專利名稱：：一種檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法。
背景技術(shù)：
：HPV是一種小型無包膜DNA病毒，具有雙鏈閉環(huán)的DNA基因組，7.2-8kb，相對分子量5xl06，HPV基因組可分為3個區(qū)域非編碼的上游調(diào)節(jié)區(qū)，早期開放讀碼框，包括E6、E7、El、E2、E4、E5，晚期開放讀碼區(qū)Ll(主要衣殼蛋白)和L2(小衣殼蛋白)。根據(jù)編碼衣殼蛋白Ll的開放讀碼框(ORF)基因序列不同進(jìn)行分型，Ll區(qū)ORF的差異小于60。/。分為不同的屬，在60-70%之間分為不同的種，差異位于71-89%則分為不同的型別，目前已鑒定的HPV約有130多型，根據(jù)病毒致病力大小，分為高危型，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73等，可致宮頸上皮內(nèi)瘤病變(cervicalintraepithelial,CN),多見于高齡婦女，不易自然緩解,與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系密切，低危型HPV有HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44等，多見于年輕婦女,自然緩解率高。通過對HPV基因分型^r測，可以將不同HPV型別感染與宮頸病變的關(guān)系研究得更深入，有很高的學(xué)術(shù)研究價值。目前HPV檢測多是采用通過美國食品和藥物管理局認(rèn)證的第二代雜交捕獲法(HC2)，此種方法檢測13種高危型HPV,但不能分型、不能檢測多重感染。現(xiàn)有的基于HPV核酸雜交技術(shù)的檢測產(chǎn)品，準(zhǔn)確率有限，通量低，成本高，且多數(shù)的探針為RNA，可能會影響反應(yīng)的穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明實施例所要解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，旨在解決現(xiàn)有檢測方法不能分型、不能檢測多重感染、準(zhǔn)確率有限，以及通量低，成本高，且因為探針為RNA，可能會影響反應(yīng)的穩(wěn)定性的問題。本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，待檢測人類乳頭瘤病毒基因為HPV6、HPVll、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一種或幾種，包括如下步驟(1)根據(jù)所選擇的待檢測HPV基因型別通用引物序列的變異位點，修改GP5十/GP6+通用引物，設(shè)計出針對每型的擴增引物，在每一特異型別的擴增引物3，位置有12個堿基的完全匹配，且該擴增引物均帶了10個堿基acgttggatg的標(biāo)簽序列；設(shè)計延伸引物，該延伸引物的長度為17-28堿基，在延伸引物的3，端末位包括延伸堿基在內(nèi)的4個堿基中，包涵一個型特異多態(tài)位點標(biāo)記；延伸引物選擇的位置是GP5十/GP6+序列中相對保守的區(qū)域；(2)通過PCR擴增，獲得含有所述突變位點的輩巴序列擴增產(chǎn)物；(3)通過SAP酶處理，除去所述擴增產(chǎn)物中含有的dNTPs;(4)通過延伸反應(yīng)，在延伸引物的3，端連接一個堿基，得到的延伸產(chǎn)物與所述延伸引物之間分子量差異不小于9D，且各個型別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于9D;(5)釆用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；(6)將純化后的產(chǎn)物采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，確定所選擇的待檢測HPV基因型別。與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)i普(MALDI-TOF-MS)系統(tǒng)進(jìn)行檢測，在質(zhì)譜技術(shù)中使用的試劑耗材相對簡單且相對穩(wěn)定，不需要熒光染料、特殊的酶等價格昂貴的試劑，反應(yīng)可以在微量體系中進(jìn)行，減少樣品和各種消耗品的使用。由于質(zhì)i普技術(shù)直接檢測DNA的分子量(質(zhì)荷比)，直接確定堿基的類型，不需要經(jīng)過任何形式的信號轉(zhuǎn)換，理論上只要有一個拷貝的SNP片斷被擴增即可識別，杜絕了假陽性發(fā)生的可能。此外質(zhì)譜技術(shù)還有自動化、高通量檢測特點，質(zhì)i普技術(shù)與多引物延伸技術(shù)相結(jié)合，可以在一個反應(yīng)體系中同時檢測多型HPV,PCR反應(yīng)可以在微量體系中進(jìn)行，結(jié)合DNA自動提取設(shè)備、多重PCR引物設(shè)計軟件及數(shù)據(jù)分析軟件，大大減輕了工作量，提高了檢測通量。另外，質(zhì)譜分型系統(tǒng)從引物設(shè)計的角度適合進(jìn)行HPV檢測。