專利名稱：具有改善的感官特性和物理特性的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有改善的感官特性和物理特性的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物、用于制備 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的方法、以及包括蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的食物產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
在美國(guó)和世界范圍內(nèi)，肥胖癥及肥胖癥相關(guān)疾病的發(fā)病率處于上升狀態(tài)。雖然肥 胖癥并非由單獨(dú)某個(gè)潛在因素誘發(fā)，一種致病因素可能是許多人的快節(jié)奏的、匆忙的生活 方式以及同時(shí)增加的快速食品消費(fèi)。大多數(shù)快速食品趨于為高脂肪和/或高糖的。因此， 需要一種能夠在忙碌時(shí)食用或飲用的有營(yíng)養(yǎng)的方便的食物產(chǎn)品。該食物產(chǎn)品應(yīng)該不但美味 而且營(yíng)養(yǎng)合理；即，該食物應(yīng)該低脂肪、高蛋白、高維生素和高抗氧化劑。一種營(yíng)養(yǎng)合理且易于食用的食物產(chǎn)品類型是含液體蛋白的飲料。蛋白可來(lái)源于大 豆或多種其他蛋白源。雖然大豆是一種優(yōu)異的蛋白來(lái)源，但是其趨于具有“青草味”或“豆 腥味”，一些人討厭這種味道或者認(rèn)為其不可口。因此需要一種減少了 “大豆”風(fēng)味的大豆 分離蛋白。此外，要被加入到液體飲料中的理想大豆分離蛋白產(chǎn)品應(yīng)該是基本上可溶解的， 并且有時(shí)是基本上半透明的。此外，大豆分離蛋白產(chǎn)品在所需液體飲料的PH條件下應(yīng)該是 穩(wěn)定的。發(fā)明概述因此本發(fā)明的許多方面是供應(yīng)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物包 含多肽片段的混合物，該多肽片段在每個(gè)羧基末端主要具有精氨酸殘基或賴氨酸殘基。此 外，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物具有至少約0. 2% DH的水解度，并且在PH大于約6. 0時(shí)具有至 少約80%的可溶性固體指數(shù)(SSI)。本發(fā)明的另一方面提供了用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的方法。該方法包括使 蛋白材料與肽鏈內(nèi)切酶接觸，該肽鏈內(nèi)切酶特異性地在精氨酸殘基或賴氨酸殘基的羧基末 端一側(cè)裂解蛋白材料的肽鍵以制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物具有至 少約0. 2% DH的水解度，并且在PH大于約6. 0時(shí)具有至少約80%的可溶性固體指數(shù)。本發(fā)明的另一方面還包括包含可食用材料和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的食物產(chǎn)品。 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物包含多肽片段的混合物，該多肽片段在每個(gè)羧基末端主要具有精氨 酸殘基或賴氨酸殘基。此外，所述組合物具有至少約0. 2% DH的水解度，并且在pH大于約 6. 0時(shí)具有至少約80%的可溶性固體指數(shù)。本發(fā)明的其它方面和特征更詳細(xì)地描述如下。彩餼圖的參考該專利申請(qǐng)包含至少一張用彩色制成的像片。具有彩色像片的該專利申請(qǐng)公布的
5復(fù)印件在提出請(qǐng)求并支付必要費(fèi)用后可由專利局提供。附圖描述

圖1示出了通過(guò)鐮孢屬胰蛋白酶樣肽鏈內(nèi)切酶(TLl)水解的大豆分離蛋白。顯示 的是考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的圖像。泳道3(L3)包含未水解的大豆分離 蛋白(SUPRO 500E)o泳道4(L4)、泳道5(L5)、泳道6(L6)、泳道7(L7)和泳道8(L8)分 別包含具有 0. 3% DH,2. 2% DH.3. 1% DH、4. 0% DH 和 5. 0% DH 的水解度(DH)的 TLl 水解 產(chǎn)物。泳道9(L9)包含蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品，在凝膠右側(cè)，大小用千道爾頓(kDa)指示。圖2給出了含5. 0%固體的TLl水解產(chǎn)物和ALCALASE 水解產(chǎn)物的診斷評(píng)分， 該評(píng)分由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的評(píng)估員進(jìn)行評(píng)估。在每個(gè)圖下方給出了每個(gè)水解產(chǎn)物的特性和水解度 (% DH)。正評(píng)分指示水解產(chǎn)物具有比對(duì)照樣本更多的感官特性，而負(fù)評(píng)分指示水解產(chǎn)物具 有比對(duì)照樣本更少的感官特性。對(duì)照樣本為未水解的大豆分離蛋白。(A)給出了水解度小 于約2. 5% DH的TLl和ALCALASE (ALC)水解產(chǎn)物的評(píng)分。(B)給出了水解度大于 3% DH的TLl和ALCALASE (ALC)水解產(chǎn)物的評(píng)分。圖3比較ALCALASE 和TLl水解產(chǎn)物的溶解度。在每個(gè)管下均給出了每管的 酶和水解度(％ DH)。㈧給出了ALCALASE (ALC)和TLl水解產(chǎn)物(2. 5%固體)在PH 7. 0、4°C條件下貯存兩周的管。(B)給出了 TLl和ALCALASE (ALC)水解產(chǎn)物(2. 5% 固體)在PH 8.2、4°C條件下貯存三周的管。圖4是TLl和ALCALASE 水解產(chǎn)物的溶解度曲線圖。將每個(gè)水解產(chǎn)物(2. 5 % 固體)的可溶性固體百分比(即，可溶性固體指數(shù))對(duì)應(yīng)于PH的函數(shù)繪圖。在每個(gè)圖下 方給出了每個(gè)水解產(chǎn)物的特性和水解度(％ DH)。(A)給出了 TLl水解產(chǎn)物的溶解度曲線。 ⑶給出了ALCALASE (ALC)水解產(chǎn)物的溶解度曲線。(C)給出了經(jīng)選擇的TLl和 ALCALASE (ALC)水解產(chǎn)物的溶解度的直接比較。圖5示出了中試規(guī)模的大豆蛋白材料TLl水解結(jié)果。顯示的是考馬斯亮藍(lán)染色 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的圖像，TLl水解產(chǎn)物和對(duì)照樣本溶解在其中。泳道I(Ll)和泳道 3 (L3)包含未水解的大豆蛋白；泳道2 (L2)包含2. 7% DH的TLl水解產(chǎn)物；泳道4 (L4)包含 水解的對(duì)照樣本(用酶混合物將SUPRO XT 219水解至2. 8% DH)；泳道5_11 (L5-L11) 分別包含具有 1. 3% DH,2. 0% DH,3. 8% DH、0. 3% DH,0. 9% DHU. 6% DH和 5. 2% DH 的 TLl 水解產(chǎn)物。泳道12(L12)包含分子量標(biāo)準(zhǔn)品，在凝膠右側(cè)，大小用千道爾頓(kDa)指示。圖6是中試TLl水解產(chǎn)物和對(duì)照樣本的溶解度曲線圖。在圖下方給出了每個(gè)水解 產(chǎn)物的水解度(％ DH)。圖7是中試TLl水解產(chǎn)物和對(duì)照樣本的粘度曲線圖。在圖下方給出了每個(gè)水解產(chǎn) 物的水解度(％ DH)。圖8是粘度和溶解度[即，可溶性固體指數(shù)(SSI)和可溶性氮指數(shù)(NSI)]對(duì)應(yīng)于 中試TLl水解產(chǎn)物的水解度的函數(shù)的曲線圖。圖9示出了 TLl水解產(chǎn)物中的揮發(fā)性調(diào)味劑的含量低于對(duì)照樣本。(A)示出了在 對(duì)照樣本和具有不同水解度(％DH)的TLl水解產(chǎn)物中的總揮發(fā)活性物質(zhì)和已醛的含量。 (B)示出了在對(duì)照樣本和具有不同水解度(％DH)的TLl水解產(chǎn)物中的指示揮發(fā)性調(diào)味劑
的含量。
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圖10是中試TLl水解產(chǎn)物和對(duì)照樣本的診斷評(píng)分的曲線圖。對(duì)照樣本是未水解的 大豆分離蛋白。正評(píng)分指示水解產(chǎn)物具有比對(duì)照樣本更多的感官特性，而負(fù)評(píng)分指示水解 產(chǎn)物具有比對(duì)照樣本更少的感官特性。(A)給出了對(duì)照樣本、0. 3% DH和1. 6% DH樣本的 評(píng)分。⑶給出了對(duì)照樣本、1.3% DH和5. 2% DH樣本的評(píng)分。(C)給出了對(duì)照樣本、2. 7% DH和0. 9% DH樣本的評(píng)分。(D)給出了對(duì)照樣本、2. 0% DH和3. 8% DH樣本的評(píng)分。圖11是TLl水解產(chǎn)物的感官評(píng)分對(duì)應(yīng)于水解度(DH)的函數(shù)的總曲線圖。上圖是 總體嗜好評(píng)分，下圖是苦味評(píng)分。菱形圖標(biāo)代表預(yù)測(cè)的評(píng)分，正方形圖標(biāo)代表實(shí)際的評(píng)分。圖12示出了用幾種不同的胰蛋白酶樣蛋白酶水解大豆分離蛋白的結(jié)果。給出了 考馬斯亮藍(lán)染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠的圖像，其中溶解了未水解的大豆蛋白和酶處理的 大豆蛋白樣本。在凝膠左側(cè)的泳道1包含指示大小的分子量標(biāo)記。泳道3和泳道9包含未 處理的大豆分離蛋白。泳道2和泳道4-8分別包含用TL1、SP3、TL5、TL6、豬胰蛋白酶和牛 胰蛋白酶處理的大豆。圖13示出了大豆和乳品蛋白組合的TLl水解產(chǎn)物的溶解度對(duì)應(yīng)于pH的函數(shù)。圖14示出了其它植物蛋白材料的TLl水解結(jié)果。給出了考馬斯亮藍(lán)染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的圖像，其中溶解了未處理的和處理的蛋白樣本。泳道I(Ll)包含分 子量標(biāo)記(在凝膠左側(cè)，用kDa指示)。泳道2 (L2)、泳道4 (L4)和泳道6 (L6)分別包含未 水解的玉米胚芽、低芥酸菜籽和麥芽精樣本。泳道3 (L3)、泳道5 (L5)和泳道7 (L7)分別包 含玉米胚芽、低芥酸菜籽和麥芽精的TLl水解產(chǎn)物。圖15是豆奶型飲料的平均嗜好評(píng)分。嗜好程度是1 =極其不喜歡；5 =—般；9 =極其喜歡。在同一列中、后面有一個(gè)不同字母的均值在95%置信度下具有顯著差異。圖16是組合型飲料的平均嗜好評(píng)分。嗜好程度是1 =極其不喜歡；5 =—般；9 =極其喜歡。在同一列中、后面有一個(gè)不同字母的均值在95%置信度下具有顯著差異。發(fā)明詳述本發(fā)明提供蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物、用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的方法、以 及包括蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的食物產(chǎn)品。如實(shí)例中所示，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用在精氨酸殘基或賴 氨酸殘基羧基末端一側(cè)特異性裂解蛋白材料的肽鏈內(nèi)切酶消化蛋白材料時(shí)，會(huì)導(dǎo)致包含多 肽片段的組合物具有改善的物理特性、風(fēng)味和感官特性。因?yàn)楦纳频奈锢硖匦?、風(fēng)味和感官 特性，可在多種食物產(chǎn)品中有利地利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物。(I)用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于制備包括多肽片段混合物的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方 法，所述多肽片段在每個(gè)羧基末端主要具有精氨酸殘基或賴氨酸殘基。該方法包括使蛋白 材料與肽鏈內(nèi)切酶接觸，該肽鏈內(nèi)切酶特異性地在精氨酸殘基或賴氨酸殘基的羧基末端一 側(cè)裂解蛋白材料的肽鍵以制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的蛋白材料或蛋 白材料的組合可以并且將會(huì)不同。合適的蛋白材料的實(shí)例詳述如下。(a)大豆蛋白材料在一些實(shí)施方案中，蛋白材料可以是大豆蛋白材料?？稍诒景l(fā)明的方法中使用多 種大豆蛋白材料以生成蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。一般來(lái)講，大豆蛋白材料可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方 法源自于全大豆。全大豆可以是標(biāo)準(zhǔn)大豆(即，非轉(zhuǎn)基因大豆)、轉(zhuǎn)基因大豆(如具有經(jīng)修 飾的脂肪的大豆、具有經(jīng)修飾的碳水化合物的大豆、具有經(jīng)修飾的蛋白的大豆，等等)或它們的組合。大豆蛋白材料的合適的實(shí)例包括大豆提取物、豆奶、豆奶粉、豆腐、大豆粉、大豆 分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、以及它們的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法中使用的大豆蛋白材料可以是大豆分離蛋白(也稱為 分離大豆蛋白或ISP)。一般來(lái)講，大豆分離蛋白基于不含水分具有至少約90%大豆蛋白 的蛋白含量。大豆分離蛋白可包括完整的大豆蛋白或部分水解的大豆蛋白。大豆分離蛋 白可具有高含量的貯藏蛋白亞基如7S、11S、2S等。本發(fā)明中可用作原料的大豆分離蛋白 的非限制性實(shí)例是可商購(gòu)獲得的，例如得自Solae，LLC (St. Louis, MO)和在包括SUPRO 500E、SUPRO EX 45、SUPRX) 620、SUPIl〇 670、SUPRO EX 33、SUPRO PLUS 2600F,SUPRO PLUS 2640 DS,SUPRO PLUS 2800、SUPRO PLUS 3000 的商品之中、 以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白材料可以是大豆?jié)饪s蛋白，它具有基于不含水分 約65%至小于約90%的蛋白含量。本發(fā)明中使用的合適大豆?jié)饪s蛋白的實(shí)例包括PR0C0N 產(chǎn)品系列、ALPHA 12和ALPHA 5800，所有這些產(chǎn)品可從Solae，LLC商購(gòu)獲得。作為另外 一種選擇，大豆?jié)饪s蛋白可與大豆分離蛋白共混以作為大豆蛋白材料的來(lái)源取代部分的大 豆分離蛋白。通常，如果大豆?jié)饪s蛋白取代部分大豆分離蛋白，大豆?jié)饪s蛋白取代按重量計(jì) 最多約40%的大豆分離蛋白，更優(yōu)選地取代按重量計(jì)最多約30%的大豆分離蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白材料可以是大豆粉，它具有基于不含水分約49% 至約65%的蛋白含量。大豆粉可以是脫脂大豆粉、部分脫脂大豆粉、或全脂大豆粉。大豆粉 可以與大豆分離蛋白或大豆?jié)饪s蛋白共混。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白材料可以是基于離心機(jī)中的沉淀已被分成四種主 要貯藏蛋白片段或亞基(15S、11S、7S和2S)的材料。一般來(lái)講，IlS片段高度富集了大豆球 蛋白，而7S片段高度富集了 β-大豆伴球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白材料可以 是來(lái)自高油酸大豆的蛋白。(b)其它蛋白材料在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白材料可來(lái)自非大豆的植物。作為非限制性實(shí)例，合適的 植物包括莧屬植物、竹芋、大麥、蕎麥、低芥酸菜籽、木薯、桃豆(鷹嘴豆)、豆類、兵豆、羽扇 豆、玉米、小米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、裸麥、高粱、向日葵、木薯、黑小麥、小麥、以及它們 的混合物。尤其優(yōu)選植物蛋白包括大麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大 米、小麥、以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物蛋白材料可以是低芥酸菜籽粗粉、低芥 酸菜籽分離蛋白、低芥酸菜籽濃縮蛋白、以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物蛋白 材料可以是玉米或谷物蛋白粉、玉米或谷物濃縮蛋白、玉米或谷物分離蛋白、玉米或谷物胚 芽、玉米或谷物谷蛋白、玉米或谷物谷蛋白粗粉、玉米或谷物面粉、玉米蛋白、以及它們的組 合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物蛋白材料可以是大麥粉、大麥濃縮蛋白、大麥分離蛋白、大麥 粗粉、大麥面粉、以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物蛋白材料可以是羽扇豆粉、羽 扇豆分離蛋白、羽扇豆?jié)饪s蛋白、以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物蛋白材料可 以是燕麥片、燕麥粉、燕麥蛋白粉、燕麥分離蛋白、燕麥濃縮蛋白、以及它們的組合。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，植物蛋白材料可以是豌豆粉、豌豆分離蛋白、豌豆?jié)饪s蛋白、以及它們的組 合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物蛋白材料可以是馬鈴薯蛋白粉、馬鈴薯分離蛋白、馬鈴薯濃 縮蛋白、馬鈴薯粉、以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物蛋白材料可以是米粉、大米
