一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片，其主要組成包括：(1)多種常見過敏原探針：含有分別包被了螨、蟑螂、豚草、艾蒿、狗毛、貓毛、大豆、花生、牛奶、雞蛋、蝦以及蟹過敏原提取物的12種熒光編碼微球；(2)生物素標(biāo)記的檢測抗體；(3)鏈親和素藻紅蛋白；以及在對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量檢測時才需要使用的(4)總IgE探針，即包被了小鼠抗人IgE單克隆抗體的熒光編碼微球。本發(fā)明還公開了上述液相芯片探針的制備方法。本發(fā)明所述液相芯片主要用于檢測血清樣品中的過敏原特異性IgE抗體，也可以用于檢測過敏原特異性IgG4抗體和總IgE抗體，具有使用樣品少，多個指標(biāo)平行檢測，高通量，靈敏度高等優(yōu)點。
【專利說明】一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥類免疫化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]過敏是一種常見病，世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)表明，20-40%的人都曾罹患過敏性疾病。它是由過敏原(或稱變應(yīng)原)誘發(fā)，并由結(jié)合于肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的IgE抗體所介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，即所謂的I型變態(tài)反應(yīng)。過敏原是一些外源性蛋白質(zhì)，在進入人體后可以與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上表面的IgE抗體結(jié)合，并引起過敏反應(yīng)。
[0003]過敏診斷包括臨床病史、皮膚試驗和過敏原特異性IgE檢測三部分，只有在三者一致的情況下，才能確診。過敏原特異性IgE抗體檢測，又稱為體外過敏原檢測，其目的是了解血液中針對某一特定過敏原的IgE抗體含量，從而推斷患者體內(nèi)的相關(guān)細胞是否可以與該過敏原結(jié)合，以便于過敏性疾病的診斷和治療。
[0004]目前廣為接受的過敏原特異性IgE抗體檢測方法均采用“夾心法”，其檢測流程和基本原理為:首先，將過敏原與固相支持物結(jié)合；之后，將患者血清樣品與固相支持物孵育，樣品中的過敏原特異性IgE抗體與固相支持物上的過敏原結(jié)合，形成“過敏原-1gE”復(fù)合物；然后，與攜帶有抗IgE抗體的報告分子孵育，形成“過敏原-1gE-報告分子”夾心復(fù)合物；最后，通過測量報告分子得到固相支持物上IgE的含量。
[0005]根據(jù)固相支持物和報告分子的不同，過敏原特異性IgE抗體檢測的方法可以分成三類:(I) ImmunoCAP法，由瑞典的Phadia公司開發(fā),使用纖維素衍生物為固相支持物，具有過敏原種類多，結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點，也是過敏原特異性IgE檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，不過價格相對昂貴；(2)酶聯(lián)免疫法或化學(xué)發(fā)光法，通常采用酶標(biāo)微孔板為固相支持物，報告分子分別為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，也是最常見的方法；以及(3)免疫印跡法及蛋白質(zhì)芯片法是將過敏原吸附到膜或玻璃上，通過過敏原在固相支持物上不同的位置來區(qū)分不同種的過敏原。方法(I)和(2)可以進行定量或半定量地檢測過敏原特異性IgE抗體，但是它們主要的技術(shù)缺點是每次反應(yīng)只能檢測一種指標(biāo)，并且使用血清樣品量較大。而方法(3)，雖然理論上一次可以檢測多個指標(biāo)，但是免疫化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在固相-液相之間，重復(fù)性差，靈敏度低，結(jié)果不穩(wěn)定，只能進行定性檢測，并且使用樣品量大。
[0006]在體內(nèi)除了 IgE抗體,IgG4抗體也可以特異性地結(jié)合過敏原。IgG4抗體在人IgG抗體的四個亞型中含量最低，通常只占IgG抗體總數(shù)的6%左右。與其它的IgG亞型相比較，IgG4誘導(dǎo)補體能力和細胞活化性偏低，因此過敏原特異性IgG4抗體具有免疫調(diào)節(jié)功能，對過敏原特異性IgG4抗體進行檢測也具有重要的臨床意義。
