專利名稱：一種利用⁶⁰Coγ射線輻照獲得丁醇高產(chǎn)株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用Co60Y射線輻照獲得丁醇生產(chǎn)高 產(chǎn)株的方法。
背景技術(shù)：
丁醇作為一種重要的有機溶劑和化工原料，已廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、農(nóng)用 化學(xué)品等領(lǐng)域，而近年的研究表明，丁醇與乙醇相似，可以和汽油混合用于清潔能源， 并具有能量密度高、腐蝕性小、對水的寬容度大等許多優(yōu)于乙醇之處，因此丁醇的市場 前景廣闊(柴國梁.國內(nèi)丁醇市場分析(上).上海化工，2006, 31(2): 49-52， National Agricultural Bio- technology Council 19th Annual Meeting[EB/OL]. http:〃nabc19. sdstate.org/speaker.cfm lname=Ramey,2007-05)。
當(dāng)前，丁醇工業(yè)的生產(chǎn)以石油資源為原料，采取化學(xué)法合成，此法受世界石油短缺 和價格飆升所限，顯然不具有擴展優(yōu)勢，于是曾經(jīng)一度興盛而后遭受石油工業(yè)沖擊并衰 退的丁醇發(fā)酵工業(yè)再度復(fù)蘇，重新成為各國研究的焦點，原料已從單純的糧食轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)
產(chǎn)品生產(chǎn)、加工的廢棄物，發(fā)酵方面也充分融合了現(xiàn)代生物工程技術(shù)的研究成果，總?cè)?劑和丁醇產(chǎn)率大大提高(Benoit Faucon.BP, ABF and DuPont to Build Biofuel Plant.Wall Street Journal (Eastern edition). New York, 2007-06-28(A9)
Thaddeus Chukwuemeka Ezeji,Nasib Qureshi，Hans Peter Blaschek. Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors. Current Opinion in Biotechnology 2007， 18:1—8)。
2006年6月，美國杜邦公司和英國BP公司聯(lián)合宣布建立合作伙伴關(guān)系，共同開發(fā)、生產(chǎn) 并向市場推出新一代生物燃料一生物丁醇，以滿足全球日益增長的燃料需求，該生物丁 醇廠將于2009年投入運營(錢明.BP和杜邦加快生產(chǎn)生物丁醇.中國石化報，2007 —3 —14 ， (5) Benoit Faucon.BP, ABF and DuPont to Build Biofuel Plant.Wall Street Journal (Eastern edition) . New York, Jun 28,2007,A.)。
由于傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵總?cè)軇舛取?%，水分可達(dá)98%以上，而且丁醇在總?cè)軇┲械?比例低， 一般只占60%，其余30%為丙酮，10%為乙醇，加大了后期丁醇回收、分離的 成本，這也是丁醇高成本的關(guān)鍵所在(靳孝慶，王桂蘭，何冰芳.丙酮丁醇發(fā)酵的研究進(jìn) 展及其高產(chǎn)策略.化工進(jìn)展，2007， 26 (12) : 1727—1732)。因此，改良現(xiàn)有菌株，利 用現(xiàn)代的菌種選育技術(shù)，解除代謝過程中可能存在的產(chǎn)物或者中間產(chǎn)物的抑制，提高菌 種對丁醇的耐受性，強化丁醇生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，切斷丙酮、乙醇的生成代謝，提高丁醇 在溶劑中的比例也成為廣大學(xué)者研究的熱點之一。
由于菌體本身受溶劑的影響很大，特別是丁醇的濃度，在發(fā)酵液中一般達(dá)到1.5% 時，即為致命的水平(丙酮的毒性較低， 一般菌能耐2.9%的濃度)，而溶劑產(chǎn)量的高低往
往與菌株對丁醇的耐力有關(guān)。因此，為減少生物丁醇生產(chǎn)中存在的低效價、低產(chǎn)量及低 產(chǎn)率等因素的制約，提高生物丁醇的市場競爭力，有必要改良菌種提高其生產(chǎn)效率。