質(zhì)譜系統(tǒng)要求前PCR的產(chǎn)物在100-180bp的范圍內(nèi)為最佳，HPV在L1區(qū)通用引物GP5+ZGP6+大約擴增140bp的片段產(chǎn)物，且擴增有效性已經(jīng)得到證實。此方法中修改后的引物GP5+/GP6+擴增的產(chǎn)物長度滿足質(zhì)譜對前PCR產(chǎn)物片段長度的要求。質(zhì)譜系統(tǒng)延伸反應(yīng)中要求延伸引物與延伸產(chǎn)物之間,各個型別的延伸產(chǎn)物間的譜系統(tǒng)中能彼此區(qū)分，也能滿足質(zhì)譜系統(tǒng)的要求，因此，可以同時檢測出上述17型HPV基因。圖1表示HPV6、HPVll、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73型別的HPV延伸弓1物峰圖2表示HPV6分析結(jié)果圖3表示HPV11分析結(jié)果圖4表示HPV16分析結(jié)果圖5表示HPV18分析結(jié)果圖6表示HPV31分析結(jié)果圖7表示HPV33分析結(jié)果圖8表示HPV35分析結(jié)果圖9表示HPV39分析結(jié)果圖10表示HPV45分析結(jié)果圖；圖11表示HPV51分析結(jié)果圖；圖12表示HPV52分析結(jié)果圖；圖13表示HPV56分析結(jié)果圖；圖14表示HPV58分析結(jié)果圖；圖15表示HPV59分析結(jié)果圖；圖16表示HPV66分析結(jié)果圖；圖17表示HPV68分析結(jié)果圖；圖18表示HPV73分析結(jié)果圖；圖19表示HBB分析結(jié)果圖。具體實施例方式為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實施例提供的檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，待檢測人類乳頭瘤病毒基因為HPV6、HPVll、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一種或幾種，包括如下步驟(1)根據(jù)所選擇的待檢測HPV基因型別通用引物序列的變^;位點，修改GP5+ZGP6+通用引物，設(shè)計出針對每型的擴增引物，在每一特異型別的擴增引物3，位置有12個堿基的完全匹配，且該擴增引物均帶了10個堿基acgttggatg的標(biāo)簽序列；設(shè)計延伸引物，延伸引物的長度為17-28堿基，在延伸引物的3'端末位包括延伸堿基在內(nèi)的4個堿基中，包涵一個型特異多態(tài)位點標(biāo)記；延伸引物選擇的位置是GP5十/GP6+序列中相對保守的區(qū)域；所述延伸引物與延伸產(chǎn)物之間，各個型別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于9D。各型HPV擴增引物序列見表l。對應(yīng)HPV延伸引物序列^;量見表2。擴增引物為PAGE純化，延伸引物為HPLC純化。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)通過PCR擴增，獲得含有所述突變位點的靶序列擴增產(chǎn)物'PCR擴增反應(yīng)試劑的配置見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>反應(yīng)條件為94。C，15min;94。C變性20s，56。C退火30s,72。C延伸1min,共擴增45循環(huán)；最終72。C延伸3min。(3)通過SAP消化酶(蝦堿性磷酸酶)處理，除去所述擴增產(chǎn)物中含有的dNTPs。SAP消化酶反應(yīng)體系見表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>反應(yīng)條件為37。C孵育40分鐘，去除反應(yīng)中剩余的dNTP;85°C5分鐘使SAP酶失活。(4)通過延伸反應(yīng)，在延伸引物的3'端連接一個堿基，得到的延伸產(chǎn)物與所述延伸引物之間分子量差異不小于9D，且各個型別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于9D。延伸反應(yīng)體系見表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*其中延伸反應(yīng)mix按照各型引物的分子量大小進(jìn)行線性關(guān)系調(diào)整。反應(yīng)條件為94。C，30s;94。C變性5s,52。C退火5s,80。C延伸5s，共擴增40循環(huán)，在每個循環(huán)中退火和延伸進(jìn)行5個小循環(huán)；最終72°C延伸3min。(5)采用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物。(6)將純化后的產(chǎn)物采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，確定待檢測HPV基因型別。圖1-19中，圖中橫坐標(biāo)表示各型延伸引物和產(chǎn)物的分子量大小，其中左邊的虛線表示延伸引物分子量所在位置(由于完全消耗，所以無峰型)，右邊虛線表示延伸產(chǎn)物分子量所在位置(由于有延伸，所有有峰型)；縱坐標(biāo)表示引物的信號強度。用TYPE4.0軟件閱讀峰圖及導(dǎo)出數(shù)據(jù)。