用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒，包括：(1)3-plex包被微球：含有分別包被了IL-1β捕獲抗體、IL-6捕獲抗體和Osteocalcin捕獲抗體的不同顏色編碼微球；(2)3-plex生物素標(biāo)記檢測抗體：分別用生物素標(biāo)記的IL-1β、IL-6和Osteocalcin的檢測抗體；(3)鏈親和素藻紅蛋白。本發(fā)明還提供了所述試劑盒的制備方法。本發(fā)明提供的用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒具有高通量，多指標(biāo)并行檢測，檢測快速、準(zhǔn)確、費用低等優(yōu)點。實驗表明，采用本發(fā)明的試劑盒對固定義齒修復(fù)后牙周圍組織不良反應(yīng)及炎癥風(fēng)險發(fā)生率的預(yù)測準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上。
【專利說明】用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物類，具體地說，涉及一種用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牙列完整是人類健康長壽和保證生活質(zhì)量的重要體現(xiàn)。對于缺失牙齒的患者采用固定義齒修復(fù)，是由基牙承擔(dān)缺失牙的咀嚼力來修復(fù)牙列缺損。固定義齒在口內(nèi)戴用異物感輕，具有舒適、美觀、咀嚼功能好等特點，但幾千至幾萬元的價格相對局部義齒修復(fù)費用較高。同時固定義齒粘固在患者口內(nèi)，義齒功能的發(fā)揮與基牙健康密切相關(guān)，但是患者經(jīng)常在義齒出現(xiàn)松動、修復(fù)牙位咬合疼痛等情況下才會覺察基牙出現(xiàn)問題，而此時固定義齒修復(fù)失敗的結(jié)果往往已不可逆轉(zhuǎn)，基牙也可能因牙槽骨吸收、牙根折裂等原因?qū)е掳纬?，增加患者口腔?nèi)牙齒缺失的數(shù)目，患者需面對再次修復(fù)治療。因此，探索能在早期評估固定義齒基牙支持力改變及牙周炎癥風(fēng)險的技術(shù)模式及標(biāo)準(zhǔn)，對于監(jiān)測固定義齒修復(fù)后基牙狀況，進(jìn)行早期預(yù)警和干預(yù)舉措，對于降低固定修復(fù)失敗風(fēng)險，延長修復(fù)體的戴用壽命，避免基牙缺失十分重要。根據(jù)第3次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全國35?44歲年齡段人群(檢查32顆牙)中平均存留牙數(shù)為29.40顆，有牙齒缺失的為37.0%。全國65?74歲老年人平均存留牙數(shù)為20.97顆，有牙齒缺失的為86.1%。牙齒缺失后的及時修復(fù)對于維持患者口腔功能及提高生活質(zhì)量有重要意義，而義齒修復(fù)后具有良好的功能和長期使用壽命對于牙齒缺失的患者尤為重要。
[0003]口腔銀溝液(gingival crevicalar fluid, GCF)是從銀溝滲出的液體,是人體唯一的，直接從體液滲出的液體，其成份與血清相近，含有多種細(xì)胞因子、抗體等成份。目前公認(rèn)的GCF的產(chǎn)生模式是:微血管系統(tǒng)內(nèi)的液體，經(jīng)過內(nèi)皮細(xì)胞間隙滲入到細(xì)胞間形成細(xì)胞間液，最后經(jīng)過淋巴管回流吸收，當(dāng)滲出大于回流時，液體就會經(jīng)結(jié)合上皮細(xì)胞間隙外滲到齦溝內(nèi)形成齦溝液。早期的研究證明GCF是溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮下血管的炎性滲出；后來證實無論在炎癥狀態(tài)或是正常狀態(tài)，由于各種因素引起滲透壓的改變都可導(dǎo)致GCF。GCF成分主要來源于血清，其他成分來源于牙周和細(xì)菌。鑒于齦溝液的來源及性質(zhì)，通過測定齦溝液某些成份的改變從而診斷或評價口腔局部及全身性疾病。