目前采用的方法有傳統(tǒng)誘變和篩選、重組DNA技術(shù)等，它們可以改變菌株的目標(biāo)代謝 途徑。誘導(dǎo)丙酮丁醇菌株突變的誘變劑有氫過氧化物、萘啶酮酸、2—甲基一5 —硝基一1 一咪唑基乙醇、甲基磺酸乙酯、N—甲基一N—硝基一N—亞硝基胍、紫外線輻射等，其中 以N—甲基一N —硝基一N —亞硝基胍的誘變效果最好(Thaddeus Chukwuemeka Ezeji，Nasib Qureshi,Hans Peter Blaschek. Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors. Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-8)。在國外廣為使用的以穩(wěn)定性、超級淀粉水解能力及產(chǎn)丁醇特性著稱的突變株 C. Z ej'乂en'/7ch7 5A W，就是在1991年由C 6eCarr'/ ch7 AOM9卵忍經(jīng)N—甲基一N — 硝基一N—亞硝基胍誘變處理和葡萄糖類似物2—脫氧葡萄糖富集培養(yǎng)篩選而得。我國張 益榮等從土樣中分離了多株能產(chǎn)生溶劑的梭菌，經(jīng)多次單細(xì)胞分離、純化，再經(jīng)亞硝基 胍和甲基磺酸乙酯誘變和抗性篩選，獲得一株高丁醇的丙酮丁醇梭菌 C7. aceto6"yh'c咖，丁醇產(chǎn)量為總?cè)軇┑?0% ，對溫度可耐受到39 —40°C ，菌株性狀穩(wěn) 定(張益榮，陳軍，楊蘊劉，焦瑞身.高丁醇比丙酮丁醇梭菌的選育與應(yīng)用.工業(yè)微生物， 1996， 26 (4) : l—6)。北京化工大學(xué)采用自然分離、誘變、選育得到高丁醇比例菌種， 丁醇生產(chǎn)率達(dá)70 % ，淀粉轉(zhuǎn)化率為25 % ，總?cè)軇┥a(chǎn)達(dá)20 g/L ，指數(shù)均高于傳統(tǒng)工業(yè)菌 種，且菌種的遺傳性狀穩(wěn)定，可進(jìn)行工業(yè)規(guī)模化連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)(趙引德，段學(xué)維.乙醇燃料企 業(yè)向生物精細(xì)化工延伸玉米發(fā)酵生產(chǎn)丁醇競爭優(yōu)勢明顯.中國化工報,2007-6-5， (2))。
采用基因工程進(jìn)行丁醇發(fā)酵菌種的改造也有了很多報道。2003年，Tummala等用反義 RNA技術(shù)試圖增加C. flceto6w^/c謂824發(fā)酵產(chǎn)丁醇/丙酮的比例，發(fā)現(xiàn)用反義RNA下調(diào)丙 酮形成路徑中的酶乙酰乙酸脫羧酶(AADC)和CoA轉(zhuǎn)移酶(CoAT)，雖然CoAT基因下調(diào) 顯著，丙酮產(chǎn)量有了實質(zhì)性的下降，但碳流并沒有改道合成丁醇，相反，合成的突變株 產(chǎn)丁醇水平大大下降。Tu咖ala等(Tu腿ala SB， Junne SG， P鄰outsakis ET: Antisense RNA downregulation of coenzyme A transferase combined with alcohol-aldehyde deghydrogenase overexpression leads to predorminantly alchologenic C7o""W"/z scetoZwtj^'c咖fermentation. J Bacteriol 2003, 185:3644-3653.)用 反義RNA抑制ctfB (位于多順反子aad-ctfA-ctffi上的CoAT的第二個基因)下調(diào)CoAT,試圖通 過醇一醛脫氫酶(aad)基因的過表達(dá)提高發(fā)酵過程中丁醇/丙酮的比例，然而，合成的 突變株丁醇水平仍然顯著下降，乙醇濃度卻高于對照23倍。雖然對于丙酮丁醇梭菌在分 子生物學(xué)特性方面的研究取得了一些成就，但由于對丁醇產(chǎn)生缺乏整體規(guī)律性認(rèn)識以及 溶劑生產(chǎn)菌特有生理學(xué)特性的了解，尚有很多難點未能突破，如外源DNA難于進(jìn)入丙酮 丁醇菌內(nèi)，沒有合適的用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的克隆載體等。因此，應(yīng)用重組DNA技術(shù)還遠(yuǎn)沒有構(gòu)造出 一株超高產(chǎn)丁醇的工業(yè)菌株。
