素/鹽酸胍重折疊突變體Mycl18、119、130和Myc133溶解于7.6M尿素+/-DTT和5.6M鹽酸胍+ADTT并通過用重折疊緩沖液稀釋起始重折疊。并非所有REF.End樣品均在RPC2中顯示單體/二聚體峰(峰1)。假設(shè)是聚集體和雜質(zhì)的巨峰2占優(yōu)勢。圖12給出了突變體Myc119的重折疊終止樣品的典型RPHPLC色諉。該樣品的制備如實施例4所述。預(yù)計單體約在10.5分鐘洗脫。沒有鑒定較早的洗脫峰，并且使用0.5%NLS的重折疊中沒有發(fā)現(xiàn)這樣的峰。該巨峰2表示強聚集。所有尿素/鹽酸胍溶解后REF.End樣品得到類似的洗脫鐠。當(dāng)用包含20mMTris堿、0.5ML-精氨酸和2mM胱氨酸、pH9.0的緩沖液通過1:10稀釋而重折疊時，得到類似的洗脫譜。典型的色譜圖如圖13所示。該強聚集傾向被非還原條件下的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳證實，對REF.End樣品發(fā)現(xiàn)了巨大且濃的高分子量成片條帶，尿素溶解后沒有可見的單體條帶。當(dāng)還原該樣品后，該成片條帶隨后消失了，并出現(xiàn)單體Mycograb帶。在圖14中顯示了，尿素溶解后還原和非還原REF.End樣品的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。泳道4-7顯示在非還原條件下的2個不同稀釋的MYC119的REF.IM和REF.End樣品。泳道10-13顯示還原條件下的相同樣品。當(dāng)樣品被還原，且單體和二聚體條帶變得清晰可見，聚集體成片條帶消失。重折疊溶液中存在的低濃度的尿素和鹽酸胍(尿素在1:50稀釋的情況下0.14M,1:10稀釋的情況下0.72M;鹽酸胍在1:50稀釋的情況下是0.11M，1:10稀釋的情況下0.56M)不能阻止蛋白質(zhì)的聚集。如圖12所示，使用DTT似乎對聚集沒有顯著影響，因為RP-HPLC色譜圖(RPC2)在有DTT和沒有DTT時看起來類似。與REF.End樣品相反，用尿素溶解的IB.SOL樣品的RPC2色譜圖，在峰形方面與溶解于2%NLS中的IB.SOL樣品可比較。圖15顯示了HPLC色i普重疊。當(dāng)用非還原1B.SOL樣品的SDS-凝膠電泳分析，樣品用尿素溶解比IB.SOL樣品用2%NLS溶解的情況，顯示較強的HMW(高分子量)條帶。這顯示在圖14泳道3中，樣品用尿素溶解，泳道8中，樣品用2%NLS溶解。可以得出結(jié)論，RP-HPLC中的峰2沒有給出有關(guān)聚集體含量的指示，因為IB.SOL在尿素中的色語圖峰2的重疊甚至比在NLS中小。隨后的重折疊并沒有產(chǎn)生單體峰，但蛋白質(zhì)完全聚集。實施例9-還原和非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行還原和非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，以測定在REF.End樣品中的雜質(zhì)和聚集體含量。與非還原SDS聚丙烯酰胺皿電泳相比，還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，Mycograb種群以單體和二聚體的條帶出現(xiàn)，樣品中宿主細胞雜質(zhì)成分可與聚集體種群區(qū)分開。非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示Mycograb單體、二聚體和聚集體。將非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染色凝膠與還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析對比，可以半定量地評價聚集體種群數(shù)量。圖16和圖17中顯示了所有試驗的突變體的REF.END樣品的還原和非還原SDS聚丙晞酰胺凝膠電泳的凝膠。圖16中左側(cè)的M^顯示源自突變體MYC118、119、130、133、134、135、137的REF.End樣品的還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在30kDa處的條帶是單體Mycograb且它在所有樣品中是占優(yōu)勢的。根據(jù)單體條帶的遷移，在突變體MYC134中表達的Mycograb，似乎比其他在凝膠上分析的突變體具有更高的分子量。對于MYC135發(fā)現(xiàn)了相同情況，但程度較小。