8粗粉、大米蛋白粉、大米分離蛋白、大米濃縮蛋白、以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 植物蛋白材料可以是小麥蛋白粉、小麥谷朊粉、麥芽精、面粉、小麥分離蛋白、小麥濃縮蛋 白、可溶性小麥蛋白、以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白材料可來(lái)源于動(dòng)物。在一 個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物蛋白材料可來(lái)源于蛋類。合適的蛋類蛋白的非限制性實(shí)例包括蛋粉、干 燥蛋固體、干燥蛋清蛋白、液體蛋清蛋白、蛋清蛋白粉、分離卵清蛋白、以及它們的組合。蛋 類蛋白可來(lái)源于雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鵪鶉蛋、或其他鳥(niǎo)類的蛋。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白材 料可來(lái)源于乳品。合適的乳蛋白包括脫脂奶粉、分離乳蛋白、濃縮乳蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白 酸鹽(例如酪蛋白酸鈉、酪蛋白酸鈣等)、乳清分離蛋白、乳清濃縮蛋白、以及它們的組合。 乳蛋白材料可以來(lái)源于母牛、山羊、綿羊、驢子、駱駝、羊駝、牦牛、水牛等。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，蛋白可來(lái)源于陸棲動(dòng)物或水棲動(dòng)物的肌肉、器官、結(jié)締組織、或骨骼。例如動(dòng)物蛋白可 以是明膠，它通過(guò)部分水解膠原制備，膠原提取自?；蚱渌鼊?dòng)物的骨、結(jié)締組織、器官等等。在本發(fā)明的方法中也設(shè)想使用大豆蛋白材料和至少一種其它蛋白材料的組合。 即，可由大豆蛋白材料和至少一種其它蛋白材料的組合制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物。在一 個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可以由大豆蛋白材料和一種其它蛋白材料的組合制 備，其它蛋白材料選自大麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng) 物材料、乳品和蛋類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可以由大豆蛋白材料和 兩種其它蛋白材料的組合制備，其它蛋白材料選自大麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、 豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物材料、乳品和蛋類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組 合物可以由大豆蛋白材料和三種或更多種其它蛋白材料的組合制備，其它蛋白材料選自大 麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物材料、乳品和蛋類。所用的大豆蛋白材料和其它蛋白材料的濃度可能并且將會(huì)不同。組合中使用的大 豆蛋白材料的量可以在約至約99%總蛋白的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合中使用 的大豆蛋白材料的量可以在約至約20%總蛋白的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合 中使用的大豆蛋白材料的量可以在約20%至約40%總蛋白的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，組合中使用的大豆蛋白材料的量可以在約40%至約80%總蛋白的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，組合中使用的大豆蛋白材料的量可以在約80%至約99%總蛋白的范圍內(nèi)。同樣 的，組合中使用的其它蛋白材料(至少一種)的量可以在約至約99%總蛋白的范圍內(nèi)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，組合中使用的其它蛋白材料的量可以在約至約20%總蛋白的范圍 內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合中使用的其它蛋白材料的量可以在約20%至約40%總蛋白 的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合中使用的其它蛋白材料的量可以在約40%至約80% 總蛋白的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合中使用的其它蛋白材料的量可以在約80%至 約99%總蛋白的范圍內(nèi)。(c)蛋白漿液在本發(fā)明的方法中，通常將蛋白材料混合或分散在水中以形成按重量計(jì)包括約 至約20%蛋白(基于“按原樣”)的漿液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿液可包括按重量計(jì)
約至約5%的蛋白(按原樣)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿液可包括按重量計(jì)約6% 至約10%的蛋白(按原樣)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿液可包括按重量計(jì)約11%至約 15%的蛋白(按原樣)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿液可包括按重量計(jì)約16%至約20% 的蛋白(按原樣)。
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在將蛋白材料分散到水中后，可將蛋白材料的漿液加熱到約70°C至約90°C約2分 鐘至約20分鐘以失活推定的內(nèi)源蛋白酶抑制劑。通常，對(duì)蛋白漿液的pH和溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)以 優(yōu)化水解反應(yīng)，特別是確保水解反應(yīng)中使用的肽鏈內(nèi)切酶的功能接近其最佳活性水平。蛋 白漿液的PH可根據(jù)本領(lǐng)域一般已知的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)及監(jiān)控?？蓪⒌鞍诐{液的pH調(diào)節(jié)至并 保持在約PH 5.0至約PH 10.0。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將蛋白漿液的pH調(diào)節(jié)至并保持在約 PH 7.0至約PH 8.0。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將蛋白漿液的pH調(diào)節(jié)至并保持在約PH 8.0 至約PH 9.0。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將蛋白漿液的pH調(diào)節(jié)至并保持在約PH 8.0。根 據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，在水解反應(yīng)期間可將蛋白漿液的溫度優(yōu)選地調(diào)節(jié)至并保持在約40°C 至約70°C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在水解反應(yīng)期間可將蛋白漿液的溫度優(yōu)選地調(diào)節(jié)至 并保持在約50°C至約60°C。一般來(lái)講，高于此范圍的溫度可最終失活肽鏈內(nèi)切酶，然而低 于或高于此范圍的溫度趨于減緩肽鏈內(nèi)切酶的活性。(d)肽鏈內(nèi)切酶水解反應(yīng)一般由將肽鏈內(nèi)切酶加入到蛋白材料漿液中引發(fā)。幾種肽鏈內(nèi)切酶在本 發(fā)明的方法中適用。優(yōu)選地，肽鏈內(nèi)切酶將是食品級(jí)酶。肽鏈內(nèi)切酶在如下的水解條件下 可具有最佳活性約PH 6. 0至約PH11. 0,更優(yōu)選約PH 7. 0至約pH 9. 0，溫度約40°C至約 700C，更優(yōu)選約45°C至約60°C。一般來(lái)講，肽鏈內(nèi)切酶將是Sl絲氨酸蛋白酶家族(MER0PSP印tidase Database, 版本8. OOA ；//merops. sanger. ac. uk)的一員。優(yōu)選地，肽鏈內(nèi)切酶將在精氨酸、賴氨酸或 兩種殘基的羧基末端一側(cè)裂解肽鍵。因此，肽鏈內(nèi)切酶可以是胰蛋白酶樣肽鏈內(nèi)切酶，它在 精氨酸、賴氨酸或兩種殘基的羧基末端一側(cè)裂解肽鍵?？蓪⒈景l(fā)明上下文中的胰蛋白酶樣 肽鏈內(nèi)切酶定義為具有大于100 (參見(jiàn)實(shí)施例16)的胰蛋白酶比率的肽鏈內(nèi)切酶。胰蛋白 酶樣肽鏈內(nèi)切酶可以是賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，它在賴氨酸殘基的羧基末端一側(cè)裂解肽鍵。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可以是微生物來(lái)源的，更優(yōu)選真菌來(lái)源的肽鏈內(nèi)切酶。雖然 胰蛋白酶和胰蛋白酶樣肽鏈內(nèi)切酶得自其他來(lái)源(例如動(dòng)物來(lái)源)，動(dòng)物來(lái)源的胰蛋白酶 可能不能裂解蛋白原材料，如實(shí)施例14所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可以是來(lái)自尖孢鐮孢(美國(guó)專利5，288，627 ；美國(guó) 專利5，693，520，每個(gè)專利均據(jù)此全文以引用方式并入)的胰蛋白酶樣蛋白酶。該肽鏈內(nèi) 切酶被稱作“TL1”并且在表A中給出了其蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0:1)。TLl的保藏編號(hào)是 SffISSPROT No. P35049，其MEROPS ID是S01. 103。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可以 是來(lái)自茄病鐮孢(國(guó)際專利申請(qǐng)W02005/040372-A1，它全文并入本文中)胰蛋白酶樣蛋白 酶。該肽鏈內(nèi)切酶被稱作“TL5”并且在表A中給出了其蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO :2)。TL5的 保藏編號(hào)是GENESEQP :ADZ80577。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可以是來(lái)自Fusarium cf. solani的胰蛋白酶樣蛋白酶。該肽鏈內(nèi)切酶被稱作“TL6”并且在表A中給出了其蛋白 質(zhì)序列(SEQ ID NO :3)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可以是來(lái)自水解無(wú)色桿菌的賴氨 酰肽鏈內(nèi)切酶。該肽鏈內(nèi)切酶被稱作“SP3”并且在表A中給出了其蛋白質(zhì)序列(SEQ IDNO 4)。SP3 的保藏編號(hào)是 SWISSPR0T No. 15636，SP3 的 MEROPS ID 是 S01. 280。在一個(gè)示例性 實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可以是TL1。表A 示例性胰蛋白酶樣蛋白酶。
10 在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可包括與SEQ ID NO :1、2、3、4或它們的片段至 少80 %，81 %，82 %，83 %，84 %，或85 %相同的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi) 切酶可包括與SEQ ID NO :1、2、3、4或它們的片段至少86%，87%，88%，89%，90%，91%， 或92%相同的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可包括與SEQ IDN0:1、2、3、 4或它們的片段至少93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %或99 %相同的氨基酸序列。這些 具有蛋白酶活性的序列中的任何一個(gè)序列的片段可以是活性酶的氨基酸序列，例如在加工 后，例如在任何信號(hào)肽和/或肽原已經(jīng)被裂解后。優(yōu)選的片段包括SEQ ID NO :1的氨基酸 25-248,SEQ ID NO 2 的氨基酸 26-25USEQ ID NO 3 的氨基酸 18-250、或 SEQ ID NO 4 的 氨基酸21-653。對(duì)于本發(fā)明而言，可使用Needle程序測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果，該程序 來(lái)自 EMBOSS 軟件包(Rice, P.，Longden, I. and Bleasby, Α. (2000)EMBOSS :The European Molecular Biology Open SoftwareSuite0 Trends in Genetics 16, (6)pp276_277 ; http: //emboss, org)，版本2. 8. 0。Needle程序執(zhí)行全序列比對(duì)算法，該算法描述于 Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48，443-453。使用的取代矩陣是BL0SUM62，空位開(kāi)放罰分是10，空位延伸罰分是0. 5。一般來(lái)講，通過(guò)在比較窗口上比較兩 個(gè)最佳比對(duì)序列來(lái)測(cè)定序列同一性百分比，其中比較窗口中的氨基酸序列部分與參比序列 (不包括添加或刪除)相比可包括添加或刪除(例如間隙)以達(dá)到最佳的兩序列比對(duì)效 果。百分比通過(guò)以下方法進(jìn)行計(jì)算測(cè)定兩序列中具有相同氨基酸以產(chǎn)生匹配位置的位置 數(shù)目，將該匹配位置的數(shù)目除以比較窗口兩序列中最短序列的位置總數(shù)，并且所得結(jié)果乘 以100來(lái)獲得序列同一性的百分比。技術(shù)人員將理解一個(gè)氨基酸殘基可被另一個(gè)具有相似側(cè)鏈、不影響多肽功能的氨 基酸殘基取代。例如，具有脂族側(cè)鏈的一組氨基酸為甘氨酸、丙氨酸他、纈氨酸、亮氨酸和異 亮氨酸；具有脂族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨 基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的一組氨基酸為苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸為半 胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代基包括纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯基丙氨 酸_酪氨酸、賴氨酸_精氨酸、丙氨酸_纈氨酸和天冬酰胺_谷氨酰胺。因此，肽鏈內(nèi)切酶 可具有相對(duì)于SEQ IDNO :1、2、3、或4的至少一個(gè)保守氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽 鏈內(nèi)切酶可具有相對(duì)于SEQ ID N0:l、2、3、或4的約50個(gè)保守氨基酸取代。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，肽鏈內(nèi)切酶可具有相對(duì)于SEQ ID N0:l、2、3、或4的約40個(gè)保守氨基酸取代。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可具有相對(duì)于SEQ ID N0:l、2、3、或4的約30個(gè)保守氨基 酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可具有相對(duì)于SEQ ID N0:l、2、3、或4的約20 個(gè)保守氨基酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可具有相對(duì)于SEQ ID N0:l、2、3、或 4的約10個(gè)保守氨基酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可具有相對(duì)于SEQ ID NO 1、2、3、或4的約5個(gè)保守氨基酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽鏈內(nèi)切酶可具有相對(duì)于SEQ ID N0:l、2、3、或4的約一個(gè)保守氨基酸取代。表B中給出了蛋白材料和肽鏈內(nèi)切酶的多種組合。表B:優(yōu)選的組合。