原生質(zhì)體誘變技術(shù)也是一種行之有效的育種方法，它是以原生質(zhì)體為材料，采用物 理或化學(xué)誘變劑處理，經(jīng)過再生培養(yǎng)，從而選育獲得突變株的一門技術(shù)。(丁曉兵，李 宗偉，劉曉波等.原生質(zhì)體誘變在工業(yè)微生物育種中的應(yīng)用進(jìn)展.食品工業(yè)科技，2008， 7: 260_262。施巧琴，吳松剛主編.工業(yè)微生物育種學(xué).北京科學(xué)出版社，2003)而 60Co Y射線作為物理誘變劑中電離射線的一種，可引發(fā)生物基因突變和染色體畸變,是一 種得到高產(chǎn)目標(biāo)菌株的有效手段。
目前還沒有用60Co Y射線進(jìn)行丁醇發(fā)酵菌株誘變育種的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種利用60C0Y射線輻照獲得丁醇生產(chǎn)高產(chǎn)株的方法，采用 60C0Y射線輻照對丁醇生產(chǎn)菌細(xì)胞或其原生質(zhì)體進(jìn)行輻照，獲得丁醇高產(chǎn)株。其工藝步驟 包括
1、 細(xì)胞懸液的制備
將斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的丁醇產(chǎn)生菌用無菌水洗下，顯微鏡計數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5 —
7 xl0 6個/mL。
所述丁醇產(chǎn)生菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、糖一醋丁基梭菌 (Clostridium saccharro-acetoburylicum)、費地浸麻梭狀芽抱桿菌(Clfelsineum) 、 丁基 梭狀芽孢桿菌(Cl.butylicum)。
2、 原生質(zhì)體的制備
將培養(yǎng)好的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、糖一醋丁基梭菌 (Clostridium saccharro-acetoburylicum)、費地浸麻梭狀芽抱桿菌(Clfelsineum) 、 丁基 梭狀芽孢桿菌(Cl.butylicum)等丁醇產(chǎn)生菌在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后接種于完全 培養(yǎng)基，30 — 37。C靜置培養(yǎng)18—24h，添加0. 1—0.3%甘氨酸和20-30u/ml青霉素處理 2 — 3h后3000 — 5000r/min離心5—10min，緩沖液洗滌菌體。收集處理后的菌體懸浮于 原生質(zhì)體穩(wěn)定液中，加入2-4mg/mL溶菌酶，37。C保溫6-8h后終止酶解，3000_ 5000r/min，離心5-10min，收集原生質(zhì)體。 所述的完全培養(yǎng)基是指
完全培養(yǎng)基(g/L);酵母浸粉3.0， 牛肉膏10.0，胰蛋白胨10.0，可溶性淀粉1.0， 葡萄糖5.0， L-半胱氨酸0.50， NaCI5.0， NaAc3.0，瓊脂粉15, pH8.5。
3、60CoY射線輻照誘變
將制備的細(xì)胞懸液或原生質(zhì)體懸浮于高滲緩沖液中，60CoY射線輻照，輻照劑量 100_1000 Gy，劑量率3—5Gy/min，誘變后稀釋1(T3 1()-6涂布于完全培養(yǎng)基上，于30 一35'C黑暗條件下避光培養(yǎng)2—3d。
本發(fā)明所述高滲緩沖液的成份為0.1mol/LpH6.0磷酸緩沖液，0.8mol/L甘露醇。
4、 高產(chǎn)株的篩選
選取致死率在90%以上的輻照劑量輻照的菌株30—37。C有氧培養(yǎng)48—72h后測 定丁醇產(chǎn)量，篩選高產(chǎn)菌株。 本發(fā)明的有益效果
采用"C0Y射線輻照誘變操作簡單，輻照原生質(zhì)體正變率高，可顯著提高菌株的丁
醇生產(chǎn)能力，降低丁醇生產(chǎn)成本。
具體實施例方式
本發(fā)明的目的是提供一種利用6°C0 Y射線輻照獲得丁醇生產(chǎn)高產(chǎn)株的方法，采用 6。C0Y射線輻照對丁醇生產(chǎn)菌細(xì)胞或其原生質(zhì)體進(jìn)行輻照，獲得丁醇高產(chǎn)株。采用6"C0Y 射線輻照誘變操作簡單，輻照原生質(zhì)體正變率高，可顯著提高菌株的丁醇生產(chǎn)能力，降 低丁醇生產(chǎn)成本。