[0007]過敏原的種類繁多，已知的過敏原超過兩萬種；最常見的過敏原就有六十多種，可以大致分為:(1)食物類過敏原，包括肉蛋奶、糧食和水果等；以及(2)吸入類或接觸類過敏原，包括花粉、動物皮毛、昆蟲、霉菌孢子等。由于過敏原種類繁多，過敏的確診比較困難，所以理想的體外過敏原檢測應(yīng)當(dāng)具有篩查性質(zhì)，即對十幾種或幾十種過敏原進行系統(tǒng)性篩查，這樣才能有助于疾病的確診。但是通常的過敏原特異性IgE抗體檢測方法，例如ImmunoCAP法、酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法，每次反應(yīng)只能獲得一個指標(biāo)；如果要檢測多個指標(biāo)，則需要多個反應(yīng)來完成，不僅浪費時間與勞動力，同時消耗了大量的樣品與試劑，檢測成本相對較高。因此，從醫(yī)療需求看，體外過敏原檢測迫切需要采用多重檢測技術(shù)，也就是每個檢測反應(yīng)，可以同時檢測多個指標(biāo)，從而降低成本，省力，省時。
[0008]液相芯片技術(shù)(或稱xMAP技術(shù))是由美國Luminex公司開發(fā)的一種多功能多重檢測技術(shù)平臺，可以對生物分子進行高通量、多重檢測。液相芯片技術(shù)中，固相支持物是帶有熒光物質(zhì)編碼的羧基化聚苯乙烯微球，根據(jù)平臺的不同，微球分別有100種(雙色編碼)或500種(三色編碼)。使用時，首先將微球與相關(guān)生物分子進行化學(xué)偶聯(lián)獲得探針；檢測時，將探針與待測物反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物通過液相芯片儀的檢測通道，使用不同波長的激光分別讀取微球的編碼以及待測樣本上的報告分子(藻紅蛋白)，實現(xiàn)對樣品中待測分子的定量分析。同經(jīng)典的免疫化學(xué)方法相比較，液相芯片法有三點優(yōu)勢:(1)使用微米直徑的微球，將免疫化學(xué)反應(yīng)體系由傳統(tǒng)的液相-固相反應(yīng)改變?yōu)榻咏锵到y(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的液相反應(yīng)體系，具有反應(yīng)速度快、重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)點；(2)多個指標(biāo)的并行檢測，可以同時檢測數(shù)百個指標(biāo)；由于常見的過敏原有六十余種，該技術(shù)適合于體外過敏原篩查；以及(3)使用樣本少，每次反應(yīng)只需要數(shù)十微升的血清。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]目的:針對現(xiàn)有體外過敏原檢測手段一次只能檢測一種指標(biāo)的技術(shù)不便和未能滿足的臨床診斷需求，本發(fā)明提供一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片及其制備方法，該液相芯片主要用于檢測樣品中的過敏原特異性IgE抗體，也可以用于檢測過敏原特異性IgG4抗體以及總IgE抗體，為過敏性疾病的診斷提供了一種全面、準(zhǔn)確、方便的臨床檢測手段。
[0010]技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0011]一、一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片包括:
[0012]A:過敏原探針:所述過敏原探針為一種單獨使用或多種選擇性地組合使用；每種過敏原探針為分別包被了一種過敏原提取物的熒光微球，不同種類的過敏原探針分別具有不同的熒光編碼；一般常用的為12種過敏原探針:含有分別包被了螨、蟑螂、豚草、艾蒿、狗毛、貓毛、大豆、花生、牛奶、雞蛋、蝦、蟹過敏原提取物的12種微球。
[0013]B:生物素標(biāo)記的抗IgE檢測抗體或生物素標(biāo)記的抗IgG4檢測抗體，分別用來檢測結(jié)合到過敏原探針探針上的IgE抗體或IgG4抗體；當(dāng)對人血清樣品進行檢測時，使用生物素標(biāo)記的抗人IgE或抗人IgG4檢測抗體；當(dāng)需要對動物(例如犬類)的血清樣品進行檢測時，使用生物素標(biāo)記的抗該種動物IgE的檢測抗體或抗該種動物相當(dāng)于人IgG4的IgG亞類的檢測抗體；
[0014]C:報告分子:鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE)或鏈親和素Cy3。