[0004]齦溝液的量可反映出牙齒周圍組織的健康情況，作為評價牙齒周圍組織健康狀態(tài)的指標(biāo)；口腔感染及應(yīng)力作于牙齒都可以影響牙周組織的健康和齦溝液分泌成分的改變，例如，齦溝液中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶可作為診斷牙周炎各階段的指標(biāo)；齦溝液的pH值與牙周袋深度、齦下菌斑、厭氧菌總數(shù)呈顯著正相關(guān)；成人正畸加力24小時后齦溝液量增加，說明成人正畸加力24小時后炎癥反應(yīng)可能較重；齦溝液葡萄糖水平與血糖的變化水平相關(guān)；部分人類病毒(如HIV)感染后患者體內(nèi)抗體的變化也會在齦溝液中表現(xiàn)，國外已開發(fā)出唾液快速檢測HIV抗體的方法。但是，目前對于齦溝液的研究大多數(shù)僅限于牙周炎癥情況下齦溝液中各分泌成分的改變或口腔正畸、修復(fù)臨床治療過程中施加的應(yīng)力對齦溝液各分泌成分的影響，以及基牙使用的不同修復(fù)材料對齦溝液分泌的影響等方面。[0005]鑒于齦溝液產(chǎn)生及分泌的特點，在應(yīng)力作用及牙周炎癥、感染情況下齦溝液的分泌成分(如促炎癥細(xì)胞因子、生物活性物質(zhì))的改變可呈現(xiàn)早期改變、快速上升的趨勢，并且這種變化具有早于臨床癥狀及表征出現(xiàn)的特點，可利用齦溝液中各生物活性物質(zhì)的改變預(yù)測基牙周圍組織不良反應(yīng)及炎癥風(fēng)險的發(fā)生，從而可以進(jìn)行早期預(yù)警和干預(yù)，并指導(dǎo)口腔臨床治療合理應(yīng)用力學(xué)。
[0006]口腔內(nèi)每天齦溝液的生成量僅約0.5-2.4ml，如何對少量齦溝液進(jìn)行收集、并對其中各種生物活性物質(zhì)進(jìn)行快速的檢測及評價是限制利用齦溝液進(jìn)行早期診斷預(yù)測的瓶頸。國內(nèi)外臨床上雖然目前開展了齦溝液中炎癥因子的放免分析、酶免分析等檢測。但是，這些方法均是單指標(biāo)的檢測。而通過齦溝液的分泌成分單指標(biāo)檢測反映牙周微環(huán)境的狀況，存在著特異性不強、靈敏度低等不足，特別是對早期炎癥及骨吸收狀況的檢出率不高，因此不能很好的指導(dǎo)患者治療。并且進(jìn)行單指標(biāo)的檢測所需齦溝液樣本量較大，費用昂貴。鑒于這種情況，發(fā)展能夠同時、快速、準(zhǔn)確檢測多種齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物的綜合技術(shù)迫在眉睫。液相蛋白芯片技術(shù)正是符合這種檢測需求的能夠高通量、高靈敏度和低樣本消耗量的檢測炎癥標(biāo)志物的蛋白技術(shù)平臺。
[0007]液相芯片，也稱為微球體懸浮芯片(suspension array, liquid chip),是基于xMAP (flexible Multi Analyte Profiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺，它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術(shù)平臺。迄今為止十年時間，全球已有數(shù)百套基于xMAP技術(shù)的檢測平臺用于免疫學(xué)、蛋白質(zhì)、核酸檢測、基因研究等領(lǐng)域，該技術(shù)已成為一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究工具，也是最早通過美國食品與藥物管理局(FDA)認(rèn)證的可用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。
[0008]齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物簡介:
[0009]I) IL-1 β (又稱淋巴細(xì)胞刺激因子)，主要由活化的單核一巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。
[0010]存在形式IL-1 α和IL-1 β。主要生物學(xué)功能包括在局部低濃度時發(fā)揮免疫調(diào)節(jié):協(xié)同刺激APC和T細(xì)胞活化，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體。當(dāng)大量產(chǎn)生時可誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白合成；引起炎癥反應(yīng)、發(fā)熱和惡病質(zhì)。壓應(yīng)力會引發(fā)前體炎性遞質(zhì)高表達(dá)，如白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1 β被證實是壓應(yīng)力作用下產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子之一。IL-1 β既可刺激地諾前列酮合成、一氧化氮(NO)產(chǎn)生和蛋白酶分泌，還可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopro-teinase,MMP)合成、增強ECM分解、抑制組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metallopro-tease, TIMP)-1I分泌。