大豆和羽扇豆胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和羽扇豆TLl大豆和羽扇豆TL5大豆和羽扇豆TL6大豆和羽扇豆SP3大豆和玉米胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和玉米TLl大豆和玉米TL5大豆和玉米TL6大豆和玉米SP3大豆和燕麥胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和燕麥TLl大豆和燕麥TL5大豆和燕麥TL6大豆和燕麥SP3大豆和豌豆胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和豌豆TLl大豆和豌豆TL5大豆和豌豆TL6大豆和豌豆SP3大豆和馬鈴薯胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和馬鈴薯TLl大豆和馬鈴薯TL5大豆和馬鈴薯TL6大豆和馬鈴薯SP3大豆和大米胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和大米TLl大豆和大米TL5大豆和大米TL6大豆和大米SP3大豆和小麥胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和小麥TLl大豆和小麥TL5大豆和小麥TL6大豆和小麥SP3大豆和蛋胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和蛋TLl大豆和蛋TL5大豆和蛋TL6大豆和蛋SP3大豆和乳品胰蛋白酶樣蛋白酶大豆和乳品TLl大豆和乳品TL5大豆和乳品TL6大豆和乳品SP3大豆和動(dòng)物(例如明膠)胰蛋白酶樣蛋白酶
18 取決于蛋白材料的來(lái)源、所需的水解度和水解反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，加入到蛋白材料 中的肽鏈內(nèi)切酶的量能夠并且將會(huì)不同。肽鏈內(nèi)切酶的量可以在每千克蛋白材料約Img酶 蛋白至約5000mg酶蛋白的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它的量可以在每千克蛋白材料 IOmg酶蛋白至約2000mg酶蛋白的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它的量可以在每千克蛋白 材料約50mg酶蛋白至約IOOOmg酶蛋白的范圍內(nèi)。技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到水解反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間能夠并且將會(huì)不同。一般來(lái)講，水解反 應(yīng)的持續(xù)時(shí)間可以在幾分鐘至多個(gè)小時(shí)的范圍內(nèi)，例如約30分鐘至約48小時(shí)。為了終止 水解反應(yīng)，可將組合物加熱至足以失活肽鏈內(nèi)切酶的溫度。例如，把組合物加熱至大約90°C 將基本上熱失活肽鏈內(nèi)切酶。(II)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物與蛋白質(zhì)原料相比將包含不同長(zhǎng)度和分子量的多肽片段 的混合物。每個(gè)肽段通常將在其羧基末端具有精氨酸或賴氨酸殘基(如實(shí)施例3、4、13和 18所示)。多肽片段的大小在約75道爾頓(Da)至約50，OOODa的范圍內(nèi)，或者更優(yōu)選地在 約1500&至約20，00003的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，多肽片段的平均分子量可小于約 20，000Da。在其它實(shí)施方案中，多肽片段的平均分子量可小于約15，OOODa。在其它實(shí)施方 案中，多肽片段的平均分子量可小于約10，OOODa。在其它實(shí)施方案中，多肽片段的平均分子 量可小于約5000Da。取決于蛋白材料的來(lái)源、使用的肽鏈內(nèi)切酶和水解反應(yīng)的完成度，本發(fā)明蛋白質(zhì) 水解產(chǎn)物組合物的水解度能夠并且將會(huì)不同。水解度(DH)是指裂解的肽鍵對(duì)肽鍵起始數(shù) 目的百分比。例如，如果將包含五百個(gè)肽鍵的起始蛋白水解直至五十個(gè)肽鍵裂解，所得水解 產(chǎn)物的DH就是10% DH。如實(shí)例中詳述，可使用三硝基苯磺酸(TNBS)比色法或鄰苯二甲醛 (OPA)法測(cè)定水解度。水解度越高，蛋白水解程度越大。通常，因?yàn)榈鞍妆贿M(jìn)一步水解(即 DH升高)，肽段的分子量降低，相應(yīng)的肽表達(dá)譜發(fā)生改變，混合物的粘度降低。DH可以在完 整水解產(chǎn)物(即全部片段)中進(jìn)行測(cè)量或在水解產(chǎn)物的可溶解片段中(即水解產(chǎn)物在約 500-1000xg離心約5至10分鐘后的上清液片段)進(jìn)行測(cè)量。一般來(lái)講，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的水解度將為至少約0. 2% DH0在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋 白質(zhì)水解產(chǎn)物的水解度可以在約0. 2% DH至約2% DH的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋 白質(zhì)水解產(chǎn)物的水解度可以在約2% DH至約8% DH的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白
19質(zhì)水解產(chǎn)物的水解度可以在約8% DH至約14% DH的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白 質(zhì)水解產(chǎn)物的水解度可以在約14% DH至約20% DH的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白 質(zhì)水解產(chǎn)物的水解度可大于約20% DH0取決于蛋白原料的來(lái)源、使用的肽鏈內(nèi)切酶和組合物的pH，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合 物的溶解度能夠并且將會(huì)不同?？扇苄怨腆w指數(shù)(SSI)是包括蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的固 體(即多肽片段)溶解度的量度?？扇苄怨腆w的量可通過(guò)在離心(例如在約500-1000xg 離心約5至10分鐘)前后測(cè)量溶液中固體的量進(jìn)行估計(jì)。作為另外一種選擇，可溶性固體 的量可通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(如二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定比色檢測(cè)分析法)估計(jì) 離心前后組合物中蛋白質(zhì)的量進(jìn)行測(cè)定。一般來(lái)講，無(wú)論本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的水解度如何，它在pH大于約pH 6. 0時(shí)具有至少約80%的可溶性固體指數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物在 PH大于約pH 6.0時(shí)可具有約80%至約85%的可溶性固體指數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋 白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物在PH大于約pH 6. 0時(shí)可具有約85%至約90%的可溶性固體指數(shù)。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物在PH大于約pH 6.0時(shí)可具有約90%至約95% 的可溶性固體指數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物在PH大于約pH 6.0時(shí) 可具有約95%至約99%的可溶性固體指數(shù)。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的溶解度在約PH 4. 0至約pH 5. 0時(shí)對(duì)應(yīng) 于水解度的函數(shù)可能不同。例如，在約PH 4.0至約pH 5.0時(shí)，具有大于約3% DH的水解度 的大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物比那些具有小于約3% DH的水解度的大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物 組合物趨于更易溶解。一般來(lái)講，具有約1 % DH至約6% DH的水解度的大豆蛋白水解產(chǎn)物組合物在約PH 7.0至約PH 8.0時(shí)是穩(wěn)定的。穩(wěn)定性是指經(jīng)一段時(shí)間后無(wú)沉淀物形成。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組 合物可在室溫(即，23°C )下貯存或在冷卻溫度(即，4°C )下貯存。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋 白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可穩(wěn)定約一周至約四周。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合 物可穩(wěn)定約一個(gè)月至約六個(gè)月。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可穩(wěn)定超過(guò) 約六個(gè)月。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可以是干燥的。例如，可以噴霧干燥蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合 物。噴霧干燥機(jī)入口的溫度可以在約260°C (500° F)至約315°C (600° F)的范圍內(nèi)，出 口溫度可以在約82°C (180° F)至約38°C (100° F)的范圍內(nèi)。作為另外一種選擇，蛋白 質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可以被真空干燥、冷凍干燥、或使用本領(lǐng)域已知的其它程序進(jìn)行干燥。在其中的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來(lái)源于大豆蛋白的實(shí)施方案中，水解度可在約0. 2% DH 至約14% DH的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在約1 % DH至約6% DH的范圍內(nèi)。如實(shí)例所示，除形成的 多肽片段的數(shù)目之外，水解度通常還影響所得大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的其它物理特性 和感官特性。通常，當(dāng)水解度從約DH增加到約6% DH時(shí)，大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物 的透明性或半透明性增加，而谷物和大豆/豆類感官特性降低。此外，當(dāng)水解度小于約2% DH時(shí)，與水解度大于約2% DH時(shí)相比，大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物具有基本上較少的苦味 感官特性。換句話說(shuō)，更高的水解度降低了谷物和大豆/豆類感官特性，然而更低的水解度 降低了苦味感官特性。在實(shí)例中詳述了感官特性以及測(cè)定它們的方法。此外，在其中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來(lái)源于大豆的實(shí)施方案中，大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可包含選自SEQ ID NO 5-177和270-274的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白質(zhì)水 解產(chǎn)物可包括至少一種多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng)于或來(lái)源于SEQ ID NO 5-177和270-274的 氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可包括至少約十種多肽或它們的 片段，該多肽或它們的片段選自SEQ ID NO :5-177和270-274。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可包括至少約20種多肽或它們的片段，該多肽或它們的片段選自SEQ ID NO :5-177和270-274。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可包括至少約40種多肽 或它們的片段，該多肽或它們的片段選自SEQ ID NO :5-177和270-274。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可包括至少約80種多肽或它們的片段，該多肽或它們的片段選 自SEQ ID NO :5-177和270-274。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可包括至少 約120種多肽或它們的片段，該多肽或它們的片段選自SEQ ID NO :5-177和270-274。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可包括至少約1 78種多肽或它們的片段，該多肽 或它們的片段選自SEQ ID NO :5-177和270-274。在其中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來(lái)源于大豆蛋白和乳品組合的其它實(shí)施方案中，組合的大 豆/乳品蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可包含選自SEQ ID N0:5-197和270-274的多肽。在一個(gè) 實(shí)施方案中，組合的大豆/乳品水解產(chǎn)物可包括至少一種多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng)于或來(lái)源 于SEQ ID NO :5-197和270-274的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合的大豆/乳品水 解產(chǎn)物可包括至少約十種多肽或它們的片段，該多肽或它們的片段選自SEQ ID NO 5-197 和270-274。