[0015]所述液相芯片用于半定量或定量檢測過敏原特異性IgE抗體時，還包括:D --總IgE探針，即抗人IgE單克隆抗體包被的熒光微球，用于準(zhǔn)備IgE標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016]由于液相芯片本身的技術(shù)特點，即(I)探針可以自由選擇和組合；(2)檢測抗體可以更換；(3)報告分子也可以更換，因此本發(fā)明所述液相芯片在使用時可以根據(jù)具體情況靈活地加以組合和簡化。例如，a)如果只檢測部分過敏原特異性抗體，可以只使用一種過敏原探針或多種過敏原探針的任意組合；b)當(dāng)對樣品中的過敏原特異性IgE進行定性測量時，可以不使用IgE標(biāo)準(zhǔn)曲線，此時可以單獨使用過敏原探針，不使用總IgE探針；c)當(dāng)對樣品中的過敏原特異性IgG4進行定性測量時，可以單獨使用過敏原探針和生物素標(biāo)記的抗IgG4檢測抗體；d)如果只檢測樣品中的總IgE抗體含量，可以單獨使用總IgE探針，不使用過敏原探針。
[0017]二、本發(fā)明也提供一種上述用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片中過敏原探針和/或總IgE探針的制備方法，包括以下步驟:
[0018](I) Ia:當(dāng)制備過敏原探針時，準(zhǔn)備過敏原溶液:將過敏原提取物完全溶解于緩沖溶液中形成過敏原溶液，并測定其蛋白質(zhì)含量；緩沖溶液為0.05M的MES緩沖液，其pH值為
5.5-6.5 ;或者為0.0lM磷酸鹽PBS緩沖液，其pH值為7.2-7.4 ；
[0019]Ib:當(dāng)制備總IgE探針時,準(zhǔn)備抗體溶液:將抗人IgE抗體對緩沖溶液反復(fù)透析，并測定其蛋白質(zhì)含量；
[0020](2)微球活化:
[0021]一取適量羧基化熒光編碼微球，在≥8000g離心2-3分鐘，吸棄上清；
[0022]一將微球重新懸浮于超純水中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理20-60秒，在≥8000g離心2-3分鐘，吸棄上清；
[0023]一將微球懸浮于pH值為5.5-6.5,0.05M-0.2M的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖溶液(MES緩沖液)中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理20-60秒，在≥ 8000g離心2_3分鐘，吸棄上清；
[0024]一將微球懸浮于上述MES緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，經(jīng)超聲波分散處理20_60秒后，分別加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽(Sulf0-NHS)溶液和過量新鮮配置的50mg/ml水溶性碳二亞胺(EDC)溶液；在室溫下，避光孵育20-30分鐘，每5分鐘將其溫和地顛倒混勻；孵育完成后在> SOOOg離心2-3分鐘，吸棄上清；
[0025]一將微球懸浮于上述MES緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，經(jīng)超聲波分散處理后，在≥8000g離心2-3分鐘，吸棄上清；重復(fù)該步驟；
[0026](3)微球包被:
[0027]—在包被過敏原探針時，將活化后的微球懸浮于與過敏原溶液相同的緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理20-60秒；
[0028]一在包被總IgE探針時，將活化后的微球懸浮于與抗體溶液相同的緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理20-60秒；
[0029]一向微球中加入設(shè)定量的過敏原或者抗體，室溫下避光混勻2-4小時，其后在≥8000g離心2-3分鐘，吸棄上清；
[0030]—將包被后的微球懸浮于上述緩沖液中，潤旋震蕩20-30秒,超聲波分散處理,在≥8000g離心2-3分鐘，吸棄上清；重復(fù)該步驟；
[0031](4)微球的封閉與保存:
[0032]一將微球懸浮并避光保存于含有牛血清白蛋白的貯存液中；
[0033]一本發(fā)明中將經(jīng)過包被與封閉并可以在后續(xù)檢測中使用的微球稱為探針，將各種探針通過血球計數(shù)板計數(shù)，使用時依據(jù)檢測需求混合。
[0034]作為優(yōu)選方案，所述步驟(I)中的緩沖溶劑為50_100mM的MES緩沖液，其pH值為