根據(jù)表9，MYC134在圖16所示的突變體中具有最高的理論分子量，隨后是MYC135。-在非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，聚集體種群以及二聚體都是可見的。在13泳道(MYC134)及15泳道(MYC137)中的HMW條帶比在其他泳道中的弱。這就表明了聚集體種群含量較低，然而，單體條帶更加微弱。如圖16所示，除了Myc133以外，所有突變體均可以觀察到相互比較下遷移時間和強度不同的雙條帶。鑒定這些條帶幾乎是不可能的，但假定這是具有類似天然結(jié)構(gòu)的Mycograb單體。圖17顯示了源自突變體MYC106、136、138、139、140和野生型MYC123的REF.End樣品的還原和非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。根據(jù)單體條帶的不同遷移可以確定不同構(gòu)建體的MW差異。在5和7泳道的條帶比在2、3、6和4泳道的條帶出現(xiàn)在稍低的MW，此現(xiàn)象與表9中列出的理論MW—致。上樣至凝膠的蛋白質(zhì)的質(zhì)量是不一致的；單體條帶的強度不同，因為REF.End樣品中的蛋白質(zhì)濃度的測定不夠準(zhǔn)確。因此，雜質(zhì)含量的半定量分析是不可能的。然而，Myc106的REF.end樣品中的較高的雜質(zhì)含量是明顯的，因為單體條帶的稠度與Mycl40的一個條帶可比較，但其他條帶的強度高得多。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，Myc106。rigami的REF.End樣品含有更多HCP和與產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)。然而，這并未由RPC2分析方法證實，該方法中的峰2的面積與其他突變體在相同范圍。實施例10-SEC0.5%NLS:測定REF.END樣品中Mycograb種群的分子量所有按照修改以適合的Biomeva方法(見實施例4)制備的REF.END樣品均用SEC-HPLC在0.5%NLS中分析，并測定平均分子量。在圖18和圖19中顯示了SEC色譜圖的重疊。平均分子質(zhì)量范圍在從48.6kDa到65.8kDa間。峰的寬度反映了樣品中種群的異質(zhì)性。雖然在REF.End樣品中約80%的產(chǎn)物是單體，但是還存在二聚體和更高MW的種群以及非產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)，造成寬的洗脫峰。在圖18中，與其他所研究的樣品進行比較，Mycl30的洗脫譜因為前部增加而突出。這可能是由于，構(gòu)建體的性質(zhì)(更親水)造成的樣品中增加的異質(zhì)性，或由于偶然不同的樣品處理。同時制備圖18中所示的樣品，在分析之前4'C儲存5天。同時制備圖19中所示的樣品，在分析之前4。C過夜。樣品在4'C似乎是穩(wěn)定的，因為構(gòu)建體的MW在相似的范圍內(nèi)。Myc130的前置可能是由于對比于其他研究樣品，其聚集體種群數(shù)量更多。不過，在對應(yīng)的RPC2色譜圖中的峰2并非顯著的大，但是已經(jīng)觀察到，由SEC0.5%NLS測定的增加的MW和RPC2測定的峰2大的峰面積之間，僅在有些時候相關(guān)。此外，Myc130的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳沒有指示樣品雜質(zhì)含量更高和異質(zhì)性增加。因為所有樣品是在同一天進行分析的，可以排除在SEC中其它導(dǎo)致前置的因素，如柱超栽和分析時溫度升高。Myc130在RPC2中保留時間非常早。假設(shè)在REF.End樣品中平均MW隨二聚體、聚集體和雜質(zhì)數(shù)量的增加而增加。由于不同的接頭長度和其它突變，計算出的在不同突變體中表達的單體Mycograb的MW在26至27kDa之間。表9中給出了理論MW(從氨基酸計算出的)、由SEC測定的REF.End樣品的MW、#^酸數(shù)量、接頭長度和半胱氨酸數(shù)量的列表。表9:所有測試突變體REF.End樣品的SEC-HPLC0.5%NLS結(jié)果。突變體根據(jù)其理論分子量排列。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>用理論MW對由SEC測定的MW作圖，并在排除Myc130數(shù)據(jù)點時,發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)0.77的線性關(guān)系。