在沒有感染的情況下，每一型HPV和內(nèi)參HBB都有在質(zhì)譜不同的質(zhì)量處都有延伸引物的峰圖；在有HPV感染的情況下，相對的HPV有延伸產(chǎn)物的峰圖。在一個樣本中可檢測多重感染。峰圖報告結(jié)果分為4種A:結(jié)果可靠；B:中度可靠；C:一般可靠；D:低度可靠。前三種視為該延伸反應(yīng)有效，有相應(yīng)HPV感染，第四種由于質(zhì)i普峰圖基線不平而致，視為無HPV感染。具體的樣本中要根據(jù)樣本信息和質(zhì)譜峰圖具體分析。本實施例中還包括HPV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備。使用Ll區(qū)特異引物將包含HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73型的L1區(qū)基因片段的擴增產(chǎn)物純化后，分別連接到PMD-T載體(TakaraPMD-T連接試劑盒)，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，LB固體培養(yǎng)基平板涂布培養(yǎng)1214小時，通過藍(lán)白斑篩選挑選單克隆二次擴大培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(AXYGEN)提取并純化質(zhì)粒，通過DNA測序鑒定為陽性的質(zhì)粒。將制備好的HPV6,11,16，18，31,33,35，39,45,51,52，56,58,59,68,66,73質(zhì)粒分別測定OD值，再根據(jù)OD值將質(zhì)粒稀釋500pg,5pg,O.Spg三種濃度的存儲液。然后根據(jù)摩爾公式lng質(zhì)粒的拷貝數(shù)-[lng*l(T9/2*330*(載體分子量+插入片斷分子量)]*6.02*1023計算出lng的拷貝數(shù)，根據(jù)這個值將質(zhì)粒梯度稀釋為105,104,5000，103,102,10、opies/ul6個濃度梯度進(jìn)行靈敏度驗證。HPV標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度檢測。HPV標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為105，104,5000，103，102，10copies/d6個濃度梯度進(jìn)行靈敏度驗證。HPV11,33,35，45,51,52,58，66，68靈敏度為50copies/ul;HPV16,18,31靈敏度為50copies/ul;HPV6,39,56,59,73靈敏度為100copies/ul。本實施例中還包括HPV對照品選擇和制備。HPV18重組質(zhì)粒(250c叩ies/ul)為陽性對照，并摻入10ng/ul的經(jīng)檢測無HPV感染人基因組DNA背景。HPV陰性對照為無菌雙蒸水和鼠肝。在反應(yīng)中加入設(shè)計的陽性對照和陰性對照。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)參見表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>所有的檢測中三個質(zhì)控項目均為正常時，視結(jié)果有效，否則本實施例中HPV基因型檢測內(nèi)參以(3-球蛋白基因(HBB)作為內(nèi)部參照基因，監(jiān)測DNA模板的質(zhì)量和PCR擴增反應(yīng)的質(zhì)量。通用引物序列為SEQIDNO.l1acgttggatgACACAACTGTGTTCACTAGSEQIDN0.24acgttggatgCAACTTCACCCACGTTCACC,延伸引物序列為SEQIDNO.42GGTAGGGCAGATTTCC。本發(fā)明基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜，具有高靈敏度，高特異性和高通量的特點，且相對于其它的檢測方法成本低。本發(fā)明適應(yīng)于HPV感染基因型與腫瘤相關(guān)性的研究，HPV感染的大規(guī)4莫的流行病學(xué)調(diào)查以及宮頸疾病發(fā)生和發(fā)展的監(jiān)測。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，待檢測人類乳頭瘤病毒基因型為HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一種或幾種，包括如下步驟(1)根據(jù)所選擇的待檢測HPV基因型別通用引物序列的變異位點，修改GP5+/GP6+通用引物，設(shè)計出針對每型的擴增引物，在每一特異型別的擴增引物3’位置有12個堿基的完全匹配，且該擴增引物均帶了10個堿基acgttggatg的標(biāo)簽序列；設(shè)計延伸引物，延伸引物的長度為17-28堿基，在延伸引物的3’端末位包括延伸堿基在內(nèi)的4個堿基中，包涵一個型特異多態(tài)位點標(biāo)記；延伸引物選擇的位置是GP5+/GP6+序列中相對保守的區(qū)域；(2)通過PCR擴增，獲得含有所述突變位點的靶序列擴增產(chǎn)物；(3)通過SAP酶處理，除去所述擴增產(chǎn)物中含有的dNTPS；(4)通過延伸反應(yīng)，在延伸引物的3’端連接一個堿基，得到的延伸產(chǎn)物與所述延伸引物之間分子量差異不小于9D，且各個型別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于9D；(5)采用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；(6)將純化后的產(chǎn)物采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，確定待檢測HPV基因型別。