5.5-6.5 ;或者為0.0lM PBS緩沖液，其pH值為7.2-7.4。
[0035]作為優(yōu)選方案，所述步驟(I)中的過敏原為過敏原提取物凍干粉，先將其溶解于上述MES緩沖液中，獲得蛋白質(zhì)濃度> 0.lmg/ml的過敏原溶液；如果過敏原提取物凍干粉在上述條件下不溶解，可將其溶解于上述PBS緩沖液中，獲得蛋白質(zhì)濃度> 0.lmg/ml的過敏原溶液。
[0036]作為優(yōu)選方案，所述步驟(I)中，將抗人IgE抗體對上述PBS緩沖液透析三次，如果有必要，將抗體溶液濃縮到蛋白質(zhì)濃度> 0.lmg/ml ο
[0037]作為優(yōu)選方案，所述步驟(2)中如果使用I X 106-6.25X IO6個熒光微球，應(yīng)將其懸浮于0.48ML的50mM MES緩沖液(pH5.5-6.5)中，經(jīng)超聲分散處理后，加入10 μ I的50mg/ml氮羥基琥拍酰亞胺磺酸鹽(Sulfo-NHS)溶液,混勻后加入10 μ I的50mg/ml水溶性碳二亞胺(EDC)溶液；和/或，超聲分散處理的時間為20-60秒，超聲波頻率為20KHz。
[0038]作為優(yōu)選方案，所述步驟(3)中活化后的熒光微球首先應(yīng)當(dāng)懸浮于與制備過敏原溶液/抗體溶液相同的緩沖溶液中，再向懸浮的微球中加入一定量的過敏原/抗體。如果使用I X 106-6.25 X IO6個熒光微球，偶聯(lián)反應(yīng)體積為0.5ml。
[0039]作為優(yōu)選方案，所述步驟(3)中，微球數(shù)量與加入的過敏原溶液的對應(yīng)關(guān)系為:每IXlO6個微球?qū)?yīng)含有1.0-2.0y g蛋白質(zhì)的過敏原溶液；微球數(shù)量與加入的抗體溶液的對應(yīng)關(guān)系為--每IX IO6個微球?qū)?yīng)含有1.0-2.0yg蛋白質(zhì)的抗體溶液；
`[0040]作為優(yōu)選方案，所述步驟⑷中，貯存液的溶劑為pH值為7.2-8.0，濃度為0.0IM-0.05M的PBS緩沖溶液；其中含有0.1-1.0wt %牛血清白蛋白，0.01-0.05wt % Bi溫-20和0.1-0.5wt%疊氮鈉；所述PBS緩沖溶液為含0.8wt% NaCl的磷酸鹽緩沖液。
[0041]三、本發(fā)明還提供了一種將上述液相芯片用于過敏原特異性抗體或總IgE抗體的檢測方法，包括以下步驟:
[0042]步驟(a)微球與待測抗體結(jié)合:
[0043]一如果需要檢測血清中的多種過敏原特異性抗體(IgE或IgG4)，將2_50 μ I血清與過敏原探針混合孵育。如果樣品中存在過敏原特異性抗體，它們與相應(yīng)的過敏原探針結(jié)合，洗去沒有與探針結(jié)合的抗體和雜質(zhì)蛋白質(zhì)；
[0044]—如果需要檢測血清中的總IgE抗體，將0.5-2 μ I血清與總IgE探針孵育，樣品中的IgE抗體被總IgE探針捕獲，洗去雜質(zhì)蛋白質(zhì)；
[0045]步驟(b)準(zhǔn)備總IgE抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0046]—當(dāng)對樣品中的過敏原特異性IgE抗體或者總IgE抗體進行定量或半定量檢測時，需要準(zhǔn)備總IgE抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線:將IgE標(biāo)準(zhǔn)品與總IgE探針孵育，IgE標(biāo)準(zhǔn)品與總IgE探針結(jié)合，洗去雜質(zhì)蛋白質(zhì)；
[0047]一如果對樣品中的過敏原特異性IgE抗體或者過敏原特異性IgG4抗體進行定性檢測時，則步驟(b)可以省略；
[0048]步驟(C)探針與檢測抗體和報告分子的結(jié)合:
[0049]一將步驟(a) (b)中得到的探針與生物素標(biāo)記的檢測抗體孵育，檢測抗體與探針?biāo)东@的待測抗體結(jié)合，洗去沒有結(jié)合的檢測抗體；[0050]一將結(jié)合了檢測抗體的探針與鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE)孵育，通過生物素與鏈親和素的高度特異性的結(jié)合，SA-PE與探針結(jié)合，洗去沒有與探針結(jié)合的SA-PE ；