圖20中，突變體Myc106、Myc138和Myc135在較低的虛線的右側(cè)以點表示，具有比野生型低的平均MW。突變體Myc133、Myc136和Mycl39在較高的虛線的左側(cè)以點代表，具有比野生型高的平均MW。然而，必須考慮到測定法的差異性。此外，從圖19可以看出，對于一些樣品，注入的蛋白質(zhì)的質(zhì)量并不總是與峰面積相同。有4個半胱氨酸的突變體的共價聚集體的形成應(yīng)比有5個半胱氨酸的Mycograb少，因為有4個半胱氨酸的突變體在形成分子間的二硫鍵后，沒有可用的游離半胱氨酸。分子間的共價聚集體是在重折疊過程中形成的，甚至只有4個半胱氨酸的突變體也可形成，但其數(shù)量很可能比有5個半胱氨酸的突變體低。實施例11-SEC制劑通過UF/DF從重折疊溶液中移除NLS以測量聚集傾向為了評價Mycograb突變體的聚集傾向，利用攪拌器通過超濾/透析過濾從REF.End溶液以平均為5的因子降低NLS濃度。透析過濾時用掉的總的緩沖液體積除以存留物體積得到透析因子(diafactor)，為2.5。此試驗的原理是研究當(dāng)增溶劑NLS濃度低至不能再阻止聚集時，突變體的聚集趨勢。假定可以用SEC-HPLC制劑評估聚集體的形成。以包含0.5M尿素緩沖液、但沒有NLS的洗脫緩沖液抑制聚集。利用分子量的增加作為聚集趨勢的量度，并使突變體間可以進行比較。第一組實驗中選擇突變體Myc137、Myc106、Myc119和野生型Mycl23。表10顯示了突變體MYC119、137、106和MYC123的REF.End樣品在UFDF之前和之后，通過運轉(zhuǎn)制劑緩沖液的SEC-HPLC測定的以kDa為單位的分子量(MW),和由RP-HPLC測定的NLS(%)濃度。用UFDF前(#2)樣品中的NLS濃度除以UFDF后(#3)的NLS濃度計算NLS減少因數(shù)。由各個突變體的REF.END樣品(#1)的MW和UFDF后(#3)MW計算基于SECHPLC0.5%NLS的MW增加％。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>*分子量通過在運轉(zhuǎn)緩沖液中包含0.5%NLS的分析性SECHPLC方法測定(SECHPLC0.5%NLS)。**表9中的數(shù)據(jù)。由SECHPLC(運轉(zhuǎn)制劑緩沖液)測定的UFDF前的樣品的表觀高分子量是由于在分析中蛋白質(zhì)的聚集所造成。在UFDF之前的樣品仍然含有0.5%的NLS。當(dāng)樣品通過柱遷移時，NLS比蛋白質(zhì)遲緩得更嚴(yán)重，并因此發(fā)生聚集。因此，這種分析方法不適合測定含有NLS的樣品的分子量。為了測定在REF.End樣品中的Mycograb分子量，使用運轉(zhuǎn)緩沖液含0.5%NLS的SECHPLC。依上述聯(lián)系表10計算REF.End樣品中通過UFDF移除NLS后MW的增加。值顯示在表10的第6行。MYC123顯示MW的最小增長，而MYC119具有最強的增長，為400%?；谶@些數(shù)據(jù)，MYC123的聚集趨勢比MYC119低。但是，必須考慮到分析性SECHPLC可能對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和聚集體的形成產(chǎn)生影響。此外，MW的增加是從兩個不同的分析方法獲得的數(shù)據(jù)計算出的，且不能評估當(dāng)用兩種不同的方法測定時，樣品的MW是否相似。在表11中，突變體根據(jù)移除NLS后MW的增加和其突變進行排列。必須指出，兩個具有3x連接元件的突變體，與具有4x連接元件的突變體相比，具有顯著地較低的MW。/。增加。表11:4個所研究的突變體通過UFDF移除NLS后分子量的增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>圖21顯示了從樣品UFDF前和每一次體積重建后獲得的SECHPLC色i普圖的重疊。該洗脫峰的形狀并沒有隨NLS濃度減少而顯著地改變。因此，樣品的MW也隨NLS減少而保持不變。這可能表示表面活性劑的濃度存在一個界限，在該界限下起始聚集但沒有進一步進行。然而，分析方法對樣品MW的影響尚為未知，并可能是所有樣品具有相似的MW的原因。5次體積重建后，NLS濃度平均(n=5)下降至濃度為0.124%，相應(yīng)于2.5倍的透析體積(diavolume)。