當(dāng)?shù)蛷姸鹊难h(huán)性軸向張應(yīng)力(形變率1.5?5%)作用于HPDLF時，ECM合成增加，表現(xiàn)為I型膠原、纖維素和生長因子合成增加；當(dāng)高強度的循環(huán)性軸向應(yīng)力(形變率6-12.5%)作用于HPDLF時，ECM分解代謝增強，由IL-1 β介導(dǎo)的地諾前列酮、NO、MMP等炎性因子合成增加。MMP是一類與HPDLF外基質(zhì)降解十分密切的蛋白水解酶，在牙周組織更新過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。對于IL-1 β與MMP-1之間關(guān)系的研究，Μ.Shibata等發(fā)現(xiàn)IL-1 β能刺激HPDLF分泌MMP-1，相較于單獨應(yīng)用，IL-1 β與IL-6聯(lián)合應(yīng)用時，這種刺激分泌的作用更為顯著，而單獨應(yīng)用IL-6并不能使HPDLF分泌MMP-1增加。該結(jié)果提示，IL-1 β對HPDLF分泌MMP-1具有促進(jìn)作用，IL-1 β與IL-6聯(lián)合應(yīng)用能進(jìn)一步加強HPDLF對MMP-1的促進(jìn)作用。有關(guān)HPDLF在張應(yīng)力下MMP的分泌機制，Garlet等提出了假設(shè):牙周膜成纖維受到張應(yīng)力作用后合成細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6，IL-1和IL-6通過HPDLF的自分泌和旁分泌機制激活MMP和--ΜΡ。激活的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子，啟動血管再生，通過MMP降解ECM，促進(jìn)細(xì)胞擴散和毛細(xì)血管的生長。
[0011]2) IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。主要功能包括:刺激活化B細(xì)胞增殖，分泌抗體；刺激T細(xì)胞增殖及CTL活化；刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)；促進(jìn)血細(xì)胞發(fā)育。IL-6是來源廣泛的多功能細(xì)胞因子，在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其多項功能可能與牙周炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[36]，如IL-6可以促進(jìn)牙槽骨的吸收，抑制成骨形成；降低成纖維細(xì)胞的附著力，影響牙周膜的修復(fù)和代謝功能；參與牙周炎的炎性反應(yīng)等。Johnson等的研究表明，牙周炎患者炎癥部位的IL-6水平明顯增高，并且炎癥程度與IL-6在組織中的表達(dá)成正比。近年來研究已說明在牙周炎的發(fā)展過程中，IL-6可導(dǎo)致牙齦炎癥、牙周袋形成，是參與牙槽骨吸收破壞的重要細(xì)胞因子之一。HPDLF在生理狀態(tài)下可以組成性地分泌少量IL-6，而當(dāng)受到外界刺激，如炎癥因子、機械力等，可分泌包括IL-6在內(nèi)的若干種可溶性炎癥因子。
[0012]3) Osteocalcin也稱骨鈣蛋白，是由成骨合成和分泌的維生素K依賴性鈣結(jié)合蛋白，是一種非膠原酸性糖蛋白。因為分子中含有依賴維生素K的羧基谷氨酸殘基，故又名羧基谷氨酸蛋白。 骨鈣蛋白分子中的骨鈣素是骨鈣蛋白與鈣離子結(jié)合的重要功能基團(tuán)。機體骨鈣蛋白有2種存在形式即羧化不全骨鈣蛋白和羧化骨鈣蛋白。比較血清及齦溝液中骨鈣素在牙周炎患者和牙周健康者之間的差異，發(fā)現(xiàn)牙周炎組血清及齦溝液中骨鈣素的含量明顯低于牙周健康組，血清及齦溝液中骨鈣素與牙周炎之間可能存在聯(lián)系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是提供一種用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒。所述試劑盒可實現(xiàn)對于IL-1 β、IL-6和Osteocalcin三個指標(biāo)的聯(lián)合檢測。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供上述用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒的制備方法。