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合的大豆/乳品水解產(chǎn)物可包括至少約50種多肽或 它們的片段，該多肽或它們的片段選自SEQ ID NO :5-197和270-274。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，組合的大豆/乳品水解產(chǎn)物可包括至少約100種多肽或它們的片段，該多肽或它們的片 段選自SEQ ID NO :5-197和270-274。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆/乳品水解產(chǎn)物可包括 至少約150種多肽或它們的片段，該多肽或它們的片段選自SEQ ID NO :5-197和270-274。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合的大豆/乳品水解產(chǎn)物可包括至少約198種多肽或它們的片段， 該多肽或它們的片段選自SEQ ID NO :5-197和270-274。在其中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來(lái)源于低芥酸菜籽的其它實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組 合物可包含選自SEQ ID NO: 198-237的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，低芥酸菜籽水解產(chǎn)物可 包括至少一種多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng)于或來(lái)源于SEQ ID NO: 198-237的氨基酸序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，低芥酸菜籽水解產(chǎn)物可包括至少約十種多肽或它們的片段，該多肽或它 們的片段選自SEQ ID N0:198-237。在另一個(gè)實(shí)施方案中，低芥酸菜籽水解產(chǎn)物可包括至 少約20種多肽或它們的片段，該多肽或它們的片段選自SEQ ID N0:198-237。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，低芥酸菜籽水解產(chǎn)物可包括至少三十九種多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng)于或來(lái)源于SEQ IDNO 198-237的氨基酸序列。在其中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來(lái)源于玉米的其它實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可 包含選自SEQ ID NO :238-261的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，玉米水解產(chǎn)物可包括至少一種 多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng)于或來(lái)源于SEQ ID N0:238-261的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，玉米水解產(chǎn)物可包括至少十種多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng)于或來(lái)源于SEQ ID N0:238-261的 氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，玉米水解產(chǎn)物可包括至少24種多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng) 于或來(lái)源于SEQ ID NO =238-261的氨基酸序列。此外，在其中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來(lái)源于小麥的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可包含選自SEQ ID NO :262-269的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，小麥水解產(chǎn)物可包括至少一 種多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng)于或來(lái)源于SEQ ID N0:262-269的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，小麥水解產(chǎn)物可包括至少八種多肽，該多肽具有對(duì)應(yīng)于或來(lái)源于SEQ ID NO -.262-269 的氨基酸序列。本發(fā)明也可包括任何可從本發(fā)明的大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物、大豆/乳品蛋白 質(zhì)水解產(chǎn)物組合物、低芥酸菜籽蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物、玉米蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物或小 麥蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物純化得到的多肽或它們的片段。通常，在給定的純化樣本中純化 多肽片段構(gòu)成了按重量計(jì)至少約80%，優(yōu)選地90%，甚至更優(yōu)選地至少約95%的總多肽。 可通過(guò)色譜方法純化多肽片段，如尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、疏水性 交互作用色譜法、反相色譜法等。例如，多肽片段可選自SEQ ID N0:5-274。此外，本發(fā)明包 括序列基本上類似于那些選自SEQ ID N0:5-274的序列的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中， 多肽片段可具有與選自SEQ ID NO :5-274的多肽片段至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、 或89%的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽片段可具有與選自SEQ ID N0:5-274的 多肽片段至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%的序列同一性。上文給出了用于測(cè)定 是否多肽片段與本發(fā)明的序列具有某一百分比的序列同一性的方法。還設(shè)想本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物還可包含未水解(即完整)蛋白質(zhì)。未水 解的蛋白質(zhì)可存在于基本上完整的制備物中(例如豆腐、玉米粗粉、牛奶等。)此外，未水 解的蛋白質(zhì)可分離自植物來(lái)源的蛋白質(zhì)源(例如，蛋白質(zhì)源如莧屬植物、竹芋、大麥、蕎麥、 低芥酸菜籽、木薯、桃豆(鷹嘴豆)、豆類、兵豆、羽扇豆、玉米、小米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大 米、裸麥、高粱、向日葵、木薯、黑小麥、小麥等等)或分離自動(dòng)物蛋白材料(合適的動(dòng)物分離 蛋白的實(shí)例包括酸酪蛋白、酪蛋白酸鹽、乳清、白蛋白、明膠等)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白 質(zhì)水解產(chǎn)物組合物還包含未水解的蛋白質(zhì)，該未水解的蛋白質(zhì)選自大麥、低芥酸菜籽、羽扇 豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、大豆、小麥、動(dòng)物、乳品、蛋類、以及它們的組合。取決于 涉及的蛋白和組合物的期望用途，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和未水解的蛋白質(zhì)的相對(duì)比例能夠并且 將會(huì)不同。(III) 包括蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的食物產(chǎn)品本發(fā)明的另一方面是提供包括可食用材料和任何本文所述的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組 合物的食物產(chǎn)品。作為另外一種選擇，食物產(chǎn)品可包括可食用材料和任何本文所述的分離 多肽片段。取決于所需食物產(chǎn)品，選擇的與可食用材料組合的特定蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物能 夠并且將會(huì)不同。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可來(lái)源于大豆蛋白。在其它 實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可來(lái)源于大麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、 馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物、蛋類、以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組 合物可來(lái)源于大豆和至少一種其它蛋白來(lái)源的組合，其它蛋白來(lái)源選自大麥、低芥酸菜籽、 羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物、乳品和蛋類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋 白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物可包含不同蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水 解產(chǎn)物組合物可包含分離的或合成的多肽，該多肽選自由SEQ IDNO 5-274組成的氨基酸 序列。取決于所需食物產(chǎn)品，選擇的合適可食用材料也將會(huì)不同?？墒秤貌牧峡梢允侵参飦?lái)源的材料、動(dòng)物來(lái)源的材料、或分離自植物來(lái)源材料、動(dòng)物來(lái)源材料等的生物材料 (即，蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等)。在一個(gè)實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品可以是飲料。優(yōu)選的飲料包括即飲型(RTD)飲料或 干混型飲料(DBB)。該飲料可以是基本上渾濁的飲料或基本上清澈的飲料。合適飲料的非 限制性實(shí)例包括牛奶飲料、類牛奶飲料(例如豆奶、米奶等)、體重控制飲料、蛋白質(zhì)混合飲 料、代餐飲料、咖啡飲料、營(yíng)養(yǎng)飲料、能量飲料、嬰兒代乳品、果汁飲料、水果飲料、果味飲料、 蔬菜飲料、運(yùn)動(dòng)飲料等。飲料的PH —般將在約PH 2. 8至約PH 7. 5的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在約 PH 6. 5至約PH 7. 5的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地為約PH 7. 0。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品可以是一種壓成塊的(精)加工食品，如格蘭諾拉 巴、谷類壓成塊的(精)加工食品、營(yíng)養(yǎng)巴、或能量巴。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品可以 是基于谷類的食物產(chǎn)品?；诠阮惖氖澄锂a(chǎn)品的非限制性實(shí)例包括早餐谷類食物、意大利 面食、面包、焙烤產(chǎn)品(即，粉餅、餡餅、卷狀食品、餅干、薄脆餅干)和小吃品(例如炸土豆 片、脆餅干等)?；诠阮惖氖澄锂a(chǎn)品的可食用材料可來(lái)源于小麥(例如漂白面粉、全麥面 粉、麥芽精、麥麩等)、玉米(例如玉米面、玉米粗粉、玉米淀粉等)、燕麥(例如膨化燕麥、燕 麥片、燕麥粉等)、大米(例如膨化大米、米粉、大米淀粉)等等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食物 產(chǎn)品可以是“固體”乳品食物產(chǎn)品。合適的“固體”乳品食物產(chǎn)品的非限制性實(shí)例包括硬質(zhì) 干酪產(chǎn)品、軟質(zhì)干酪產(chǎn)品、冰淇淋產(chǎn)品、酸奶產(chǎn)品、冷凍酸奶產(chǎn)品、攪打乳品樣產(chǎn)品、果汁牛 奶凍等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品可以是一種營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑可以是液體 或固體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品可以是肉類產(chǎn)品或肉類類似物產(chǎn)品。肉類食物產(chǎn) 品的實(shí)例包括但不限于加工肉制品、碎肉制品和全肉制品。肉類材料可以是動(dòng)物肉或海產(chǎn) 品肉。肉類類似物可以是組織化植物蛋白或組織化乳品蛋白，它們的質(zhì)地模仿動(dòng)物或海產(chǎn) 品的肉。在肉類食物產(chǎn)品中肉類類似物可以是部分或全部肉類材料。取決于用于制造水解產(chǎn)物和所需食物產(chǎn)品的原料，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的水解 度也將不同。例如，對(duì)包括包含大豆的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的飲料來(lái)說(shuō)，可期望利用基 本上更易溶解的和有時(shí)顯著地更趨于半透明的大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，如具有更接近 6% DH而不是DH水解度的組合物。同樣的，在期望最小化其苦味感官特性的食物產(chǎn)品 中，可選擇具有更接近DH而不是6% DH水解度的大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物。此外，在 期望最小化其谷物和大豆/豆類感官特性感官特性的食物產(chǎn)品中，可選擇具有更接近6% DH而不是DH水解度的大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物。如上文所詳述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中食物產(chǎn)品可以是飲料。并且上文詳述了 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的合適實(shí)例。合適的可食用材料的非限制性實(shí)例包括脫脂乳、降脂 乳、2%乳、全脂乳、奶油、煉乳、酸奶、酪乳、奶粉、脫脂奶粉、乳蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白酸鹽 (例如酪蛋白酸鈉、酪蛋白酸鈣等)、乳清濃縮蛋白、乳清分離蛋白、大豆分離蛋白、大豆蛋 白質(zhì)水解產(chǎn)物、乳清水解產(chǎn)物、巧克力、可可粉、咖啡、茶、果汁、蔬菜汁等等。飲料食物產(chǎn)品 還可包括甜味劑(如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖糊精、三氯蔗糖、玉米糖漿、蜂蜜、槭樹(shù)糖漿 等)、調(diào)味劑(例如巧克力、可可、巧克力風(fēng)味劑、香草精、香草風(fēng)味劑、水果香料等)、乳化 劑或增稠劑(例如卵磷脂、角叉菜膠、纖維素膠、纖維素凝膠、淀粉、齒齦、樹(shù)脂、阿拉伯膠、 黃原膠等)；穩(wěn)定劑、脂質(zhì)材料(例如低芥酸菜籽油、向日葵油、高油酸向日葵油、脂肪粉末 等)、防腐劑(例如山梨酸鉀、山梨酸等)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、抗壞血酸鈉等)、著色劑、維生素、礦物質(zhì)、以及它們的組合。為了更好的理解本發(fā)明，下文定義了幾個(gè)術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)“水解度”是指裂解總肽鍵的百分比，它通過(guò)測(cè)定每100千克(kg)蛋白質(zhì)中 存在的NH2摩爾數(shù)進(jìn)行測(cè)量。