理論上，對于NLS保留R-0，計算出的剩余NLS濃度應(yīng)該是0.020%。等式3用于計算理論上的剩余NLS濃度C,=^x(e('"'W—l)等式3其中c一她,是存留物中NLS的濃度，c/^是進料溶液(feedsolution)中NLS的濃度。R是保留，即被膜保留的溶質(zhì)的分?jǐn)?shù)。VCF是體積濃度系數(shù)，N是透析體積(diavolume)，這是用過濾操作中引入的總的緩沖液體積除以存留物體積。理論的和測量的存留物中的NLS濃度之間的差異表示膜保留的NLS大于0。這可能是由于NLS和蛋白質(zhì)、膜和/或其它成分之間的相互作用。變形的能力也可能導(dǎo)致不需要的保留。實施例12-肽圖分析用肽圖分析所有突變體REF.End樣品的二硫鍵。分析前樣品被碘乙酰胺烷基化，胰蛋白酶消化，并進行液相色譜-質(zhì)謙分析(LC-MS)。用質(zhì)譜分析識別單肽紫外峰。盡可能地半定量測定具有游離巰基S-S鍵、具有正確或者不正確形成的S-S鍵、及二聚體肽。具有5個半胱氨酸的正確折疊構(gòu)建體在Cys23和Cys97之間形成二硫鍵，Cys23和Cys97各自對應(yīng)于T3和T9。T3-T9鍵位于輕鏈。另外的二硫鍵是在重鏈上在Cys159和Cys224之間，對應(yīng)于T12和T17。第五個半胱氨酸位于Cys28并對應(yīng)于T4肽。具有4個半胱氨酸的構(gòu)建體始終缺少Cys28殘基，正確的S-S橋與具有5個半胱氨酸的構(gòu)建體相似。在AL1實驗室中分析突變體118、119、130、135、133、134、137和C28Y+HIS(106)以及C28Y-HIS(108)。在分析實驗室AL2中用不同的儀器分析突變體106origami、136、138、139、140和野生型123。AL1中的質(zhì)i普儀靈敏度高于AL2中的，因此，無法獲得在AL2中分析的突變體的半定量分析。然而，可以確定是否存在正確形成的SS橋。表12中給出了所獲得的數(shù)據(jù)的概況。結(jié)果編制為3個類別游離巰基、橋連半胱氨酸和二聚體半胱氨酸。游離半胱氨酸表示沒有形成二硫鍵的巰基。橋連半胱氨酸是分子內(nèi)二硫鍵，二聚體半胱氨酸代表分子間的二硫鍵。W表示各肽檢測到弱信號，X代表給出強信號的肽。在AL2中分析的突變體用*標(biāo)記。表12:所有測試的突變體的肽圖分析<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>具有5個半胱氨酸的Mycograb的"正確地"重折疊應(yīng)為T4肽的游離巰基給出顯著的信號，并且相應(yīng)的其他游離巰基沒有信號。此外，預(yù)期正確的二硫鍵T3-T9和T12-T17有強信號，且不正確的二硫鍵不應(yīng)存在。最后，不應(yīng)該存在分子間二碌u鍵。具有4個半胱氨酸的Mycograb的"正確地"重折疊不應(yīng)該有任何游離巰基。只應(yīng)檢測到正確的S-S鍵T3-T9和T12-T17。此外，不應(yīng)該存在分子間二》克鍵。表12顯示，無論是野生型還是突變體中的任何一個，都不是僅為正確的S-S鍵提供強信號。必須考慮到REF.End樣品由很多折疊不同和共價聚集的種群組成，這樣就存在所有可能的二硫鍵和游離巰基的組合的混合物。然而，有前途的突變體應(yīng)至少對兩種正確的S-S橋連均顯示出顯著的信號，這就是MYC137和突變體C28Y+HIS和C28Y-HIS的情況。在5種情況中，只發(fā)現(xiàn)不正確的S-S鍵，而對于正確的二硫鍵則沒有獲得信號，或只有微弱的信號。MYC123、MYC138、MYC139和MYC140的信號極為微弱，且樣品的再分析沒有產(chǎn)生更高的信號。雖然發(fā)現(xiàn)了Mycograb特異性的肽，含有半胱氨酸的肽卻沒有給出信號或僅有微弱信號。這可能是由于，因為在結(jié)構(gòu)上封閉的切割位點，所以胰蛋白酶不能有效消化蛋白質(zhì)的各自部分。還要指出，具有增加的接頭長度(5和6倍，而不是3倍)的突變體更難以消化，因此不能或僅能勉強檢測后洗脫的肽的信號。有趣的是，除了一個例外，共價二硫鍵僅在兩個T9肽之間形成，對應(yīng)于Cys97殘基。相比于野生型，突變體Myc118、119、130、133、137和突變體C28Y+HIS和C28Y-HIS對正確的S-S鍵給出了更強的信號。然而，必須考慮到，是用敏感度較低的不同的質(zhì)語儀對Mycl23進行分析的，并因此不能比較信號強度。源自Mycl23肽的信號可以與源自突變體106origami、136、138、139和140的信號相比較。