[0015]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒，所述試劑盒中包括:
[0016](1) 3-plex包被微球:含有分別包被了 IL-1 β捕獲抗體、IL_6捕獲抗體和Osteocalcin捕獲抗體的不同顏色編碼微球；
[0017](2) 3-plex生物素標(biāo)記檢測抗體:分別用生物素標(biāo)記的IL-1 β、IL-6和Osteocalcin的檢測抗體；以及
[0018](3)鏈親和素藻紅蛋白。
[0019]本發(fā)明還提供所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0020]( I)相應(yīng)捕獲抗體包被相應(yīng)微球
[0021]a.取羧基微球用漩渦振蕩器振蕩微球懸液20s，使微球混合均勻；
[0022]b.取羧基微球IX IO6個，轉(zhuǎn)移到離心管中，≥8000g離心2min，沉淀微球；
[0023]c.移走上清，加入dH20 100 μ 1，用漩渦振蕩器振蕩20s重懸微球，≥8000g離心2min，沉淀羧基微球；移走上清，加入IOOmmoI/L, pH值6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液80 μ 1，用漩渦振蕩器振蕩20s，重懸洗滌的羧基微球；
[0024]d.加入 50mg/ml 的 N 羥基硫代玻拍酸亞胺(N-Hydroxysulfosuccinimide sodiumsaltSulfo-NHS)(用dH20稀釋)10 μ I，用漩渦振蕩器輕輕地振蕩；
[0025]e.力卩A 50mg/ml的1-乙基_3[3_( 二甲氨基)丙基]碳二亞胺[l-thyl-3-(3-Dimethylaminop ropyl)carbodiimide Hydrochloride, EDC](用 dH20 稀釋)10 μ I，用漩渦振蕩器輕輕振蕩；
[0026]f.室溫孵育20min,每隔IOmin用鏇潤振蕩器輕振，≤8000g離心2min,沉淀活化
的羧基微球；
[0027]g.移走上清，力卩入50mmol/L, pH值5.0的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸[2-(N-Moropholino) ethanesulfonicacid, MES],鏇潤振蕩器振蕩 20s,重懸活化的羧基微球，≤8000g離心2min，沉淀洗滌后的羧基微球；重復(fù)該步驟2次，用50mmol/L，pH值5.0的MES洗滌2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩渦振蕩器振蕩20s，在混勻的微球中分別加入 50 μ g IL-1 β、IL-6 和 Osteocalcin 捕獲抗體，用 50mmol/L, pH 值 5.0 的 MES 定容至500 μ I，用漩渦振蕩器混勻；于室溫置于搖床上孵育2h，≤SOOOg離心2min，沉淀偶聯(lián)好的微球；
[0028]h.移走上清，加入PBS-TBN 300 μ 1，漩渦振蕩器振蕩30s ;于室溫置于搖床上孵育30min,≤8000g離心2min,沉淀偶聯(lián)好的微球；
[0029]1.移走上清,加入PBS-TBN Iml,鏇潤振蕩器振蕩30s,≤8000g離心2min,沉淀偶聯(lián)好的微球；重復(fù)該步驟I次，用PBS-TBN洗滌2次；
[0030]j.加入PBS-TBN Iml，重懸偶聯(lián)好且經(jīng)過洗滌的微球，即得IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕獲抗體分別與微球的偶聯(lián)體；
[0031]k.用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)微球的數(shù)量，濃度為2.5X105個/ml ;將偶聯(lián)好的微球置于
4°C避光保存；
[0032](2) IL-1 β、IL-6和Osteocalcin檢測抗體的生物素化
[0033]1.將 Img 的 IL-1 β、IL-6 和 Osteocalcin 檢測抗體分別用 0.lmol/L, pH 值 8.0的碳酸氫鈉緩沖液稀釋到lmg/ml，終體積為Iml ；
[0034]m.交互用0.lmol/L, pH值8.0的碳酸氫鈉緩沖液對蛋白質(zhì)充分透析；
[0035]η.用Iml 二甲基亞砜(DMSO)溶解N-羥琥珀酰亞氨活化生物素(N-hydroxysuccinimide biotin, NHSB) Img ；