下面再舉具體實施例對本發(fā)明予以進(jìn)一步說明。
實例l:
1. 菌種
拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
2. 培養(yǎng)基
完全培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉3.0，牛肉膏10.0，胰蛋白胨10.0，可溶性淀粉l.O，葡萄 糖5.0， L-半胱氨酸0.50， NaCI5.0， NaAc 3.0，瓊脂粉15， pH8.5。 P2培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30.0，酵母粉l.O
P2營養(yǎng)液(g/L) : KH2P04 50.0, K2HP04 50.0， NH4C00H 220,對一氨基苯甲酸O. 10，硫 胺素O. 10， 0.001， MgS04. 7H20 20. 0， MnS04. H20 1.0， FeS04. 7H20 1.0， NaCI 1.0。過 濾滅菌。接種前將P2營養(yǎng)液以1X的比例加入P2合成培養(yǎng)基中。
玉米培養(yǎng)基(g/L):質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%玉米醪培養(yǎng)基。稱取過40目篩的玉米粉70g，加1L 自來水，煮沸50min后，補足揮發(fā)水分。
3. 細(xì)胞懸液的制備
將完全培養(yǎng)基斜面菌種用無菌水洗下制成菌懸液備用。
4. 誘變
菌懸液在鈷源下分別接受100， 200， 400， 600， 800Gy劑量照射，劑量率 5Gy/min，輻照后稀釋涂布于完全培養(yǎng)基平板，37'C培養(yǎng)48h。
5. 突變株的篩選
初篩挑取輻照劑量600Gy (致死率在90%以上)的菌落于完全培養(yǎng)基斜面，待菌 體繁殖后接種于玉米培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)72h后測定丁醇、丙酮、乙醇產(chǎn)量。
復(fù)篩初篩后的菌株在P2合成培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，37'C培養(yǎng)72h后測定丁醇、丙 酮、乙醇產(chǎn)量。
6. 輻照結(jié)果
選育出的丁醇高產(chǎn)株總?cè)軇┊a(chǎn)量較出發(fā)菌株提高58. 84%, 丁醇產(chǎn)量提高56. 88%。 總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到14. 82g/L和9. 57g/L。 實例2:
1. 菌種
拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
2. 培養(yǎng)基和緩沖液
完全培養(yǎng)基、P2合成培養(yǎng)基、P2營養(yǎng)液、玉米培養(yǎng)基同實例一。
高滲再生培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40.0，胰蛋白胨6.0，酵母膏2.0，牛肉膏2.0，醋酸銨 3.0,蔗糖171.15， KH2PO40.5，中性紅0.2, MgS04.7H20 0.2， FeS04.7H20 0.01，瓊脂 20， pH6.2。
高滲緩沖液0.1mol/LpH6.0磷酸緩沖液中加入0.8mol/L甘露醇。原生質(zhì)體穩(wěn)定液 (SMM) (g/L):蔗糖0.5mo1， MgCl2.6H20 20 mmol/L,順丁烯二酸0.02 mol， pH6.5。 原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM) (g/L):蔗糖0.5mo1， MgCl2.6H20 20 mmol/L,順丁烯二酸 0.02 mol， pH6.5。
3. 原生質(zhì)體制備
菌種活化后接種于完全培養(yǎng)基，37'C靜置培養(yǎng)一段時間，添加青霉素、甘氨酸處理 2h后4000r/min離心10min，緩沖液洗滌菌體。收集處理后的菌體懸浮于SMM中，加入 適量溶菌酶，37。C保溫8h后終止酶解，3000r/min，離心lOmin，收集原生質(zhì)體。
4. 原生質(zhì)體的^CoY射線輻照誘變 原生質(zhì)體高滲液在鈷源下分別接受10， 50， 100， 200， 500Gy劑量照射，劑量率
5Gy/min，輻照后稀釋涂布于再生平板，37'C培養(yǎng)72h。