對于這些構(gòu)建體，沒有一個得到正確的二疏鍵。只發(fā)現(xiàn)不正確的二硫鍵信號。Myc137、MycC28Y+HIS和MycC28Y-HIS的肽圖結(jié)果最有希望，其對兩種正確的二石克鍵的均有顯著信號。突變體Mycl18、119和Mycl33還顯示出一定數(shù)量的天然樣的二硫鍵，然而T12-T17的信號微弱。突變體Myc130顯示出T12-T17二硫鍵的強信號，但是沒有發(fā)現(xiàn)第二種正確的二碌u鍵。結(jié)論分析結(jié)果的相關(guān)性重折疊后最好的回收率獲得于MYC123(野生型)和MYC134，是通過使用Poros柱(RPCl)的滴度分析而測定的。用離液劑溶解包涵體快于用NLS溶解。用尿素或NLS溶解包涵體的RPC2色鐠圖是可比較的。然而，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示出，由于聚集體成片條帶減少，NLS相比用尿素溶解的包涵體有更強的溶解力，見圖14。在離液劑溶解后通過稀釋和使用不同的添加劑，如半胱氨酸、L-精氨酸、1%的NLS和低濃度尿素/鹽酸胍進行重折疊，并沒有在RPC2中顯示出單體峰，見圖12和圖13。通過非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳證實了蛋白質(zhì)的完全聚集，且RPC2色譜圖顯示了巨峰2。當(dāng)排除了1個異常值時，SECHPLC0.5%NLS測定的MW與理論上計算出的MW相關(guān)，W為0.77。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨能力不足以檢測MW的所有細微差別，但是，在兩個突變體之間發(fā)現(xiàn)遷移時間差異，該兩個突變體的MW差異為理論MW的0.6kDa和用SECHPLC測定的14kDa(分別是MYC134和MYC118)。RPC2色鐠圖可以證實，當(dāng)10個疏7JCJ^酸被更親水的M酸代替時，突變體的疏水性下降(MYC130)。接頭元件不易影響固定相的結(jié)合位點，并因此對保留行為沒有影響。還觀察到，對比具有較短接頭的構(gòu)建體，具有增加的接頭長度的構(gòu)建體的肽圖分析對目的肽給出的信號更弱。似乎接頭元件不容易受消化酶影響。相對于其它試驗的樣品，MYC137、138和139的RPC2色譜圖顯示最尖銳的峰，其為Mycograb單體，表明樣品增強的均勻性。肽圖分析表明，對于有4個半胱氨酸的突變體，REF.End樣品中幾乎不存在游離巰基。這表明幾乎完全形成二硫鍵(不正確的和正確的)，并形成共價聚集體。對于有5個半胱氨酸的突變體，對于各種游離巰基獲得弱信號，但只有突變體MYC118、Mycll9和Mycl33在T4第五個半胱氨酸的位置有游離巰基，其在"天然"單體中應(yīng)保持為還原的。這表明，在T4肽上的巰基優(yōu)選形成二石克鍵，因為所有具5個半胱氨酸的突變體均給出了游離巰基的信號，但只在其中的3個中檢測到位于T4的游離巰基。用SECHPLC測定的MW非常依賴于樣品中的緩沖液基質(zhì)。必須建立幾個SECHPLC方法，其運轉(zhuǎn)緩沖液與樣品緩沖液相似。測定MW的基質(zhì)依賴性使得難以對比處理步驟之間的MW(表IO)。UFDF試驗表明，NLS在一定程度上保留在樣品溶液中，并且不能被有效地移除。突變體MYCC28Y+HIS、C28Y-HIS和MYC137的肽圖獲得的結(jié)果特別樂觀。結(jié)果表明，帶有HIS標(biāo)記和只有4個半胱氨酸的突變體是尤其優(yōu)選的。HIS標(biāo)記對于用高效純化步驟IMAC純化是必須的。只有4個半胱氨酸的構(gòu)建體更可能形成正確二硫鍵和更少的共價聚集體。突變體的作用突變的最有利的影響可以歸功于第5個半胱氨酸的移除。與具有5個半胱氨酸的構(gòu)建體相比，正確的二硫鍵數(shù)目增加。此外，包涵體的溶解性比具5個半胱氨酸的構(gòu)建體提高。交換重鏈和輕鏈片段的定位對RPC2中保留時間影響很小，其中相對于N-末端定位，當(dāng)Vt元件在C末端時，保留時間減少。移除NLS后肽的聚集趨勢可能隨接頭元件數(shù)增加。權(quán)利要求1.