[0036]ο.向Iml的IL-1 β、IL_6和Osteocalcin檢測抗體溶液中分別加入lg/L的NHSB溶液120 μ I ;在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4h ；
[0037]p.加入lmol/L NH4Cl溶液9.6 μ 1，在室溫下攪拌lOmin，在4°C下對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上Iml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集Iml/管，蛋白質(zhì)在l_3ml之間洗脫；樣品加入終濃度為0.5g/L的疊氮鈉及1.0g/L BSA ;將結(jié)合產(chǎn)物置于4 °C避光保存。
[0038]本發(fā)明中涉及的捕獲抗體分別為:IL_li3捕獲抗體，克隆號為P2H3 (MerckMillipore) ;IL_6 捕獲抗體，克隆號為 B_E8 (Merck Millipore) ;0steocalcin 捕獲抗體，克隆號為 1-22 (Merck Millipore)。[0039]本發(fā)明中涉及的檢測抗體分別為:IL_10檢測多克隆抗體，克隆號為EP408Y(Merck Millipore) ;IL_6 檢測多克隆抗體，克隆號為 E457 (Merck Millipore)；Osteocalcin 檢測多克隆抗體，克隆號為 aa 59-74 (Merck Millipore)。
[0040]本發(fā)明基于液相芯片技術(shù)，通過大量實驗開發(fā)出可以對齦溝液內(nèi)IL-1 β、IL-6和Osteocalcin三種炎癥標(biāo)志物聯(lián)合快速檢測的液相芯片試劑盒。研究表明，對齦溝液內(nèi)三個指標(biāo)的聯(lián)合檢測，可實現(xiàn)對固定義齒修復(fù)后牙周圍組織不良反應(yīng)及炎癥風(fēng)險發(fā)生率的準(zhǔn)確預(yù)測，預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。本發(fā)明所述的用于齦溝液內(nèi)早期炎性反應(yīng)的液相芯片試劑盒具有無副作用、高通量、多指標(biāo)并行檢測、敏感度高、檢測快速、重復(fù)性好等優(yōu)點。該液相芯片試劑盒的制備方法簡單可靠、穩(wěn)定性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為檢測IL-1 β標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
[0042]圖2為檢測IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
[0043]圖3為檢測Osteocalcin標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
[0044]圖4為固定義齒修復(fù)不同時間齦溝液內(nèi)IL-1 β、IL_6、0steocalcin三種標(biāo)志物動態(tài)變化示意圖。
【具體實施方式】
[0045]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0046]實施例1用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒的制備
[0047]I試劑盒組成
[0048](I) 3-plex包被微球:含有分別包被了 IL-1 β捕獲抗體、IL_6捕獲抗體和Osteocalcin捕獲抗體的不同顏色編碼微球；
[0049](2) 3-plex生物素標(biāo)記檢測抗體:分別用生物素標(biāo)記的IL-1 β、IL-6和Osteocalcin的檢測抗體；
[0050](3)鏈親和素藻紅蛋白。
[0051]其中，所述的捕獲抗體分別為:IL_li3捕獲抗體，克隆號為P2H3 ;IL_6捕獲抗體，克隆號為B-E8 ;0steocalcin捕獲抗體，克隆號為1-22。
[0052]所述的檢測抗體分別為:IL-1 β檢測抗體，克隆號為ΕΡ408Υ ;IL_6檢測抗體，克隆號為E457 ；0steocalcin檢測抗體，克隆號為aa59_74。
[0053]2試劑盒的制備方法
[0054]包括以下步驟:
[0055]( I)相應(yīng)捕獲抗體包被相應(yīng)微球
[0056]a.取羧基微球用鏇潤振蕩器振蕩微球懸液20s,使微球混合均勻；
[0057]b.取羧基微球IX IO6個，轉(zhuǎn)移到離心管中，≥8000g離心2min，沉淀微球；