2、如權(quán)利要求1所述檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述步驟(1)中待檢測HPV基因型別的相應(yīng)擴增引物的序列為SEQIDNO.lHPV18/66正向引物SEQIDNO.2HPV16正向引物SEQIDNO.3HPV31/33/52正向引物SEQIDNO.4HPV35/68正向引物SEQIDNO.5HPV39/45正向引物SEQIDNO.6HPVll/6正向引物SEQIDN0.7HPV59/73正向引物SEQIDNO.8HPV51正向引物SEQIDNO.9HPV58正向引物SEQIDNO.10HPV56正向引物SEQIDNO.12HPV16/18/45/68反向引物SEQIDNO.13HPV39/6反向引物SEQIDNO.14HPV52反向引物SEQIDNO.15HPV35反向引物SEQIDNO.16HPV31反向引物SEQIDNO.17HPV73/11反向引物SEQIDNO.18HPV33反向引物SEQIDNO.19HPV51反向引物SEQIDNO.20HPV59反向引物SEQIDN0.21HPV58反向引物SEQIDNO.22HPV66反向引物SEQIDNO.23HPV56反向引物延伸引物序列為SEQIDN0.25HPV16SEQIDNO.26HPV18SEQIDNO.27HPV31SEQIDNO.28HPV33SEQIDNO.29HPV35SEQIDNO.30HPV39SEQIDNO.31HPV45SEQIDNO.32HPV51SEQIDNO.33HPV52SEQIDNO.34SEQIDNO.35SEQIDN0.36SEQIDN0.37SEQIDN0.38SEQIDN0.39SEQIDNO.40HPV6HPV59HPV58HPV66HPV68HPV56HPV73SEQIDN0.41HPV113、如權(quán)利要求2所述檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述步驟(l)中以p-球蛋白基因作為內(nèi)部參照基因，采用的擴增引物序列為SEQIDNO.l1和SEQIDNO.24,延伸引物序列為SEQIDN0.42。4、如權(quán)利要求2或3所述檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述擴增引物為PAGE純化，所述延伸引物為HPLC純化。5、如權(quán)利要求1所述檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，其特征在于，還包括在反應(yīng)中加入陽性對照和陰性對照，所述陽性對照HPV18重組質(zhì)粒，并摻入經(jīng)檢測無HPV感染人基因組DNA背景，所述陰性對照為無菌雙蒸水和鼠肝DNA。6、如權(quán)利要求1所述檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，其特征在于，還包括HPV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備步驟，以及采用該標(biāo)準(zhǔn)品對引物特異性和靈敏度進(jìn)行測試的步驟，所述HPV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為插入人類乳頭瘤病毒MY09/MY11序列的PMD質(zhì)粒。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測人類乳頭瘤病毒基因型的方法，待檢測基因為17型HPV中的一種或幾種，包括如下步驟(1)根據(jù)所選擇的待檢測HPV基因型別通用引物序列的變異位點，設(shè)計出針對每型的擴增引物；設(shè)計每型特異的延伸引物；(2)PCR擴增；(3)SAP酶處理；(4)延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物與所述延伸引物之間，各個型別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于9D；(5)采用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；(6)質(zhì)譜檢測，確定待檢測HPV基因型別。采用本發(fā)明提供的方法，解決了現(xiàn)有某些檢測方法不能分型、不能檢測多重感染、準(zhǔn)確率有限，以及通量低，成本高，且因為探針為RNA，可能會影響反應(yīng)的穩(wěn)定性的問題。文檔編號C12Q1/70GK101435002SQ20081021833公開日2009年5月20日申請日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者平吳,爽喻,張俊青,李晶晶,玲楊,威王,揚高申請人:深圳華大基因科技有限公司