術(shù)語(yǔ)“肽鏈內(nèi)切酶”是指在縮氨酸或多肽鏈中水解內(nèi)部肽鍵的酶。肽鏈內(nèi)切酶類 包括酶亞類EC 3. 4. 21至25 (國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟酶分類體系)?！笆称芳?jí)酶”是公認(rèn)安全(generally recognized as safe,GRAS)認(rèn)可的并且當(dāng)被 生物體如人消耗時(shí)是安全的酶。通常，酶和可從其中得到酶的產(chǎn)品可根據(jù)適用的法律法規(guī) 進(jìn)行制備。“水解產(chǎn)物”是當(dāng)化合物通過(guò)水效應(yīng)裂解時(shí)獲得的反應(yīng)產(chǎn)物。在熱降解、化學(xué)降解 或酶降解后產(chǎn)生蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。反應(yīng)期間大分子裂解成較小的蛋白、可溶性蛋白、肽段和 游離氨基酸。如那些用于描述術(shù)語(yǔ)象“谷物”、“大豆/豆類”、或“苦味”的術(shù)語(yǔ)“感官特性”，根據(jù) 如實(shí)施例6中詳述的SQS評(píng)分體系進(jìn)行測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“可溶性固體指數(shù)”是指可溶性蛋白或可溶性固體的百分比。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離大豆蛋白”或“大豆分離蛋白，，是指具有基于不含水分至 少約90%的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆分離蛋白如下形成于大豆將大豆的皮 和胚芽從子葉上去除、將子葉壓成片或碾碎并將片狀或碾碎的子葉去油、將子葉的大豆蛋 白和碳水化合物與子葉纖維分離開(kāi)、并隨后將大豆蛋白與碳水化合物分離開(kāi)。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大豆?jié)饪s蛋白，，是指具有基于不含水分約65 %至小于約90 % 的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆?jié)饪s蛋白也包含大豆子葉纖維，通常基于不含水 分按重量計(jì)約3. 5%至最多約20%的大豆子葉纖維。大豆?jié)饪s蛋白如下形成于大豆去除 大豆的皮和胚芽、將子葉壓成片或碾碎并將片狀或碾碎的子葉去油、并將大豆蛋白和大豆 子葉纖維與子葉的可溶碳水化合物分離開(kāi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大豆粉”是指脫脂的、部分脫脂的、或全脂的大豆材料的粉碎形 式，其尺寸使得顆?？赏ㄟ^(guò)100目(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn))篩網(wǎng)。利用常規(guī)的大豆研磨方法將大豆餅、 碎片、薄片、粗粉、或這些材料的混合物粉碎成大豆粉。大豆粉具有基于不含水分約49%至 約65%的大豆蛋白含量。優(yōu)選地所述大豆粉研磨的非常細(xì)，最優(yōu)選地使得小于約的大 豆粉被保留在300目(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn))篩網(wǎng)上。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大豆子葉纖維”是指包含至少約70%的飲食纖維的大豆子葉多 糖部分。大豆子葉纖維通常包含某種微量大豆蛋白，但是也可為100%纖維。如本文所用， 大豆子葉纖維不涉及或包括大豆皮纖維。一般來(lái)講，大豆子葉纖維如下形成于大豆去除大 豆的皮和胚芽、將子葉壓成片或碾碎并將片狀或碾碎的子葉去油、并將大豆子葉纖維與子 葉的大豆材料及碳水化合物分離開(kāi)。“胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶”是一種優(yōu)先在精氨酸殘基或賴氨酸殘基的羧基末端 一側(cè)裂解肽鍵的酶。當(dāng)介紹本發(fā)明或其優(yōu)選實(shí)施方案的要素時(shí)，冠詞“一個(gè)”和“所述”旨在表示有一 個(gè)或多個(gè)要素。術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”和“具有”旨在表示包容性并且表示除列出要素外還可以有其它要素。在不脫離本發(fā)明范圍的條件下，可對(duì)以上化合物、產(chǎn)品和方法進(jìn)行各種更改，這意 味著可將上文描述和下文實(shí)施例中包含的所有內(nèi)容理解為例證性的而非限定性的。實(shí)施例以下實(shí)施例示出了本發(fā)明的實(shí)施方案。實(shí)施例1 用胰蛋白酶樣肽鏈內(nèi)切酶TLl水解大豆分離蛋白將大豆分離蛋白水解成更小的肽段以試圖提高其溶解度并改進(jìn)其感官特性。真菌 胰蛋白酶樣肽鏈內(nèi)切酶TLl來(lái)自尖孢鐮孢，其序列表示為本專利申請(qǐng)的SEQ ID N0:1，選擇 該酶是因?yàn)樗呀饩彼峄蛸嚢彼釟埢腃末端一側(cè)的肽鏈，而其它肽酶已被證實(shí)裂解大 豆蛋白的任意肽鍵。大豆分離蛋白(ISP)的8%漿液通過(guò)以下方法制備將320gSUPRO 500E， Solae,St. Louis,MO)分散在3680g水中，適度混合以減少泡沫。如需要的話加入兩滴消泡 劑。將該溶液加熱到80°C 5分鐘以失活任何可能存在的絲氨酸蛋白酶抑制劑。將混合物冷 卻到50°C并用食品級(jí)K0H(50% w/w溶液)將pH調(diào)節(jié)到8. 0。在存在0、75mg、350mg、650mg、 或950mg TLl/kg大豆蛋白的情況下，將8%大豆蛋白漿液的等分試樣(SOOmL)在50°C培 養(yǎng)60分鐘。將樣本加熱到85°C并保持5分鐘以失活所述酶。用冰冷卻樣本并將其貯存于 4°C。水解度(％DH)是指被水解的特定肽鍵的百分比(即，裂解肽鍵的數(shù)目占起始蛋白 中存在的肽鍵總數(shù)的百分比)。使用三硝基苯磺酸(TNBS)方法估計(jì)％0!1。該方法是一種 用于測(cè)定食物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物水解度的精確的、可重復(fù)的和一般適用的方法。就該方法而 言，將0. Ig大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物溶解在IOOmL的0. 025N氫氧化鈉中。將水解產(chǎn)物溶液的 等分試樣(2. OmL)與8mL的0. 05M硼酸鈉緩沖液(PH 9. 5)混合。用0. 20mL 10%三硝基苯 磺酸處理兩mL經(jīng)緩沖的水解產(chǎn)物溶液，然后室溫暗處培養(yǎng)15分鐘。加入4mL 0. IM亞硫酸 鈉-0. IM磷酸鈉溶液(1 99比率)終止反應(yīng)，在420nm處讀取吸光度。使用0. ImM的甘 氨酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品。使用以下計(jì)算公式以確定甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收百分比[(甘氨酸 420nm吸光度-空白420nm吸光度)χ (100/0. 710) ]。94%或更高的值被認(rèn)為是可接受的。表1給出了每個(gè)樣本的TNBS平均值和％ DH。它顯示水解在6% DH左右時(shí)開(kāi)始保 持穩(wěn)定水平，這能反映出易于裂解的精氨酸和賴氨酸位點(diǎn)的數(shù)目。該實(shí)驗(yàn)表明用350mg/kg 的TLl消化一小時(shí)能制備足夠的水解產(chǎn)物。表1 大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的水解度
樣本tt描述TNBS 值 (每IOOkg蛋白的NH2摩爾數(shù))% DH0OTLlmg/kg24023-175TLlmg/kg513. 023-2350TLlmg/kg705. 223-3650TLlmg/kg755. 824-4950TLlmg/kg786. 1實(shí)施例2 =TLl水解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析?；旧先鐚?shí)施例1所述制備具有0. 3% DH,2. 2% DH,3. 1% DH、4. 0% DH禾口 5. 0% DH的TLl水解產(chǎn)物。使用SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)方法溶解每個(gè)水解產(chǎn)物的等分試樣和未水解的大 豆分離蛋白。該分析允許比較大豆水解產(chǎn)物中的多肽和那些起始大豆蛋白的分子大小。圖 1示出了考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)染色凝膠的圖像。未水解大豆分離蛋白包括大小約5kDa 至約IOOkDa的多肽。雖然0.3% DH水解產(chǎn)物中的多肽大小范圍與原料的大小范圍相似，但 該水解產(chǎn)物包含附加的小多肽片段。％ DH更高的水解產(chǎn)物基本上沒(méi)有大于約20至30kDa 的多肽，而是都有附加的小(< 5kDa)多肽。2. 2%DH,3. 1% DH和4. 0% DH的水解產(chǎn)物的 多肽模式相當(dāng)類似。然而5. 0% DH的水解產(chǎn)物具有比其它水解產(chǎn)物更窄的多肽大小范圍 (0. l-20kDa)。具體地講，在5.0% DH水解產(chǎn)物中不存在7S和IlS亞基條帶(參見(jiàn)圖1，泳 道8)。實(shí)施例3 =TLl水解產(chǎn)物中的肽段LC-MS分析。通過(guò)液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)鑒定實(shí)施例1制備的TLl水解產(chǎn)物中的肽段。用于 LC-MS分析的樣本通過(guò)以下方法制備在玻璃小瓶中混合包含2mg各個(gè)TLl水解產(chǎn)物的等 分試樣和0. 1 %的甲酸(ImL)，渦旋1至2分鐘。將混合物在13，OOOrpm離心5分鐘。將上 清液的等分試樣(25 μ L)注入 C18 HPLC 分析柱中(15cm χ 2. Imm id, 5 μ m ;DiscoveryBio Wide Pore, Supelco , Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)，該分析柱在HP -1100 (Hewlett Packard ；Palo Al to，CA) HPLC儀器上。表2中示出了色譜流出曲線；溶劑A是0. 1 %甲酸； 溶劑B是在乙腈中的0. 甲酸，流量為0. 19mL/min，柱溫為25°C。表2 =HPLC溶劑色譜流出曲線
時(shí)間(分鐘)溶劑)溶劑)09553555453755453910904210904495545955 用分路器體系將LC洗脫液的等分試樣(10 μ L)遞送到ESI-MS源以進(jìn)行MS分析。
26使用 Thermo FinniganTM LCQTM(Thermo Scientific, ffaltham, MA) Deca 離子阱質(zhì)譜儀分 析所述肽，該儀器配備數(shù)據(jù)依賴型MS/MS和具有動(dòng)態(tài)排除掃描功能的數(shù)據(jù)依賴型MS/MS。 ESI-MS在陽(yáng)離子模式下運(yùn)行，毛細(xì)管溫度為225°C，電噴霧針設(shè)置為電壓5. OkV，掃描范圍 為 m/z 400-2000ο MS/MS 原始數(shù)據(jù)通過(guò) Sequest 搜索引擎(BI0W0RKS software, Thermo Fisher Scientific, ffaltham, MA)用無(wú)酶搜索參數(shù)解卷積。通過(guò)搜索標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肽進(jìn) 行鑒定，如在 NationalInstitutes of Health 的 National Center for Biotechnology Information(NCBI)或來(lái)自 Swiss Institute of Bioinformatics 的 Swiss-Prot。表3中給出了所述肽。幾乎每個(gè)肽段在羧基末端都具有精氨酸或賴氨酸(三個(gè)片 段在羧基末端具有谷氨酰胺)。末端是精氨酸殘基的片段大約是末端是賴氨酸殘基的片段 的兩倍。肽段鑒定揭示了 β -大豆伴球蛋白α -亞基、β -大豆伴球蛋白β -亞基、大豆球 蛋白亞基Gl、大豆球蛋白亞基G3和大豆球蛋白Gy4的水解產(chǎn)物存在于每個(gè)TLl水解產(chǎn)物 中。在每個(gè)水解產(chǎn)物中檢測(cè)到了許多相同的肽段。5. 8%和6. DH水解產(chǎn)物還包含來(lái)自 P 24油質(zhì)蛋白異構(gòu)體A的片段。6.1% DH水解產(chǎn)物揭示了來(lái)自其它蛋白的片段的存在，即 胰蛋白酶抑制劑Kti3。表3 具有不同水解度(DH)的水解產(chǎn)物中的肽段 實(shí)施例4 通過(guò)MALDI-MS分析具有高水解度的TLl水解產(chǎn)物中的肽段還通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F/T0F-MS)分析在實(shí)施例 1中制備的6. 1 % DH的大豆水解產(chǎn)物中的肽段。如實(shí)施例3所述制備樣本并通過(guò)HPLC分析 樣本，不同的是將最后的洗脫步驟延長(zhǎng)至50分鐘并在Bio-Rad (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)組分收集器上每隔1分鐘收集組分。組分#4_48在GenevaC (Genevac, Ltd, UK)蒸發(fā)器上，在< 30°C條件下被完全蒸發(fā)。就此而言，將干燥樣本溶解在200 μ L 三氟乙酸(TFA)的50%乙腈溶液中。將 每個(gè)樣本的等分試樣(1. 5μ L)與1. 5μ L MALDI基質(zhì)溶液(6. 2mg α -氰基-4-羥基肉桂酸 ZmL 36%甲醇(ν/ν)，56%乙腈(ν/ν)，以及8%的水)混合。將樣本渦旋、離心，并將1 μ L 樣本加樣在MALDI不銹鋼靶板上。選擇十三個(gè)具有高質(zhì)量MS譜的樣本用于進(jìn)一步純化和 MS/MS分析。在PCR管中干燥每個(gè)組分并將其重懸浮在10 μ L 0. 1 %甲酸的1 %乙腈溶液中， 渦旋30秒，2000rpm離心10秒。重復(fù)渦旋和離心步驟5次。使用NuTip (10 μ L多孔石墨碳SPE槍頭)純化肽混合物。使用預(yù)濕的(0.1%甲酸的60%乙腈溶液，隨后用0.1%甲酸 平衡)槍頭從包含樣本的PCR管中提取肽。將完整的樣本溶液吸入槍頭，然后排回管中，反 復(fù)50次。然后用0.1%甲酸(10 μ L)洗滌(吸入和排出)加入樣本的槍頭五次。最后，用 IOyL 0. 甲酸的60%乙腈溶液從槍頭洗脫所述肽。使用相同的溶劑混合物(IOyL)重 復(fù)洗脫過(guò)程十次。在高速真空下干燥所有樣本洗脫液，然后將其重懸浮在1. 5μ L TFA 的50%乙腈溶液中和1. 5 μ L MALDI基質(zhì)溶液中。渦旋混合物30秒，2000rpm離心5秒，然 后加樣1 μ L在MALDI靶板上。在MALDI-T0F/T0F儀器(ΑΒΙ-4700)上進(jìn)行MS分析。該儀 器配備ND:YAG(335nm)，并且在MS和MS/MS模式下以200Hz的重復(fù)頻率運(yùn)行。用20KeV加 速度能量，在第一 TOF處記錄數(shù)據(jù)，并將單透鏡間電壓設(shè)置為6KeV。通過(guò)MASCOT搜索引擎 (MATRIX SCIENCE)，用無(wú)酶搜索參數(shù)解卷積MS/MS數(shù)據(jù)。通過(guò)搜索標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)如NCBI或 Swiss-Prot來(lái)鑒定所述肽。表4給出了 MALDI-MS鑒定的肽。在此分析中鑒定的一些相同肽段用LC-MS (ESI) 進(jìn)行鑒定。例如，β-大豆伴球蛋白的α-亞基、β-大豆伴球蛋白的β-亞基、大豆球蛋白 亞基Gl和大豆球蛋白Gy4的片段在兩種分析中都存在。MALDI-MS分析檢測(cè)到了其它多肽 的片段，如β-大豆伴球蛋白的α主亞基、大豆球蛋白亞基G2和62Κ蔗糖-結(jié)合蛋白前體 及種子成熟蛋白，LEA4。表4 :6. DH水解產(chǎn)物中的肽段-MALDI-MS 實(shí)施例5 用TLl或ALCALASE 水解大豆分離蛋白。用TLl或ALCALASE 2. 4L水解大豆分離蛋白以便能夠比較不同水解產(chǎn)物的 感官特性和功能，ALCALASE 2. 4L是得自Novozymes (Bagsvaerd，Denmark)的微生物 枯草桿菌蛋白酶。8%大豆分離蛋白的漿液通過(guò)將72gSUPRO 500E在828g自來(lái)水中適 度混合5分鐘進(jìn)行制備。加入兩滴消泡劑。用2N KOH將漿液pH調(diào)節(jié)至8. O。將漿液的等 分試樣(800g)混合加熱至50°C。加入不同量的TLl肽酶或ALCALASE (ALC)蛋白酶 以達(dá)到所需的水解度O、DH、2% DH,4% DH和6% DH0使用自動(dòng)滴定器使反應(yīng)pH常數(shù)保 持在PH 8.0。在50°C培養(yǎng)一段時(shí)間以獲得所需的水解度，然后將樣本加熱至85°C并保持5 分鐘以失活酶，隨后將溶液調(diào)節(jié)至PH 7.0。用冰冷卻樣本并將其貯存于4°C。使用TNBS方 法(如實(shí)施例1所述)測(cè)定水解度(％ DH)。表5給出了加入酶的量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)期間 滴定PH時(shí)加入的KOH體積、平均TNBS值和％ DH。表5 :TL1 和ALCALASE 水解產(chǎn)物 實(shí)施例6 =TLl和ALCALASE 水解產(chǎn)物的感官分析使用一種專有的感官檢測(cè)方法，Solae定性檢測(cè)(SQS)法，來(lái)評(píng)估實(shí)施例5中制備 的TLl和ALGALASE 水解產(chǎn)物的風(fēng)味特性。該方法基于試驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本之間的 直接比較，并且提供定性的和定向定量的差異。向一組七名經(jīng)培訓(xùn)的評(píng)估員提供每個(gè)樣本 (稀釋至5%漿液)的等分試樣和對(duì)照樣本，對(duì)照樣本是未水解的大豆分離蛋白的5%漿液。 用食品級(jí)磷酸將每個(gè)溶液的PH調(diào)節(jié)至7. O。評(píng)估規(guī)程包括渦旋樣本杯三次，保持杯底部在桌上。樣本靜置2秒鐘后，每個(gè)評(píng)估 員呷入約10mL(2茶匙)樣本，在他的/她的口中漱口 10秒鐘后吐出。評(píng)估員然后根據(jù)表 6給出的量表評(píng)估試驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本間的差異。表6:SQS評(píng)分體系 表7給出了每個(gè)樣本的平均SQS評(píng)分。TLl水解產(chǎn)物的評(píng)分一般為與對(duì)照樣本(它 是未處理的大豆分離蛋白)有中度差異。ALGALASE (ALC)水解產(chǎn)物的評(píng)分為與對(duì)照 樣本有輕微至極端差異。 表7 對(duì)TLl和ALCALASE 水解產(chǎn)物的SQS評(píng)分