包含由氨基酸間隔物連接的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的scFv肽，其中該VH結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNO.64的序列具有至少80％序列同一性的序列，該VL結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNO.66的序列具有至少80％序列同一性的序列，其中scFv肽在VH結(jié)構(gòu)域中對應(yīng)于C28的位置上包含氨基酸取代或者缺失。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的scFv肽，其中在VH結(jié)構(gòu)域中氨基酸的取代是C28Y。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的scFv肽，其中該氨基酸間隔物包含(GGGGS、序列。4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的scFv肽，其還包含純化標(biāo)記，優(yōu)選為在C末端的6組氨酸殘基序列。5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的scFv肽，其包含選自SEQIDNO.8、10、14、18和22的氨基酸序列，其中Xaa表示除半胱氨酸以外的氨基酸殘基，其中N-末端蛋氨酸殘基可被任選地切除，優(yōu)選其中Xaa表示酪氨酸殘基。6.核酸分子，其包含編碼根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的scFv肽的序列。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸分子，還包含位于編碼scFv肽的序列的3，端的(taa)n序列，其中n為l或2。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的核酸分子，其中該分子包含選自SEQIDNO.7、9、13、17和21的序列，其中nnn表示編碼除半胱氨酸殘基以外的氨基酸的密碼子。9.根據(jù)權(quán)利要求6至8任一項所述的核酸分子，其中該分子是DNA或RNA分子。10.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽，并組合可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。11.組合制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽，和抗真菌劑或抗癌劑。12.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽，和抗真菌劑或抗癌劑。。13.治療真菌感染的患者的方法，方法包含對患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，還包含對患者施用有效量的抗真菌劑的步驟。15.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽在治療真菌感染中的用途。16.根據(jù)權(quán)利要求14或15中所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求15中所述的scFv肽，其中該真菌感染是由念珠菌、隱球菌、組織胞漿菌、曲霉菌、球擬酵母病、毛霉菌病、芽生菌病、球孢子菌病或副球孢子菌病生物引起。17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合制劑、根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物、根據(jù)權(quán)利要求13、14或16所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的scFv肽，其中該抗真菌劑是唑類抗真菌藥劑，優(yōu)選地選自〗尹曲康唑、伏立康唑、艾沙康唑、氟康唑、咪康唑、酮康唑和泊沙康唑。18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合制劑、根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物、根據(jù)權(quán)利要求13、14或16所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求14或16所述的scFv肽，其中該抗真菌劑選自多烯抗真菌劑和棘^l白素抗真菌劑。