5. 突變株的篩選
初篩挑取輻照劑量500 Gy (致死率在90%以上)的再生菌落于完全培養(yǎng)基中，待 菌體繁殖后接種于玉米培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)72h后測定丁醇、丙酮、乙醇產(chǎn)量。
復(fù)篩初篩后的菌株在P2合成培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，37。C培養(yǎng)72h后測定丁醇、丙 酮、乙醇產(chǎn)量。
6. 輻照結(jié)果
選育出的丁醇高產(chǎn)株總?cè)軇┊a(chǎn)量較出發(fā)菌株提高81.46%， 丁醇產(chǎn)量提高85.41%。 總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到16. 94g/L和11. 31g/L。
權(quán)利要求
1.一種利用60Co γ射線輻照獲得丁醇生產(chǎn)高產(chǎn)株的方法，其特征在于，工藝步驟包括(1)細(xì)胞懸液的制備將斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的丁醇產(chǎn)生菌用無菌水洗下，顯微鏡計數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5-7×106個/mL；(2)原生質(zhì)體的制備將斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的丁醇產(chǎn)生菌接種于完全培養(yǎng)基，30-37℃靜置培養(yǎng)18-24h，添加0.1-0.3％甘氨酸和20-30u/ml青霉素處理2-3h后3000-5000r/min離心5-10min，緩沖液洗滌菌體；收集處理后的菌體懸浮于原生質(zhì)體穩(wěn)定液中，加入2-4mg/mL溶菌酶，30-37℃保溫6-8h后終止酶解，3000-5000r/min，離心5-10min，收集原生質(zhì)體；(3)60Co γ射線輻照誘變將制備的細(xì)胞懸液或原生質(zhì)體懸浮于高滲緩沖液中，用60Co γ射線輻照，輻照劑量100-1000Gy，劑量率3-5Gy/min，誘變后稀釋10-3～10-6涂布于完全培養(yǎng)基上，于30-35℃黑暗條件下避光培養(yǎng)2-3d；(4)高產(chǎn)株的篩選選取致死率在90％以上的輻照劑量輻照的菌株30-37℃有氧培養(yǎng)48-72h后測定丁醇產(chǎn)量，篩選高產(chǎn)菌株。
2、 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述丁醇產(chǎn)生菌為丙酮丁醇梭 菌C/oWnV//ww "c^o6w/>>//cmw、糖—醋丁基梭菌C7oWn'd/ww s"cc/ aro aceto6^7//0^、費地浸麻梭狀芽孢桿菌C7./eto力eww或丁基梭狀芽孢桿菌
3、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述完全培養(yǎng)基為 完全培養(yǎng)基g/L:酵母浸粉3.0,牛肉膏10.0，胰蛋白胨10.0，可溶性淀粉1.0，葡萄糖5.0, L-半胱氨酸0.50, NaCI5.0， NaAc 3.0，瓊脂粉15, pH8.5。
4、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述高滲緩沖液的成份為0.1mol/LpH6.0磷酸緩沖液，0.8mol/L甘露醇。
全文摘要
一種利用⁶⁰Coγ射線輻照獲得丁醇生產(chǎn)高產(chǎn)株的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。采用⁶⁰Coγ射線對丁醇生產(chǎn)菌細(xì)胞或其原生質(zhì)體進(jìn)行輻照，獲得丁醇高產(chǎn)株。其優(yōu)點在于，操作簡單，輻照原生質(zhì)體正變率高，可顯著提高菌株的丁醇生產(chǎn)能力，降低丁醇生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P7/16GK101358187SQ200810223080
公開日2009年2月4日 申請日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者婭 劉, 劉宏娟, 周玉杰, 張建安, 程可可 申請人:清華大學(xué)