[0058]c.移走上清，加入dH20 100 μ 1，用漩渦振蕩器振蕩20s重懸微球，≥8000g離心2min，沉淀羧基微球；移走上清，加入IOOmmoI/L, pH值6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液80μ 1，用漩渦振蕩器振蕩20s，重懸洗滌的羧基微球；[0059]d.加入50mg/ml的N羥基硫代琥珀酰亞胺10 μ I，用漩渦振蕩器輕輕地振蕩；
[0060]e.加入50mg/ml的1-乙基-3 [3-( 二甲氨基)丙基]碳二亞胺10 μ I,用鏇潤振蕩器輕輕振蕩；
[0061]f.室溫孵育20min,每隔IOmin用鏇潤振蕩器輕振，≤8000g離心2min,沉淀活化
的羧基微球；
[0062]g.移走上清，加入50mmol/L，pH值5.0的2-0_嗎啡啉)乙磺酸，漩渦振蕩器振蕩20s，重懸活化的羧基微球，^ 8000g離心2min，沉淀洗滌后的羧基微球；重復(fù)該步驟2次，用50mmol/L，pH值5.0的MES洗滌2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩渦振蕩器振蕩20s,在混勻的微球中分別加入50 μ g IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕獲抗體,用50mmol/L，pH值5.0的MES定容至500 μ I，用漩渦振蕩器混勻；于室溫置于搖床上孵育2h，≤8000g離心2min，沉淀偶聯(lián)好的微球；
[0063]h.移走上清，加入PBS-TBN 300 μ 1，漩渦振蕩器振蕩30s ;于室溫置于搖床上孵育30min,≤8000g離心2min,沉淀偶聯(lián)好的微球；
[0064]1.移走上清,加入PBS-TBN Iml,鏇潤振蕩器振蕩30s,≤8000g離心2min,沉淀偶聯(lián)好的微球；重復(fù)該步驟I次，用PBS-TBN洗滌2次；
[0065]j.加入PBS-TBN Iml，重懸偶聯(lián)好且經(jīng)過洗滌的微球，即得IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕獲抗體分別與微球的偶聯(lián)體；
[0066]k.用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)微球的數(shù)量，濃度為2.5X105個/ml ;將偶聯(lián)好的微球置于
4°C避光保存；
[0067](2) IL-1 β、IL-6和Osteocalcin檢測抗體的生物素化
[0068]1.將 Img 的 IL-1 β、IL-6 和 Osteocalcin 檢測抗體分別用 0.lmol/L, pH 值 8.0的碳酸氫鈉緩沖液稀釋到lmg/ml，終體積為Iml ；
[0069]m.交互用0.lmol/L, pH值8.0的碳酸氫鈉緩沖液對蛋白質(zhì)充分透析；
[0070]η.用Iml 二甲基亞砜溶解N-羥琥珀酰亞氨活化生物素Img ；
[0071]ο.向Iml的IL-1 β、IL_6和Osteocalcin檢測抗體溶液中分別加入lg/L的NHSB溶液120 μ I ;在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4h ；
[0072]ρ.加入lmol/L NH4Cl溶液9.6 μ 1，在室溫下攪拌lOmin，在4°C下對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上Iml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集Iml/管，蛋白質(zhì)在l_3ml之間洗脫；樣品加入終濃度為0.5g/L的疊氮鈉及1.0g/L BSA ;將結(jié)合產(chǎn)物置于4 °C避光保存。
[0073]實施例2用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒的應(yīng)用
[0074]I實驗?zāi)康?br> [0075]對固定義齒修復(fù)不同時間患者齦溝液內(nèi)IL-1 β、IL-6、Osteocalcin三種標(biāo)志物聯(lián)合檢測。
[0076]2實驗對象
[0077]I)在知情同意及滿足納入條件的前提下，選擇入組病例，記錄個人基本信息。2)記錄患者固定義齒修復(fù)基本信息:包括治療前的缺失牙位、基牙數(shù)目、基牙牙周狀況、基牙松動度、咬合狀況、基牙同名牙狀況等。3)測定修復(fù)前(對照組)、修復(fù)后基牙GCF分泌量變化和所含因子的變化；使用濾紙條法采取患者治療前固定義齒基牙、基牙對側(cè)同名牙的齦溝液，每牙取6個位點:近頰、頰側(cè)正中、遠(yuǎn)頰、遠(yuǎn)舌、舌側(cè)正中、近舌；同時記錄牙周探診深度(PD)，牙齦指數(shù)(BI)，菌斑及軟垢指數(shù)；標(biāo)本至于-80°C冰箱中保存。