如果試驗(yàn)樣本被評(píng)價(jià)為與對(duì)照樣本不同(即，SQS評(píng)分為2、3、或4)，然后還可對(duì) 試驗(yàn)樣本進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估以提供關(guān)于試驗(yàn)樣本如何不同于對(duì)照樣本的診斷信息。因此，如 果試驗(yàn)樣本具有比對(duì)照樣本輕微更多、中度更多、或極端更多的某項(xiàng)特性(參見(jiàn)表8)，那么 賦予它們的評(píng)分分別是+1、+2、+3。同樣的，如果試驗(yàn)樣本具有比對(duì)照樣本輕微更少、中度 更少、或極端更少的某項(xiàng)特性，那么賦予它們的評(píng)分分別是-1、_2、_3。該分析提供了對(duì)試 驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本之間的定向定量差異的評(píng)估。表8:SQS專門(mén)詞匯 圖2A和2B中給出了具有相似％ DH水平的水解產(chǎn)物的九種風(fēng)味特性的定向差異。 在所有的％ DH水平上，TLl水解產(chǎn)物與ALC水解產(chǎn)物相比在谷物和大豆/豆類特性方面有 較大幅度的減少，在收斂性和苦味特性方面有較小幅度的增加。％ DH最高的ALC水解產(chǎn)物 在苦味方面相對(duì)于對(duì)照物具有尤其大的增加。實(shí)施例7 =TLl和ALGALASE 水解產(chǎn)物的溶解度。
實(shí)施例5中制備的每個(gè)TLl和ALCALASE 水解產(chǎn)物的溶解度通過(guò)將水解產(chǎn)物 稀釋成2. 5%固體并在PH 7. 0、4°C條件下貯藏一周進(jìn)行估計(jì)。對(duì)樣本進(jìn)行視覺(jué)評(píng)估；圖3A 中給出了一個(gè)攝影圖象。所有TLl水解產(chǎn)物具有少量沉淀，但是5. DH的TLl水解產(chǎn)物 也具有相對(duì)于那些更低％ DH的水解產(chǎn)物更高的透明性。相反的，具有最高％ DH的ALC水 解產(chǎn)物具有顯著量的沉淀。圖3B給出了 6.1% DH TLl水解產(chǎn)物和13. 8% DH ALC水解產(chǎn) 物稀釋成2. 5%固體后在PH 8.2、4°C條件下貯藏三周的管的圖像。TLl水解產(chǎn)物無(wú)沉淀產(chǎn) 生，這指示它在PH 8. 2、4°C條件下可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，然而ALC水解產(chǎn)物有沉淀產(chǎn)生。在實(shí)施例5中制備的每個(gè)TLl和ALC水解產(chǎn)物中測(cè)試pH對(duì)溶解度的效應(yīng)。將每 個(gè)等分試樣調(diào)節(jié)至pH 2、pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、或pH 9，并且樣本在500x g 離心10分鐘。將離心前溶液中固體物質(zhì)的量與離心后溶液中固體物質(zhì)的量進(jìn)行比較以提 供可溶性固體指數(shù)(SSI)。TLl和ALC水解產(chǎn)物的％可溶性固體在圖4A和4B中分別對(duì)應(yīng) 于PH的函數(shù)給出。所有溶液在約pH 4至pH 5的pH水平上具有降低的溶解度(即，大豆 蛋白的等電點(diǎn))，并且在更低的PH值時(shí)具有稍微提高的溶解度。然而，pH值更高時(shí)，所有 TLl水解產(chǎn)物在pH水平高于pH 6. 0時(shí)具有優(yōu)異的溶解度(圖4A)，但是一些ALC水解產(chǎn)物 在PH水平更高時(shí)具有降低的溶解度(圖4B)。圖4C給出了 TLl和ALC水解產(chǎn)物的溶解度 在低和高％ DH時(shí)對(duì)應(yīng)于pH函數(shù)的直接比較。實(shí)施例8 =TLl水解產(chǎn)物的誘射比。對(duì)實(shí)施例5中制備的一些TLl水解產(chǎn)物的透射比進(jìn)行測(cè)量。為了此次測(cè)量，將 DH和5. DH的TLl水解產(chǎn)物制備成不同的固體百分比(S卩，0. 5 %、1. 0 %、1. 5 %、
2.0%和2.5%)。將每個(gè)蛋白漿液的等分試樣放置在TURBISCAN Lab Expert unit(Formulaction, 1，Union, France)中，并且記錄每秒的透射比，總計(jì)60秒。表9給出 了每個(gè)樣本的平均透射百分比。5. DH的TLl水解產(chǎn)物在0. 5%固體情況下具有37. 4% 的透射比，與之相比，1.0% DH的水解產(chǎn)物在0.5%固體情況下具有1.3%的透射比。這些 數(shù)據(jù)證實(shí)了視覺(jué)觀察的結(jié)果(參見(jiàn)圖3A)。表9 =TLl水解產(chǎn)物的透射比 實(shí)施例9 用TLl或其它肽鏈內(nèi)切酶制備的大豆水解產(chǎn)物的苦味分析?；旧先鐚?shí)施例1和5所述，大豆分離蛋白用來(lái)自水解無(wú)色桿菌(SP3 ；SEQ ID NO 4)的TLi、ALCALASE (ALC)、或賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶進(jìn)行水解。選擇酶濃度和反應(yīng)條件 以使％ DH值為約5至6% DH，水解度通過(guò)實(shí)施例1中描述的TNBS方法進(jìn)行測(cè)定。將水解 產(chǎn)物提供給一組五名評(píng)估員，使用實(shí)施例6中描述的SQS方法進(jìn)行評(píng)估，主要評(píng)估苦味。表10中給出了平均SQS評(píng)分和診斷的苦味評(píng)分。TLl和SP3水解產(chǎn)物的評(píng)分為與 對(duì)照樣本(未水解的大豆分離蛋白)有輕微差異。同樣的，TLl和SP3水解產(chǎn)物的評(píng)分為c苦味略少于對(duì)照樣本。相反的，ALC水解產(chǎn)物的評(píng)分為與對(duì)照樣本有極端差異，并且苦味比 對(duì)照樣本大得多。表10 水解產(chǎn)物的SQS分析。 實(shí)施例10 中試TLl水解產(chǎn)物的物理特性。將大豆分離蛋白TLl水解產(chǎn)物的生產(chǎn)從小試規(guī)模提高到更大的中試規(guī)模，并且分 析水解產(chǎn)物的感官特性和功能特性。就此而言，原料是大豆凝結(jié)蛋白。為了制備大豆凝結(jié)蛋 白材料，用約PH6. 5至約pHIO的水溶液連續(xù)提取大豆粕、大豆粉、或大豆粗磨物，以將大豆 粕/大豆粉/大豆粗磨物中的蛋白與不溶性材料如纖維分離開(kāi)來(lái)。將低含量的亞硫酸鹽加 入到提取介質(zhì)中，其濃度為基于大豆粕重量0.05% -0. 15%。用約pH6. 5-7.0的氫氧化鈉 水溶液對(duì)大豆粕、大豆粉、或大豆粗磨物進(jìn)行第一次提取，然后用約PH8. 5-10的溶液進(jìn)行 第二次提取。水與大豆粕/大豆粉/大豆粗磨物材料的重量比率為約8 1至約16 1。在提取后，通過(guò)過(guò)濾或離心方法將提取物從不溶性材料中分離出來(lái)。然后用合適 的酸將分離提取物的PH調(diào)節(jié)到約大豆蛋白的等電點(diǎn)(約pH 4-5，或優(yōu)選地pH 4.4-4.6)附 近以沉淀大豆凝結(jié)蛋白，以便大豆蛋白能從大豆可溶物中分離出來(lái)，大豆可溶物包括引起 腸胃脹氣的低聚糖和其它水溶性碳水化合物。合適的可食用酸包括鹽酸、硫酸、硝酸、或乙 酸。通過(guò)離心將沉淀的蛋白材料(凝結(jié)物)從提取物(乳清)中分離以制備大豆凝結(jié)蛋白 材料。用水洗滌分離的大豆凝結(jié)蛋白材料以移除殘余的可溶物，水與蛋白材料的重量比率 為約5 1至約12 1。用堿性溶液或堿土溶液如氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液將大豆凝結(jié)蛋白材料首 先中和至約PH 8.0至約PH 9.0，優(yōu)選地約PH 8. 0-8. 5。將中和后的大豆凝結(jié)蛋白加熱并冷 卻，優(yōu)選地通過(guò)噴氣加熱和閃蒸冷卻。然后用TLl酶在合適溫度下處理大豆蛋白材料足夠 的時(shí)間，以便大豆蛋白水解產(chǎn)物具有約35-55的TNBS值。將酶加入到大豆蛋白材料中，其 濃度為基于凝結(jié)蛋白0. 005% -0. 02%的酶蛋白。酶與大豆凝結(jié)蛋白材料在40°C至60°C， 優(yōu)選地在約50°C下接觸30分鐘至120分鐘，優(yōu)選地50分鐘至70分鐘以水解蛋白。通過(guò)將 水解的大豆蛋白材料加熱至足以滅活酶的溫度來(lái)終止水解。最優(yōu)選地，水解的大豆凝結(jié)蛋 白材料被如上所述噴氣加熱以滅活酶、閃蒸冷卻然后噴霧干燥。表11給出了一組典型的水解產(chǎn)物的反應(yīng)參數(shù)?；旧先鐚?shí)施例1所述，使用TNBS 方法測(cè)定水解度。表11也給出了每個(gè)樣本的TNBS值和％DH。對(duì)照樣本包括未水解的大豆 蛋白(即，SUPRO 500E)和基本可商購(gòu)獲得的大豆分離蛋白水解產(chǎn)物(即，S用酶混合 物水解至 2. 8% DH 的UPRO XT 219)。
表11 中試TLl水解產(chǎn)物。 通過(guò)SDS PAGE使用標(biāo)準(zhǔn)方法分析TLl水解產(chǎn)物和對(duì)照樣本，圖5給出了凝膠的圖 像。該分析揭示TLl裂解了所有主要大豆貯藏蛋白亞基。實(shí)施例11 中試TLl水解產(chǎn)物的溶解度和粘度。還檢查了實(shí)施例10中制備的中試TLl水解產(chǎn)物和對(duì)照樣本的溶解度?；旧先?實(shí)施例7所述，將每個(gè)樣本的等分試樣調(diào)節(jié)至PH 2、PH 3、PH 4、PH 5、PH 6、PH 7、PH 8和 PH 9并測(cè)定可溶性固體指數(shù)(SSI)。如圖6所示，所有的TLl水解產(chǎn)物樣本在pH水平為PH 6或更高時(shí)幾乎100%可溶解，然而水解的對(duì)照樣本在PH 6時(shí)只有大約40%可溶解。此外， 隨著水解度的增加，在等電點(diǎn)(即，約PH 4-5)處的溶解度也增加。幾種TLl水解產(chǎn)物和對(duì)照樣本的粘度在不同固體百分比(即，12-20%固體)條件 下進(jìn)行測(cè)定。樣本使用小型界aring (WaringLaboratory, Torrington CT)共混機(jī)，在總
漿液含量為70克的條件下進(jìn)行分散。樣本共混總計(jì)四分鐘，使用最小剪切力以減少泡沫。 然后用布氏粘度計(jì)，使用小量樣本承接器和錠子18在室溫下分析樣本。一式兩份的制備和 分析每個(gè)樣本。圖7是不同制備的粘度曲線圖，單位是厘泊(cps)。批量分離物的粘度大于 10，000cps-對(duì)布氏粘度計(jì)來(lái)說(shuō)，在12%固體情況下它過(guò)于粘稠了。該分析揭示隨著水解度 提高，粘度降低，然而隨著固體百分比提高，粘度提高。圖8綜合了粘度和溶解度數(shù)據(jù)。將 溶解度表示為可溶性固體指數(shù)(SSI)和可溶性氮指數(shù)(NSI，它是水溶性氮百分比對(duì)應(yīng)于總 氮的函數(shù))。如圖8所示，隨著水解度提高，粘度降低而溶解度增加幾種存在于TLl水解產(chǎn)物中的揮發(fā)性風(fēng)味劑的量與存在于未水解大豆分離蛋白 中的那些揮發(fā)性風(fēng)味劑的量進(jìn)行比較。使用標(biāo)準(zhǔn)GC技術(shù)測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味劑。與未水解的 大豆分離蛋白相比，TLl水解產(chǎn)物中的己醛、庚醛、戊醛、3-辛烯-2-酮和1-辛烯-3-醇的含量降低(圖9A和9B)。實(shí)施例12 中試TLl水解產(chǎn)物的感官分析。使用基本上如實(shí)施例6所述的SQS方法分析實(shí)施例10中制備的中試TLl水解產(chǎn) 物的風(fēng)味特性。以11或12個(gè)經(jīng)培訓(xùn)的評(píng)估員為一組對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行評(píng)估，水解產(chǎn)物與對(duì) 照樣本(即，未水解的大豆分離蛋白)進(jìn)行比較。表12給出了平均SQS評(píng)分，圖10A-D給 出了診斷評(píng)分的曲線圖。一般來(lái)講，TLl水解產(chǎn)物相對(duì)于對(duì)照樣本具有輕微減少的谷物和 大豆/豆類特性以及較低的粘度，但是具有增加的苦味特性，尤其在水解度(％DH)較高的 情況下更是如此。水解的對(duì)照樣本(即，樣本5-3)具有輕微減少的谷物特性，但是具有中 度增加的苦味和收斂特性。因此，TLl水解產(chǎn)物的評(píng)分一般為苦味少于水解的對(duì)照樣本。表12 中試TLl水解產(chǎn)物的SQS評(píng)分。 圖11給出了 TLl水解產(chǎn)物的感官分析的總結(jié)，其中關(guān)鍵感官特性對(duì)應(yīng)于水解度的 函數(shù)進(jìn)行繪圖。當(dāng)水解度增加時(shí)，水解產(chǎn)物的總體感官評(píng)分降低，然而當(dāng)水解度增加時(shí)苦味 評(píng)分提高。它顯示具有小于約2% DH的水解產(chǎn)物風(fēng)味最好，苦味最少。實(shí)施例13 大豆TLl水解產(chǎn)物中的肽段分析。具有不同水解度的大豆分離蛋白的TLl水解產(chǎn)物中的肽通過(guò)LC-MS分析進(jìn)行鑒 定，其中 LC-MS 使用Q-STAR XL MS(AppliedBiosystems Inc. (ABI)，F(xiàn)oster City, CA) 禾口 LCQ-Deca MS(ThermoFinnigan, Hertfordshire, Great Britain)。大約(0. 5-2. Omg)每個(gè)樣本被溶解于0. 5mL的50mM碳酸氫銨中。將五IL注入 75um i. d.柱中進(jìn)行LC-MS/MS分析，使用數(shù)據(jù)依賴型采集(LC流量為ISOnL/min)。進(jìn)行 Nano-LC, LC Packings Ultimate nano-LC jiM C18PepMapl00 ft (Dionex, UK) /Eksigent2D nano-LC使用C18P^Mapl00柱(Dionex)。表13中給出了色譜流出曲線。溶劑A是在 MilliQ水中的5%乙腈、0. 甲酸，溶劑B是在MilliQ水中的95%乙腈、0. 075%甲酸)。表13 LC-Pump 梯度。 用配備有納電噴霧源(Protana XYZ操縱器)的ABI QSTAR XL雜交QTOF MS/ MS質(zhì)譜儀(Applied Biosystems, Foster City, CA)進(jìn)行樣本分析。