[0051]按照上述流程，將樣品與多種過敏原探針反應(yīng)，如果加入抗IgE檢測抗體/SA-PE，最終形成多種“過敏原探針一過敏原特異性IgE —檢測抗體/SA-PE”復(fù)合物；將樣品與多種過敏原探針反應(yīng)，如果加入抗IgG4檢測抗體/SA-PE，最終形成多種“過敏原探針一過敏原特異性IgG4 —檢測抗體/SA-PE”復(fù)合物；將IgE標(biāo)準(zhǔn)品與總IgE探針反應(yīng)，加入抗IgE檢測抗體/SA-PE，形成“總IgE探針一 IgE標(biāo)準(zhǔn)品一檢測抗體/SA-PE”復(fù)合物；將樣品與總IgE探針反應(yīng)，加入抗IgE檢測抗體/SA-PE，形成“總IgE探針一樣品IgE —檢測抗體/SA-PE ”復(fù)合物。
[0052]步驟(d)使用Luminex系列液相芯片儀讀取微球數(shù)據(jù):
[0053]一將上述各探針微球懸浮于分析緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理；
[0054]一儀器讀取微球的顏色編號以及SA-PE的熒光強度中位值(MFI)；
[0055]作為優(yōu)選方案，所述步驟(a) (b)中，每種過敏原探針和總IgE探針的使用數(shù)目均在500個-5000個之間，并且每種過敏原探針和總IgE探針的使用數(shù)目相等。如果需要對檢測指標(biāo)進行定量或半定量檢測，則每種探針的使用數(shù)目應(yīng)當(dāng)保持恒定，更優(yōu)選地，每種探針的使用數(shù)目應(yīng)當(dāng)相等。
[0056]作為優(yōu)選方案，所述步驟(a)中，如果檢測血清中的過敏原特異性IgE抗體含量，血清量用量為20 μ I，如果進行過敏原特異性IgG4檢測，血清量用量為5 μ I，如果檢測總IgE含量，血清量用量為1μ I ;所述步驟(C)中，抗IgE檢測抗體和抗IgG4檢測抗體的使用濃度均為 0.2-1.0 μ g/ml，SA-PE 的使用濃度是 1.0-2.5 μ g/ml ；
[0057]四、本發(fā)明還提供一種對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量測量的方法，包括以下步驟:
[0058]I)以IgE標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的微球熒光強度中位值MFI為縱坐標(biāo)作圖，獲得五參數(shù)擬合曲線(5PL)，即MFI=A+(D/(1+(X/C) ~B) ~E)，其中MFI為微球熒光強度中位值，A、B、C、D、E為方程式參數(shù)，可通過相關(guān)軟件計算得到；
[0059]2)將待測IgE的MFI值代入方程式，就可計算得到待測IgE的含量(X值)，所用公式為 X=C {[D/ (MF1-A) ] ~ (1/E)-1} ~ (1/B)；
[0060]3)根據(jù)上述計算得到的IgE的含量-X值和血清樣品稀釋倍數(shù)，計算出樣品中過敏原特異性IgE抗體或總IgE抗體的濃度。
[0061]微球的MFI值與待測指標(biāo)的含量符合五參數(shù)擬合曲線(5PL)，由于該曲線為非線性方程，因此僅憑MFI值只能進行定性測量。如果要對待測指標(biāo)進行半定量或定量檢測，應(yīng)當(dāng)首先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常情況下，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用與待測指標(biāo)一致的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品獲得，但是在過敏原特異性IgE檢測中，過敏原特異性IgE抗體標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得。本發(fā)明中，為了獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用總IgE探針和IgE標(biāo)準(zhǔn)品替代過敏原探針和過敏原特異性IgE抗體標(biāo)準(zhǔn)品，這一方法是基于以下認知，
[0062]一首先，通過微球的顏色編號可以辨別檢測項目；例如，使用艾蒿過敏原提取物包被21號微球，則21號微球反映的指標(biāo)是艾蒿過敏原特異性抗體；
[0063]一每個微球的MFI值取決于該微球結(jié)合了多少檢測抗體和報告分子，所以MFI值與微球捕獲抗體的量呈正相關(guān)，而與微球捕獲抗體的方式無關(guān)。換句話說，在同一檢測中，如果一個過敏原探針微球與一個總IgE探針微球的MFI值相等，則過敏原探針?biāo)Y(jié)合過敏原特異性IgE分子的數(shù)目等于總IgE探針?biāo)Y(jié)合的IgE分子數(shù)目；