[0078]3試劑準(zhǔn)備
[0079]采用實施例1中制備的試劑盒。
[0080](I)Beads:將所需Beads (微球)超聲30秒，渦旋lmin，然后各取出60 μ I加入Mixing Bottle,剩余體積用Bead Diluent補足3ml,充分混勻，2-8 存一個月。
[0081](2) Quality Control:用250 μ I蒸懼水分別溶解對照I和2,顛倒多次使其充分混勻，靜止5-10min，然后分別移入兩個試管中，-20°C貯存一個月。
[0082](3) Standard:用250 μ I蒸懼水溶解Standard,顛倒多次使其充分混勻，靜止5-10min,然后移入試管中，標(biāo)記為S6。然后另取5個試管,分別標(biāo)記為S5、S4、S3、S2、SI,每個管中加200 μ I Assay緩沖液，最后從S6中取出50 μ I進(jìn)行梯度稀釋，_20°C貯存一個月。
[0083](4) Wash Buffer:將10XWB放置室溫，使其中鹽分充分溶解，30mlffB+270ml蒸餾水將其配成IX (I倍)，4°c保存一個月。
[0084](5) Serum Matrix:向SM中加入Iml蒸懼水使其充分溶解,靜止IOmin,然后移入試管里，_20°C貯存一個月。
[0085]實驗流程:
[0086]1、向96孔板中每孔加入200μ I Wash Buffer，室溫?fù)u十分鐘潤洗，然后直接倒掉，
充分擦干。
[0087]2、分別加入25 μ I
[0088]OSerum Matrix 到 Background、Standard 和 Control ；
[0089]OAssay Buffer 到樣品孔；
[0090]OAssay Buffer 到 Background ；
[0091]OStandard 和 Control 到各自位置；
[0092]@樣品到對應(yīng)樣品孔；
[0093]OBeads到每個孔,4°C避光過夜振蕩孵育。
[0094]3、洗板機洗2遍。
[0095]4、每孔加25 μ I檢測抗體,室溫避光搖lh。
[0096]5、每孔加25 μ I SAPE，室溫避光搖30min。
[0097]6、洗板機洗2遍,最后每孔加150 μ I鞘液上機(Luminex系統(tǒng))檢測。
[0098]圖1-圖3分別為檢測炎癥標(biāo)志物IL-1 β、IL-6和Osteocalcin的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。圖4為固定義齒修復(fù)不同時間齦溝液內(nèi)IL-1 β ,IL-6和Osteocalcin三種標(biāo)志物動態(tài)變化示意圖。
[0099]實驗結(jié)果表明，對齦溝液內(nèi)三個指標(biāo)的聯(lián)合檢測，可實現(xiàn)對固定義齒修復(fù)后牙周圍組織不良反應(yīng)及炎癥風(fēng)險發(fā)生率的準(zhǔn)確預(yù)測，預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。
[0100]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0101]參考文獻(xiàn):
【權(quán)利要求】
1.用于齦溝液內(nèi)炎癥標(biāo)志物檢測的液相芯片試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括:(I) 3-plex包被微球:含有分別包被了 IL-1 β捕獲抗體、IL-6捕獲抗體和Osteocalcin捕獲抗體的不同顏色編碼微球； (2)3-plex生物素標(biāo)記檢測抗體:分別用生物素標(biāo)記的IL-1 β、IL-6和Osteocalcin的檢測抗體；以及 (3)鏈親和素藻紅蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的捕獲抗體分別為:IL-li3捕獲抗體，克隆號為P2H3 ;IL-6捕獲抗體，克隆號為B-E8 ;Osteocalcin捕獲抗體，克隆號為1_22。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測抗體分別為:IL-li3檢測多克隆抗體，克隆號為EP408Y ；IL-6檢測多克隆抗體，克隆號為E457 ；Osteocalcin檢測多克隆抗體，克隆號為aa 59-74。