陽(yáng)離子模式納電噴霧 由硼硅酸根納電噴霧針在2. 5kV條件下生成。用來(lái)自制造商的標(biāo)準(zhǔn)品每日校準(zhǔn)儀器的m/z 響應(yīng)。使用Analyst QS軟件中的信息依賴型數(shù)據(jù)采集(IDA)部件獲取TOF質(zhì)譜和產(chǎn)物離 子質(zhì)譜，采集參數(shù)如下TOF MS和MS/MS的質(zhì)譜范圍分別是m/z 300-2000和70-2000。TOF MS前離子質(zhì)譜被每秒積聚，隨后是三個(gè)產(chǎn)物離子質(zhì)譜，每個(gè)3秒鐘。TOF MS至MS/MS的轉(zhuǎn) 換由肽的質(zhì)譜范圍(m/z 300-2000)、前電荷態(tài)(2_4)和離子強(qiáng)度(> 50COuntS)觸發(fā)。DP、 DP2和FP設(shè)置分別為60、10和230，并且使用滾動(dòng)碰撞能量。使用Analyst QS軟件(Applied Biosystems)處理肽電噴霧聯(lián)用質(zhì)譜。通過(guò)搜索 標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)如NCBI或Swiss-Prot對(duì)肽進(jìn)行鑒定，搜索使用MASCOT，版本1. 9，同時(shí)有以下 限制無(wú)具有最多一個(gè)錯(cuò)誤裂解位點(diǎn)的酶；MS和MS/MS片段離子分別為0. 8/2. 0和0. SDa 質(zhì)量公差。選擇的前離子電荷態(tài)為1-3。就使用LCQ-Deca MS的LC-MS分析而言，樣本通過(guò)以下方法制備1)將包含2mg 每個(gè)TLl水解產(chǎn)物的等分試樣與0. 甲酸(ImL)在玻璃小瓶中混合，渦旋1_2分鐘，然后 在離心機(jī)中13，OOOrpm離心混合物5分鐘；或2)將包含3mg每個(gè)TLl水解產(chǎn)物的等分試樣 與0. 甲酸(300uL)在微量離心管中混合，渦旋混合物1-2分鐘。然后將全部混合物轉(zhuǎn) 移至預(yù)先清潔的C18槍頭中(Glygen Corp.，Columbia, MD)用于肽分離。用0. 甲酸的 60%乙腈溶液(300 μ L)洗脫C18槍頭進(jìn)行清潔，并用0. 1 %甲酸(600 μ L)進(jìn)行平衡。棄去 0.1%甲酸組分洗脫出的材料，用0.1%甲酸的60%乙腈溶液(600 μ L)洗脫所述肽。將溶 劑混合物在Genevac蒸發(fā)器上300°C蒸發(fā)10分鐘，使得肽溶液的總體積減少到200 μ L?；?本上如實(shí)施例3所述進(jìn)行LC-MS分析。表14給出了所有在大豆蛋白TLl水解產(chǎn)物中鑒定的肽。表14 大豆TLl水解產(chǎn)物中的肽。
實(shí)施例14 用其它肽鏈內(nèi)切酶水解大豆蛋白。用不同的肽鏈內(nèi)切酶(例如SP3，來(lái)自茄病鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶(TL5 ;SEQ ID NO :2)、來(lái)自Fusarium cf. solani的胰蛋白酶樣蛋白酶(TL6 ;SEQ ID NO :3)、豬胰蛋白酶、 或牛胰蛋白酶)處理大豆分離蛋白以測(cè)定是否胰蛋白酶或來(lái)自另一來(lái)源的胰蛋白酶樣蛋 白酶能被用于水解大豆蛋白。制備大豆分離蛋白的8%漿液(即，SUPRO 500E)，調(diào)節(jié)至PH 8，并與其中一種 肽鏈內(nèi)切酶混合使得終濃度為IOOmg蛋白酶/kg大豆蛋白。包括一種不包含蛋白酶的對(duì)照 樣本。漿液在50°C水浴混合培養(yǎng)2小時(shí)，然后加熱滅活(80°C，30分鐘)蛋白酶。將去離子 水加入到每個(gè)樣本中，得到終濃度5%的大豆蛋白。為了評(píng)估水解度，將每個(gè)樣本的等分試樣用SDS-PAGE溶解在4_20 %的Tris_甘氨 酸凝膠上(Novex Inc.，Wadsworth，0H)。如圖12所示，TL1、SP3、TL5和TL6將大豆蛋白水 解成更小的多肽片段，然而用豬或牛胰蛋白酶處理的大豆蛋白只有很少的水解或沒(méi)有水解 (參見(jiàn)泳道7和8)。在37°C和50°C (PH 8)能觀察到豬或牛胰蛋白酶不能裂解大豆蛋白的 情況。實(shí)施例15 =Bowman-Birk抑制劑抑制胰蛋白酶樣蛋白酶。豬或牛胰蛋白酶不能水解大豆蛋白材料的情況是可能的，因?yàn)榇蠖拱钚缘鞍?酶抑制劑，該抑制劑在大豆材料生產(chǎn)期間經(jīng)熱處理后依然存在。為了驗(yàn)證該假設(shè)，將蛋白酶 與不同濃度的商業(yè)制備的Bowman-Birk抑制劑一起培養(yǎng)，然后測(cè)量殘余酶活性。用檢測(cè)分析緩沖液(0. IM Tris, 0. 02 % Brij 35，PH 8. 0)將蛋白酶稀釋至 0. 001mg/mL,然后在微孔板的孔內(nèi)與不同濃度的Bowman-Birk抑制劑(Cat#T_9777， Sigma-Aldrich)混合。板在室溫下攪拌培養(yǎng)1小時(shí)。通過(guò)加入0. 6mg/mL底物，Boc-Val-L eu-Gly-Arg-p-nitroanilide (L-1205 ；Bachem Biosciences, Prussia, PA),測(cè)量殘余活性。 在室溫下，每隔10秒測(cè)量405nm處的吸光度，持續(xù)3分鐘。從測(cè)得的405nm處吸光度的起 始斜率計(jì)算活性。殘余活性被計(jì)算為一個(gè)有抑制劑的孔中的活性相對(duì)于一個(gè)無(wú)抑制劑的孔 中的活性的比值。如表15所示，豬和牛胰蛋白酶與微生物蛋白酶相比，被濃度更低的Bowman-Birk 抑制劑抑制。因此，它顯示大豆材料包含抑制動(dòng)物來(lái)源的胰蛋白酶活性的化合物。表15 動(dòng)物來(lái)源的蛋白酶的抑制 實(shí)施例16 胰蛋白酶比率和胰蛋白酶樣蛋白酶的鑒定。開(kāi)發(fā)了一種用于鑒定具有胰蛋白酶樣活性的酶的檢測(cè)分析法。就該方法而言，胰 蛋白酶樣活性使用顯色底物和通式 Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA(Bachem Biosciences,King of Prussia,PA) 一起進(jìn)行測(cè)量，其中Xxx是二十種天然氨基酸殘基中的任一個(gè)的三字母縮 寫(xiě)形式，pNA是para-nitroanilide。如果肽鏈內(nèi)切酶在Xxx的羧基末端一側(cè)裂解肽鍵，那 么然后釋放出para-nitroaniline并生成黃色，基本上如實(shí)施例15所述進(jìn)行測(cè)量。使用十 種 pNA 底物,其中 Xxx 是 Ala、Arg、Asp、Glu、lie、Leu、Lys、Met、Phe 或 Val0測(cè)試以下肽鏈內(nèi)切酶-ALCALASE 、SP3、TL1和豬胰蛋白酶。通過(guò)色譜法純化 所有酶以得到高純度，即，在每個(gè)肽酶在考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上僅能看 到一條帶。測(cè)量每個(gè)酶的活性時(shí)，其PH值應(yīng)使酶活性不低于最佳PH值時(shí)酶活性的一半，底 物為Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA。相對(duì)于這些底物，ALC的最佳pH是PH 9，其它三種肽酶 的最佳PH是PH 10。檢測(cè)分析緩沖液是IOOmM的琥珀酸、IOOmM HEPESUOOmM CHESUOOmM CABSUmM CaC12、150mM KCl 和 0. 01 % Triton X-100，pH 9.0。將二十 μ L 每個(gè)肽酶的稀 釋液(稀釋在0. 01% Triton X-100中)加入微孔板的十個(gè)孔內(nèi)。將十種pNA底物的其中 一種加入200 μ L到每個(gè)孔內(nèi)，開(kāi)始檢測(cè)(將50mg底物溶解在1. OmLDMSO中，并用檢測(cè)分析 緩沖液進(jìn)一步稀釋到90x)。監(jiān)控0D405是否開(kāi)始提高，將其作為肽酶活性的量度。如果在 4分鐘的測(cè)量時(shí)間內(nèi)不能獲得線性曲線，則將肽酶進(jìn)一步稀釋并重復(fù)所述檢測(cè)。胰蛋白酶比率如下計(jì)算底物包含精氨酸或賴氨酸時(shí)的最高活性除以底物為八種 其它底物中的任何一種時(shí)的最高活性。將胰蛋白酶樣肽鏈內(nèi)切酶定義為一種具有大于100 的胰蛋白酶比率的肽鏈內(nèi)切酶。
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表16給出了相對(duì)于底物為Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA時(shí)的最高活性的活性水平， 以及胰蛋白酶的比率。雖然該檢測(cè)分析在PH 9條件下進(jìn)行并且三個(gè)受試肽酶的最佳pH大 于PH 9，這三個(gè)肽酶在PH 9的活性大于在最佳pH時(shí)的活性的一半。因此，該分析揭示水解 無(wú)色桿菌蛋白酶(SP3)、鐮孢屬胰蛋白酶樣蛋白酶(TLl)和豬胰蛋白酶是胰蛋白酶樣肽鏈 內(nèi)切酶，相反ALGALASE (ALC)不是胰蛋白酶樣肽鏈內(nèi)切酶。表16 不同肽酶的活性和胰蛋白酶比率。 實(shí)施例17 來(lái)源于大豆和乳品蛋白的組合的TLl水解產(chǎn)物。用TLl將大豆分離蛋白和乳品分離蛋白的組合水解至不同的水解度，以便能夠評(píng) 估該組合的功能特性和感官特性。通過(guò)適度混合將大豆分離蛋白(SUPRO 500E)和酪蛋白酸鈉(Alanate 180， NZMP Inc. ,Wellington,New Zealand)的50/50混合物分散在水中來(lái)制備大豆和乳品蛋白 的5%漿液。將混合物加熱到80°C并保持五分鐘，冷卻至50°C，然后用IM NaOH將pH調(diào)節(jié) 至8. 0。將漿液等分試樣適度混合并加熱至50°C，然后加入不同量的TLl (17-600mg酶蛋白每kg完整蛋白)以獲得所需的％ DH值(0、2% DH、4% DH和6% DH)。在50°C培養(yǎng)一段時(shí) 間(約60分鐘)以獲得所需的水解度，然后將樣本加熱至90°C并保持3分鐘以滅活酶。用 冰冷卻樣本并將其貯存于4°C。使用TNBS方法(如實(shí)施例1所述)測(cè)定水解度(％ DH)。在兩種大豆/乳品TLl水解產(chǎn)物(即，4. 3% DH和6. 7% DH)中測(cè)試pH對(duì)溶解度 的效應(yīng)。將每個(gè)等分試樣調(diào)節(jié)至PH 5、PH 6、PH 7、或PH 8，并且樣本在500xg離心10分 鐘。將離心前溶液中固體物質(zhì)的量與離心后溶液中固體物質(zhì)的量進(jìn)行比較以提供可溶性固 體指數(shù)(SSI)，在圖13中給出了％可溶性固體對(duì)應(yīng)于pH函數(shù)的曲線圖。兩種溶液在PH 5 的PH水平上都具有降低的溶解度(S卩，在大豆蛋白的等電點(diǎn)附近)。然而，兩種大豆/乳品 TLl水解產(chǎn)物在約pH 6. 0及更高的水平上都具有優(yōu)異的溶解度。實(shí)施例18 大豆/乳品的TLl水解產(chǎn)物中的肽段分析。實(shí)施例17中制備的大豆/乳品TLl水解產(chǎn)物中的肽段通過(guò)液相色譜質(zhì)譜 (LC-MS)、使用上文詳述的方法(參見(jiàn)實(shí)施例3、4和13)進(jìn)行鑒定。在此研究中鑒定的肽 段序列在表17中列出。鑒定了四種新的大豆來(lái)源的肽(即，SEQ ID NOs 174、175、176和 177)。乳品來(lái)源的序列是SEQ ID N0:178-197。表17 大豆/乳品TLl水解產(chǎn)物中的肽段*。
52 實(shí)施例19 來(lái)源于其它蛋白材料的TLl水解產(chǎn)物。用TLl處理多種其它植物來(lái)源的蛋白材料以生成其它水解產(chǎn)物。小規(guī)模制備這些 水解產(chǎn)物(即，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模)。就此而言，低芥酸菜籽分離蛋白、小麥谷朊粉、或玉米胚芽蛋 白的5%漿液在高于80°C的溫度下變性五分鐘。蛋白漿液用堿性溶液或堿土溶液如氫氧化 鈉溶液或氫氧化鉀溶液中和至約PH 8. 0-8. 5。然后用TLl酶在合適溫度下處理每個(gè)蛋白漿 液足夠的時(shí)間。將TLl酶加入到蛋白漿液中，其濃度為基于凝結(jié)蛋白0.01% -0.08%的酶 蛋白。該酶在約50°C接觸凝結(jié)蛋白材料50分鐘至70分鐘以水解蛋白。通過(guò)將水解的大豆 蛋白材料加熱至足以滅活酶的溫度來(lái)終止水解反應(yīng)。表18給出了一般的水解產(chǎn)物的反應(yīng)參數(shù)。TLl酶的活性基于％ DH進(jìn)行測(cè)量，％ DH通過(guò)測(cè)定每IOOkg蛋白中存在的NH2摩爾數(shù)進(jìn)行測(cè)量。提高的TNBS值證明了酶的活性。 酶活性顯示受蛋白材料的懸浮狀況或溶解度影響，雖然每個(gè)蛋白的活性不是最優(yōu)化的。表18 反應(yīng)參數(shù)。
* TNBS值=試-檢樣本的TNBS值-對(duì)照樣本的TNBS值(即，未水解的 蛋白質(zhì))通過(guò)SDS PAGE使用標(biāo)準(zhǔn)方法分析TLl低芥酸菜籽、玉米、或小麥水解產(chǎn)物和未水 解的對(duì)照樣本。圖14給出了凝膠的圖像。該分析揭示TLl裂解了每個(gè)蛋白材料的所有主
要蛋白亞基。使用上文詳述的方法鑒定低芥酸菜籽、玉米、或小麥TLl水解產(chǎn)物中的代表性的 肽。表19、20和21分別給出了在低芥酸菜籽、玉米和小麥TLl水解產(chǎn)物中鑒定的代表性的肽。表19 低芥酸菜籽分離蛋白的TLl水解產(chǎn)物中的肽。
表21 小麥TLl水解產(chǎn)物中的肽 實(shí)施例20 大豆水解產(chǎn)物和完整乳品蛋白的組合的感官分析。大豆TLl水解產(chǎn)物與完整乳品蛋白進(jìn)行組合(即，酪蛋白酸鹽或乳清)。使用SQS 方法比較大豆水解產(chǎn)物和完整乳品蛋白的這些組合與未水解(完整)大豆與完整乳品蛋白 的感官特性，在上文的實(shí)施例6中詳述了 SQS方法。將具有約2. DH水解度的TLl大豆水 解產(chǎn)物稀釋成5%漿液。將未水解的大豆蛋白也稀釋成5%漿液。在第一次試驗(yàn)中，TLl水解 產(chǎn)物與酪蛋白酸鈉混合(1 1)并對(duì)對(duì)照樣本進(jìn)行評(píng)估，對(duì)照樣本是未水解大豆蛋白與酪 蛋白酸鈉的混合物(1 1)。在第二次試驗(yàn)中，TLl水解產(chǎn)物與甜味乳品乳清混合(4 1) 并對(duì)對(duì)照樣本進(jìn)行評(píng)估，對(duì)照樣本是未水解大豆蛋白與甜味乳品乳清的混合物(4 1)。表22給出了每個(gè)樣本的平均SQS評(píng)分和診斷評(píng)分。包括TLl水解產(chǎn)物的組合的 評(píng)分一般為與對(duì)照樣本有輕微差異。診斷評(píng)分顯示TLl水解產(chǎn)物和完整乳品蛋白的組合相 對(duì)于對(duì)照樣本(即，未水解的大豆和完整乳品蛋白的組合)具有改善的感官特性。表22: SQS 分析。 實(shí)施例21 對(duì)包括蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的飲料的分析。使用具有不同水解度的TLl大豆分離蛋白水解產(chǎn)物制備幾種典型即飲型(RTD) 中性飲料和一種干混飲料的混合物。該飲料包括豆奶型飲料(即，包含4%大豆分離蛋白， 具有8. 5g蛋白/8盎司每份的無(wú)味低脂肪豆奶飲料)、組合型飲料(即，包含8g蛋白/8盎 司每份的無(wú)味飲料，其中總蛋白的一半來(lái)自大豆，另一半蛋白來(lái)自脫脂乳)和干混型飲料。 RTD飲料的物理特性和感官特性與那些用不同來(lái)源的未水解大豆蛋白和/或乳品蛋白制備 的飲料進(jìn)行比較。表23給出了豆奶型飲料的配方。為了制備豆奶型飲料，將檸檬酸鹽溶解在水中，加入大豆蛋白，提高混合速率以將蛋白分散在水中。在蛋白完全分散后，提高漿液溫度至 77°C (170° F)，降低混合速率，混合漿液10分鐘。將麥芽糖糊精、糖和穩(wěn)定劑預(yù)混在一 起并加入到蛋白漿液中。低速混合漿液5分鐘。將向日葵油加入到漿液中，繼續(xù)低速混 合直至混合物均一化(大約3分鐘)。用45%氫氧化鉀將漿液pH調(diào)節(jié)至約7. 0-7. 2。該 漿液在500psi (第二相)和2500psi (第一相)是均一化的。漿液通過(guò)超高溫(UHT)在 141°C (286° F)處理6秒鐘進(jìn)行巴氏滅菌。將混合物冷卻至31 °C (88° F)并包裝在無(wú)菌 瓶中。低溫貯存產(chǎn)品。表23:豆奶型飲料配方。 表24給出了組合型飲料的配方。為了制備組合型飲料，將檸檬酸鹽適度混合溶解 于水中。加入大豆蛋白，提高混合速率以使蛋白分散在水中。在蛋白完全分散后，提高漿液 溫度至77°C (170° F)，降低混合速率，混合漿液10分鐘。將麥芽糖糊精、糖、維生素/礦 物質(zhì)預(yù)混物、磷酸鎂、纖維素和穩(wěn)定劑預(yù)混在一起并加入到蛋白漿液中。低速混合漿液5分 鐘。將向日葵油加入到漿液中，繼續(xù)低速混合直至混合物均一化(大約3分鐘)。用45%氫 氧化鉀或50%檸檬酸將漿液pH調(diào)節(jié)至約6.9-7. 1。將脫脂乳緩慢加熱至72°C (162° F)， 然后將大豆蛋白漿液加入到熱脫脂乳中，將混合物緩慢混合3分鐘。該混合物在500psi (第 二相)和2500psi (第一相)是均一化的?；旌衔锿ㄟ^(guò)超高溫(UHT)在141 °C (286° F)處 理6秒鐘進(jìn)行巴氏滅菌。將混合物冷卻至31°C (88° F)并包裝在無(wú)菌瓶中。低溫貯存產(chǎn)