[0064]—當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)中探針的使用數(shù)目與待測反應(yīng)中每種探針的使用數(shù)目相等時，IgE標(biāo)準(zhǔn)品和待測IgE抗體被等分于相同數(shù)目的微球上，則可以通過IgE標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測探針上IgE的量。
[0065]有益效果:本發(fā)明提供了一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片及其制備方案，I)在探針制備(微球包被)上，現(xiàn)有的探針制備方案普遍使用純化的蛋白質(zhì)為偶聯(lián)原料，而本發(fā)明使用的偶聯(lián)原料是蛋白質(zhì)粗提物:其蛋白質(zhì)含量只占總質(zhì)量的1/5-1/8，雜質(zhì)成分復(fù)雜且含量高，因此制備過敏原探針的技術(shù)難度較大；2)采用本發(fā)明所述的液相芯片，使用數(shù)十微升血清樣品就可以檢測12種過敏原特異性IgE抗體、IgG4抗體和總IgE抗體，為過敏性疾病的診斷提供了一種全面、準(zhǔn)確、方便的臨床檢測手段。由于可以通過指尖采血的方式獲得足夠量的血清完成各種指標(biāo)的檢測，本發(fā)明極大地方便了嬰幼兒患者。
[0066]與金標(biāo)準(zhǔn)ImmunoCap法相比較，本方案除了可以一次同時檢測多個指標(biāo)的優(yōu)點外，檢測中使用的試劑 量少，其成本遠低于ImmunoCap法。與常見的酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光檢測等方法相比較，本方案除了具有使用樣品量少，可以一次同時檢測多個指標(biāo)的優(yōu)點外，反應(yīng)環(huán)境均接近體內(nèi)環(huán)境，有利于保持生物大分子的天然空間構(gòu)象，抗原一抗體反應(yīng)更快更完全，所以檢測靈敏度更高，線形范圍更寬，重復(fù)性更好。
[0067]本發(fā)明所公布的技術(shù)方案中的各項工藝參數(shù)，例如多種過敏原探針和總IgE探針的制備、反應(yīng)過程等均建立于大量的試驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，為制備過程與反應(yīng)過程的最佳的參數(shù)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0068]圖1為本發(fā)明具體實施例2和3中的IgE標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以IgE標(biāo)準(zhǔn)品的濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以微球MFI的對數(shù)值為縱坐標(biāo)。
【具體實施方式】
[0069]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0070]實施例1:本發(fā)明所述的用于檢測過敏原特異性抗體的液相芯片的組成
[0071]本實施例中，各種溶液的配方如下:
[0072]分析緩沖液，即PBS 中含 0.1%BSA, 0.025%Tween-20,0.05%NaN3, ρΗ7.4。
[0073]
【權(quán)利要求】
1.一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片包括: A:過敏原探針:所述過敏原探針為一種單獨使用或多種選擇性地組合使用；每種過敏原探針為分別包被了一種過敏原提取物的熒光微球，不同種類的過敏原探針分別具有不同的熒光編碼； B:生物素標(biāo)記的抗IgE檢測抗體或生物素標(biāo)記的抗IgG4檢測抗體，分別用來檢測結(jié)合到過敏原探針上的IgE抗體或IgG4抗體；當(dāng)對人血清樣品進行檢測時，使用生物素標(biāo)記的抗人IgE或抗人IgG4檢測抗體；當(dāng)需要對動物的血清樣品進行檢測時，使用生物素標(biāo)記的抗該種動物IgE的檢測抗體或抗該種動物相當(dāng)于人IgG4的IgG亞類的檢測抗體； C:報告分子:鏈親和素藻紅蛋白SA-PE或鏈親和素Cy3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片用于對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量檢測時，還包括:D:總IgE探針:抗人IgE單克隆抗體包被的熒光微球，用于準(zhǔn)備IgE標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片，其特征在于，所述過敏原探針和/或總IgE探針的制備方法，包括以下步驟: (O Ia:當(dāng)制備過敏原探針時，準(zhǔn)備過敏原溶液:將過敏原提取物凍干粉完全溶解于緩沖溶液中形成過敏原溶液，并測定其蛋白質(zhì)含量；所述緩沖溶液為0.05M的MES緩沖液，其pH值為5.5-6.5 ;或者為0.0lM磷酸鹽PBS緩沖液，其pH值為7.2-7.4 ； Ib:當(dāng)制備總IgE探針時，準(zhǔn)備抗體溶液:將抗人IgE抗體對0.0lM磷酸鹽緩沖液反復(fù)透析，并測定其蛋白質(zhì)含量； (2)微球活化: 一取適量羧基化微球，離心并吸棄上清；將微球重新懸浮于超純水中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理，離心并吸棄上清；將微球懸浮于pH值為5.5-6.5，含0.05M-0.2M的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖溶液中，渦旋震蕩20-30秒，經(jīng)超聲波分散處理后，離心并吸棄上清； 一將微球懸浮于上述MES緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，經(jīng)超聲波分散處理后，分別加入過量新鮮配置的50mg/mL氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽即Sulf0-NHS和過量新鮮配置的使用的50mg/mL水溶性碳二亞胺即EDC溶液；在室溫下，避光孵育20_30min，每5分鐘將其溫和地顛倒混勻；孵育完成后離心并吸棄上清； 一將微球懸浮于上述MES緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，經(jīng)超聲波分散處理后，離心并吸棄上清；重復(fù)該步驟； (3)微球包被:將活化后的微球懸浮于對應(yīng)的MES緩沖液或PBS緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理； -向微球中加入設(shè)定量的過敏原溶液或者抗體溶液，室溫下避光孵育2-4h，其后離心移去上清; 一將包被后的微球懸浮于MES緩沖液或PBS緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理，離心并吸棄上清；重復(fù)該步驟； (4)微球的封閉與保存: 一將包被好的微球懸浮并保存于含有牛血清白蛋白的貯存液中； 一每種包被與封閉好并可以在后續(xù)檢測中使用的微球稱為探針，探針通過血球計數(shù)板計數(shù)，使用時依據(jù)檢測需求比例混合。
4.一種對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量測量的方法，包括以下步驟: 1)以IgE標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的微球熒光強度中位值MFI為縱坐標(biāo)作圖，獲得五參數(shù)擬合曲線，即MFI=A+(D/(1+(X/C) -B) -E)，其中MFI為微球熒光強度中位值，A、B、C、D、E為方程式參數(shù)，可通過相關(guān)軟件計算得到； 2)將待測血清樣品的MFI值代入方程式，就可計算得到待測IgE的含量，即X值，所用公式為 X=C {[D/ (MF1-A) ] - (1/E)-1} - (1/B)； 3)根據(jù)上述計算得到的IgE的含量-X值和血清樣品稀釋倍數(shù)，計算出樣品中過敏原特異性IgE抗體或總IgE抗體的濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量測量的方法其特征在于: 一使用總IgE探針和IgE標(biāo)準(zhǔn)品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計算過敏原特異性IgE抗體的含量； 一在檢測反應(yīng)中，總IgE探針的使用數(shù)目和每種過敏原探針的使用數(shù)目相等或為已知比例。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量測量的方法其特征在于:每種過敏原探針和總IgE探針的使用數(shù)目均在500個-5000個之間，并且每種過敏原探針和總IgE探針的使用數(shù)目相等。
【文檔編號】G01N33/533GK103454412SQ201310420276
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】程愛陽 申請人:南京博敏達生物科技有限公司