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合制劑、組合物、方法或scFv肽，其中該多烯抗真菌劑包含兩性霉素B或其衍生物。20.治療癌癥患者的方法，包含對有需要的患者施用有效量的才艮據(jù)權(quán)利要求1至54壬一項所述的scFv肽。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，還包含對患者施用有效量的至少一種另外的抗癌劑的步驟。22.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽在癌癥治療中的用途。23.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合制劑、根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物、根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求22所述的scFv肽，其中該抗癌劑選自阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、赫賽汀、多西紫杉醇、順鉑、伊馬替尼、紫杉醇、多西紫杉醇、羥基脲、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康、阿糖胞苷和雷替曲塞。24.治療患有涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病的患者的方法，包含對患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽。25.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽在涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病的治療中的用途。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求25所述的scFv肽，其中該涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病選自敗血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)和自身免疫性疾病。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法或scFv肽，其中該自身免疫性疾病選自克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。28，栽體分子，其包含根據(jù)權(quán)利要求6至9任一項所述的核苷酸序列。29,宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求28所述的載體分子。30.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的scFv肽的方法，其包含培養(yǎng)已在其中并入表達載體的宿主細胞，所述表達栽體包含受適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控元件的控制的、根據(jù)權(quán)利要求6至9任一項所述的核酸分子，在足以表達宿主細胞中所述肽的條件下進行培養(yǎng)，從而引起所述肽的生產(chǎn)，并回收由所述細胞生產(chǎn)的肽。全文摘要本發(fā)明公開了包含由氨基酸間隔物連接的V_H結(jié)構(gòu)域和V_L結(jié)構(gòu)域的scFv肽。該V_H結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNO.64的序列具有至少80％序列同一性的序列。該V_L結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNO.66的序列具有至少80％序列同一性的序列。該scFv肽還在V_H結(jié)構(gòu)域中對應(yīng)于C₂₈的位置上包含氨基酸取代或者缺失。文檔編號C12N15/10GK101679517SQ200880013913公開日2010年3月24日申請日期2008年4月24日優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日發(fā)明者J·伯尼,P·韋克納申請人:諾瓦提斯公司