P
BFI ο 表25給出了干混型飲料的配方。為了制備該飲料混合物，將大豆蛋白和可可粉過(guò) 篩并與所有其它成分在中速下混合15分鐘。將干粉貯存在清潔容器中。表25:干混型飲料配方。
為了測(cè)量飲料的粘度，振搖豆奶型和組合型飲料以獲得均勻分散體，并將一份量 的干混型飲料干粉完全分散在特定量的水中，分散時(shí)使用共混機(jī)低速分散30-40秒或直至 完全分散。將每個(gè)樣本立即灌入ISOmL燒杯中(#14070，Kimax ,USA)，將其灌滿直至到 達(dá)燒杯彎曲部分的底部。在測(cè)量前移除任何可見(jiàn)的泡沫。經(jīng)固定時(shí)間后，使用布氏粘度計(jì) (DV-II+ M ) (Brookfield Engineering Laboratories, Inc. , Middleboro, ΜΑ) IlJfifeiS, 單位為厘泊(cP)，使用錠子#1，RPM60測(cè)量1分鐘(溫度為25-300C )。為了評(píng)估豆奶型飲料的穩(wěn)定性，經(jīng)UHT處理后將樣本收集在250-mL無(wú)菌方型培養(yǎng) 基瓶中。這些瓶子在室溫(25°C )下貯存(無(wú)干擾)4周。然后將瓶子放在平坦表面上，用 直尺(最少100mm，最小刻度Imm)測(cè)量沉淀物的含量。使用以下公式獲得沉淀百分比(沉 淀(mm)/總液體體積(mm))X100。當(dāng)直尺靠著樣本瓶一側(cè)放置時(shí)，如果沉淀層在瓶底，并且 在直尺末端之下，則將其記錄為痕跡沉淀。表26和27分別給出了豆奶型和組合型飲料的粘度和穩(wěn)定性。豆奶型飲料的粘度 測(cè)量結(jié)果與未水解的大豆對(duì)照樣本相當(dāng)。組合型飲料的粘度測(cè)量結(jié)果在包含大豆的對(duì)照樣 本的范圍內(nèi)，輕微低于牛奶對(duì)照樣本。所有豆奶型和組合型飲料都具有良好的穩(wěn)定性。這 些數(shù)據(jù)揭示模型飲料的功能特性不受具有不同水解度的TLl大豆分離蛋白水解產(chǎn)物的負(fù) 面影響。表26 豆奶型飲料的特性。
表27 組合型飲料的特性。 使用九點(diǎn)嗜好程度來(lái)評(píng)估不同模型飲料的感官和風(fēng)味特性的消費(fèi)者測(cè)試。對(duì)飲料 進(jìn)行如下標(biāo)注程度1表示極端不喜歡，程度9表示極度喜歡，5表示既不喜歡也不討厭。圖 15給出了豆奶型飲料的強(qiáng)制排名，S卩，兩個(gè)對(duì)照樣本和TLl的2.2%DH樣本。TLl水解產(chǎn)物 樣本的排名在“總體嗜好”、“風(fēng)味嗜好”和“余味嗜好”方面顯著高于兩個(gè)對(duì)照樣本。此外， 當(dāng)強(qiáng)制排名時(shí)消費(fèi)者把TL12. 2% DH樣本作為該組的優(yōu)選樣本。圖16給出了組合型飲料的 強(qiáng)制排名，即，100%脫脂乳對(duì)照物、50%未水解大豆/50%脫脂乳和50% TL12. 2% DH大豆 水解產(chǎn)物/50%脫脂乳。包含TLl水解產(chǎn)物的樣本的排名在幾乎所有嗜好特性方面顯著高 于未水解的包含大豆樣本，并且在所有嗜好特性方面(即，總體嗜好、顏色嗜好、風(fēng)味嗜好、 口感嗜好、濃度嗜好和余味嗜好)與100%脫脂乳對(duì)照樣本相當(dāng)。還使用SQS方法(如實(shí)施例6中詳述的方法)分析豆奶型和組合型飲料及它們對(duì) 應(yīng)的蛋白漿液。表28給出了 SQS評(píng)分和診斷評(píng)分。如表中所示，每個(gè)試驗(yàn)樣本與對(duì)照樣本 進(jìn)行比較。一般來(lái)講，包含TLl水解產(chǎn)物的樣本具有相對(duì)于對(duì)照樣本降低的大豆/豆類、谷 物和紙板/木質(zhì)感官特性。
表28 模型飲料的SQS評(píng)分和診斷*。
權(quán)利要求
蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，所述組合物包含在每個(gè)羧基末端主要具有精氨酸殘基或賴氨酸殘基的多肽片段的混合物，所述組合物在pH大于約6.0時(shí)具有至少約0.2％DH的水解度和至少約80％的可溶性固體指數(shù)。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物來(lái)源于選自大豆、大麥、低芥 酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物、蛋類、以及它們的組合的蛋白 質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物來(lái)源于大豆與至少一種選自 大麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物、乳品和蛋類的蛋白 的組合。
4.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述蛋白是大豆。
5.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物的水解度為約0.2% DH至約 14% DH0
6.權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中當(dāng)所述組合物的水解度為約DH至約 6% DH時(shí)，所述組合物在約pH 7. O至約pH 8. O的情況下是基本上穩(wěn)定的。
7.權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物在所述水解度為約6%DH時(shí) 比當(dāng)所述水解度為約DH時(shí)顯著地更趨于半透明。
8.權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)組合物，其中所述組合物在所述水解度為約DH至約6%DH 時(shí)比當(dāng)所述水解度為約0. 2% DH時(shí)具有顯著更少的谷物和大豆/豆類感官特性。
9.權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物在所述水解度小于約2%DH 時(shí)比當(dāng)所述水解度大于約2% DH時(shí)具有顯著更少的苦味感官特性。
10.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物包含至少兩種選自SEQID NO 5-177和270-274的多肽片段。
11.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物來(lái)源于大豆和乳品蛋白，并 且包含至少兩種選自SEQ ID NO 5-197和270-274的多肽片段。
12.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物來(lái)源于低芥酸菜籽蛋白，并 且包含至少兩種選自SEQ ID NO 198-237的多肽片段。
13.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物來(lái)源于玉米蛋白，并且包含 至少兩種選自SEQ ID NO =238-261的多肽片段。
14.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物來(lái)源于小麥蛋白，并且包含 至少兩種選自SEQ ID NO =262-269的多肽片段。
15.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，其中所述組合物還包含未水解的蛋白質(zhì)，所 述未水解的蛋白質(zhì)選自大麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、大豆、小 麥、動(dòng)物、乳品、蛋類、以及它們的組合。
16.用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的方法，所述方法包括使蛋白材料與肽鏈內(nèi)切酶 接觸，所述肽鏈內(nèi)切酶特異性地在精氨酸殘基或賴氨酸殘基的羧基末端側(cè)裂解所述蛋白材 料的肽鍵，以產(chǎn)生在PH大于約6. 0的情況下具有至少約0. 2% DH的水解度和至少約80% 的可溶性固體指數(shù)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶是食品級(jí)微生物酶。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶是胰蛋白酶樣蛋白酶。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶選自來(lái)自尖孢鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白 酶、來(lái)自茄病鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶、來(lái)自Fusariumcf. solani的胰蛋白酶樣蛋白酶、以 及來(lái)自水解無(wú)色桿菌的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶是來(lái)自尖孢鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶包括與選自SEQIDN0:1、2、3和4的序 列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶包括與選自SEQIDN0:1、2、3和4的序 列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶包括與選自SEQIDN0:1、2、3和4的序 列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶包括與選自SEQIDNO :1、2、3和4的序 列具有至少99%同一性的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求16的方法，其中所述肽鏈內(nèi)切酶在pH為約7.0至約9. 0和溫度為約45°C 至約60°C時(shí)具有最佳的蛋白水解活性。
26.權(quán)利要求16的方法，其中使約IOmg至約IOOOmg的所述肽鏈內(nèi)切酶與每千克的蛋 白材料接觸。
27.權(quán)利要求16的方法，其中所述蛋白材料選自大豆、大麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉 米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物、蛋類、以及它們的組合。
28.權(quán)利要求16的方法，其中所述蛋白材料是大豆與至少一種選自大麥、低芥酸菜籽、 羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物、乳品和蛋類的蛋白的組合。
29.權(quán)利要求16的方法，其中所述蛋白材料是大豆。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述大豆蛋白材料選自大豆提取物、豆奶、豆奶粉、豆腐、 脫脂大豆粉、部分脫脂大豆粉、全脂大豆粉、大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、以及它們的組合。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述組合物的水解度為約0.2% DH至約14% DH0
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物包含至少兩種選自SEQID NO 5-177和270-274的多肽片段。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述蛋白材料是大豆與乳品的組合，并且所述蛋白質(zhì)水 解產(chǎn)物組合物包含至少兩種選自SEQ ID NO 5-197和270-274的多肽片段。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述蛋白材料是低芥酸菜籽，并且所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物 組合物包含至少兩種選自SEQ ID NO 198-237的多肽片段。
35.權(quán)利要求27的方法，其中所述蛋白材料是玉米，并且所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物 包含至少兩種選自SEQ ID NO 238-261的多肽片段。
36.權(quán)利要求27的方法，其中所述蛋白材料是小麥，并且所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物 包含至少兩種選自SEQ ID NO 261-269的多肽片段。
37.食物產(chǎn)品，所述食物產(chǎn)品包括(a)可食用材料；和(b)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物，所述組合物包含在每個(gè)羧基末端主要具有精氨酸殘基或 賴氨酸殘基的多肽片段混合物，所述組合物在PH大于約6. 0時(shí)具有至少約0. 2% DH的水解度和至少約80%的可溶性固體指數(shù)。
38.權(quán)利要求37的食物產(chǎn)品，其中所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物來(lái)源于選自大豆、大麥、 低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物、蛋類、以及它們的組合的 蛋白質(zhì)。
39.權(quán)利要求37的食物產(chǎn)品，其中所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物來(lái)源于大豆與至少一種 選自大麥、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麥、豌豆、馬鈴薯、大米、小麥、動(dòng)物、乳品和蛋類的 蛋白的組合。
40.權(quán)利要求37的食物產(chǎn)品，其中所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物來(lái)源于大豆，并且所述 水解度為約0. 2% DH至約14% DH0
41.權(quán)利要求37的食物產(chǎn)品，其中所述食物產(chǎn)品是飲料。
42.權(quán)利要求41的食物產(chǎn)品，其中所述飲料選自即飲型飲料、乳或乳類似物飲料、體重 控制飲料、蛋白質(zhì)混合飲料、以及代餐飲料。
43.權(quán)利要求41的食物產(chǎn)品，其中所述飲料具有約6.5至約7. 5的pH。
44.權(quán)利要求41的食物產(chǎn)品，其中所述可食用材料選自脫脂乳、全脂乳、奶油、奶粉、脫 脂奶粉、酪蛋白酸鹽、大豆?jié)饪s蛋白、大豆分離蛋白、乳清濃縮蛋白、乳清分離蛋白、巧克力、 可可粉、咖啡、以及它們的組合。
45.權(quán)利要求37的食物產(chǎn)品，其中所述食物產(chǎn)品還包括選自甜味劑、乳化劑、增稠齊U、 穩(wěn)定劑、脂質(zhì)材料、防腐劑、抗氧化劑、調(diào)味劑、著色劑、維生素、礦物質(zhì)、以及它們的組合的 成分。
46.權(quán)利要求37的食物產(chǎn)品，其中所述食物產(chǎn)品選自壓成塊的(精)加工食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ) 充齊U、基于谷類的食物產(chǎn)品、肉類或肉類類似物產(chǎn)品、以及乳品和乳品類似物產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物、用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的方法、以及包括蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物的食物產(chǎn)品。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合物一般包含多肽片段的混合物，所述多肽片段在每個(gè)羧基末端主要具有精氨酸殘基或賴氨酸殘基。
文檔編號(hào)A23L1/305GK101917866SQ200880012016
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日
發(fā)明者J·隆巴迪, L·B·吉特, L·L·克里斯滕森, P·R·厄斯特加德, P·S·克爾, P·戈什, T·M·王, T·霍夫, Y·馬爾多納多 申請(qǐng)人:索萊有限責(zé)任公司;諾沃茲美斯公司