4.制備權(quán)利要求1-3任一項所述試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)相應(yīng)捕獲抗體包被相應(yīng)微球 a.取羧基微球用漩渦振蕩器振蕩微球懸液20s，使微球混合均勻； b.取羧基微球1X1O6個，轉(zhuǎn)移到離心管中，≥8000g離心2min，沉淀微球； c.移走上清，加入dH20100 μ 1，用漩渦振蕩器振蕩20s重懸微球，≥8000g離心2min，沉淀羧基微球；移走上清，加入100mmol/L，pH值6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液80 μ 1，用漩渦振蕩器振蕩20s，重懸洗滌的羧基微球； d.加入50mg/ml的N羥基硫代琥珀酰亞胺10μ 1，用漩渦振蕩器輕輕地振蕩； e.加入50mg/ml的1-乙基_3[3-( 二甲氨基)丙基]碳二亞胺10 μ 1，用漩渦振蕩器輕輕振蕩； f.室溫孵育20min,每隔IOmin用鏇潤振蕩器輕振，≥8000g離心2min,沉淀活化的羧基微球； g.移走上清，加入50mmol/L，pH值5.0的2-0-嗎啡啉)乙磺酸，漩渦振蕩器振蕩20s，重懸活化的羧基微球，≥ 8OOOg離心2min，沉淀洗滌后的羧基微球；重復(fù)該步驟2次，用.50mmol/L, pH值5.0的MES洗滌2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩渦振蕩器振蕩.20s,在混勻的微球中分別加入50 μ g IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕獲抗體，用50mmol/L，pH值5.0的MES定容至500 μ I，用漩渦振蕩器混勻；于室溫置于搖床上孵育2h，≥8000g離心2min，沉淀偶聯(lián)好的微球； h.移走上清，加入PBS-TBN300 μ 1，漩渦振蕩器振蕩30s ;于室溫置于搖床上孵育.30min,≥8000g離心2min,沉淀偶聯(lián)好的微球； .1.移走上清，加入PBS-TBN1ml，漩渦振蕩器振蕩30s，≥8000g離心2min，沉淀偶聯(lián)好的微球；重復(fù)該步驟I次，用I3BS-TBN洗滌2次； j.加入PBS-TBN 1ml，重懸偶聯(lián)好且經(jīng)過洗滌的微球，即得IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕獲抗體分別與微球的偶聯(lián)體； k.用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)微球的數(shù)量，濃度為2.5X IO5個/ml ;將偶聯(lián)好的微球置于4°C避光保存； (2)IL-1 β、IL-6和Osteocalcin檢測抗體的生物素化 .1.將 Img 的 IL-1 β、IL-6 和 Osteocalcin 檢測抗體分別用 0.lmol/L, pH 值 8.0 的碳酸氫鈉緩沖液稀釋到lmg/ml，終體積為Iml ； m.交互用0.lmol/L, pH值8.0的碳酸氫鈉緩沖液對蛋白質(zhì)充分透析； η.用Iml 二甲基亞砜溶解N-羥琥珀酰亞氨活化生物素Img ； ο.向Iml的IL-1 β、IL-6和Osteocalcin檢測抗體溶液中分別加入lg/L的NHSB溶液120 μ I ;在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4h ； P.加入lmol/L NH4Cl溶液9.6 μ 1，在室溫下攪拌lOmin，在4°C下對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上Iml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集Iml/管，蛋白質(zhì)在l-3ml之間洗脫；樣品加入終濃度為0.5g/L的疊氮鈉及1.0g/L BSA ;將結(jié)合產(chǎn)物置于4°C避光保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的捕獲抗體分別為:IL-li3捕獲抗體，克隆號為P2H3 ;IL-6捕獲抗體，克隆號為B-E8 ;Osteocalcin捕獲抗體，克隆號為1_22。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的檢測抗體分別為:IL-li3檢測多克隆抗體，克隆號為EP408Y ；IL-6檢測多克隆抗體，克隆號為E457 ；Osteocalcin檢測多克隆抗體，克隆號為aa 59-74。`
【文檔編號】G01N33/531GK103823054SQ201410049211
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月8日
【發(fā)明者】李茵, 張振庭 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院