專利名稱：針對(duì)乙型肝炎病毒和人乳頭瘤病毒的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的疫苗制劑、制備它們的方法及所述疫苗制劑在治療中的應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明涉及適合于給予青少年的聯(lián)合疫苗。
乳頭瘤病毒是高度種特異性的小DNA腫瘤病毒。迄今已描述了超過70種獨(dú)特的人乳頭瘤病毒(HPV)基因型。HPV通常對(duì)皮膚(例如HPV-1和HPV-2)或者對(duì)粘膜表面(例如HPV-6和HPV-11)是特異性的，且常常引起持續(xù)達(dá)幾個(gè)月或幾年的良性腫瘤(疣)。對(duì)有關(guān)的個(gè)人，這樣的良性腫瘤可能是令人苦惱的，但不會(huì)是威脅生命的，不過有些是例外。
某些HPV也與癌癥有關(guān)。HPV和人類癌癥之間的最強(qiáng)的正相關(guān)是存在于HPV-16及HPV-18與宮頸癌之間的關(guān)系。在發(fā)展中國家里，宮頸癌是最常見的惡性腫瘤；世界上每年大約有500,000個(gè)新病例出現(xiàn)?，F(xiàn)在，在技術(shù)上可行的是用疫苗主動(dòng)地和原發(fā)性HPV-16感染作斗爭(zhēng)、以及甚至與確認(rèn)的包含HPV-16的癌作斗爭(zhēng)。有關(guān)于防備HPV-16的預(yù)防性接種和治療性接種之前景的綜述，參見Cason J.，Clin.Irmmunother.1994；1(4)293-306和Hagenesee M.E.，Infections in Medicine 1997 14(7)555-556，559-564。
今天，已分離出不同類型的HPV，且借助于細(xì)菌中的克隆系統(tǒng)及新近通過PCR的擴(kuò)增，已鑒定了它們的特征。在與充分表征的牛1型乳頭瘤病毒(BPV1)之基因組的分子組構(gòu)進(jìn)行比較的基礎(chǔ)上，確定了所述HPV基因組的分子組構(gòu)。
特別關(guān)注的其它的人乳頭瘤病毒血清型是31、33和45。
雖然發(fā)生較少的變異，但是，所描述的所有HPV基因組至少有7種早期基因即E1至E7，以及至少有兩種晚期基因L1和L2。另外，一個(gè)上游的調(diào)節(jié)區(qū)包含著似乎控制所述HPV基因組的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄事件的調(diào)節(jié)序列。
E1和E2基因分別涉及病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄控制；且E1和E2基因往往會(huì)由于病毒的整合而被破壞。E6和E7涉及病毒轉(zhuǎn)化，近來證據(jù)暗示E5也涉及病毒轉(zhuǎn)化。
就與宮頸癌有關(guān)的HPV例如HPV16及HPV18而言，在病毒DNA整合后，開始致癌過程。所述的整合導(dǎo)致編碼衣殼蛋白L1和L2的基因失活，并導(dǎo)致建立起兩種早期蛋白E6和E7的連續(xù)超量表達(dá)，所述的超量表達(dá)將導(dǎo)致正常的細(xì)胞分化的逐步喪失及癌的形成。
宮頸癌在婦女中是常見的，且通過癌變前的中間階段發(fā)展到常常導(dǎo)致死亡的侵襲性癌。該病的所述中間階段被稱為宮頸上皮內(nèi)瘤；且根據(jù)嚴(yán)重程度的增加，將所述中間階段分成I至III級(jí)。
臨床上，女性肛生殖道的HPV感染表現(xiàn)為宮頸扁平濕疣，宮頸扁平濕疣的標(biāo)志是主要影響宮頸鱗狀上皮的表層細(xì)胞和中間細(xì)胞的中空細(xì)胞病。
作為病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)結(jié)果的中空細(xì)胞表現(xiàn)為具有一個(gè)核周透明暈的多核細(xì)胞。異常角質(zhì)化使上皮變厚，造成病變的疣狀外觀。
如果這類扁平濕疣是HPV-16血清型或HPV-18血清型陽性的，則由于扁平濕疣朝著本身被認(rèn)為是侵襲性宮頸癌癌前病變的宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN)和原位癌(CIS)發(fā)展，因而是高度危險(xiǎn)的因素。
WO 96/19496公開了人乳頭瘤病毒E6蛋白和E7蛋白的變異體，尤其是在E6蛋白和E7蛋白中都有一個(gè)缺失的E6/E7融合蛋白。據(jù)說這些缺失的融合蛋白是免疫原性的。
在WO94/00152、WO94/20137、WO93/02184和WO94/05792中公開了基于HPVL1的疫苗。這樣的一種疫苗可包含作為單體的所述L1抗原、一種衣殼?；蛞环N病毒樣顆粒。這樣的粒子可另外包含L2蛋白。例如在WO93/00436中描述了基于L2的疫苗。其它的HPV疫苗基于早期蛋白，例如E7、或例如L2-E7的融合蛋白。
用于預(yù)防乙型肝炎傳染、包含一種或更多種乙型肝炎抗原的疫苗是眾所周知的。例如，運(yùn)用SmithKline Beecham Biologicals的疫苗Engerix-B(商標(biāo))預(yù)防乙型肝炎。這種疫苗包含乙型肝炎表面抗原(具體為在Harford等，Postgraduate Medical Joumal，1987，63(增刊2)，第65-70頁中描述的226個(gè)氨基酸的S-抗原)；且用氫氧化鋁作為佐劑配制這種疫苗。
需要有效的聯(lián)合疫苗以預(yù)防青少年特別易患的疾病。
本發(fā)明提供一種疫苗組合物，所述組合物包含與一種佐劑結(jié)合的(a)一種乙型肝炎病毒(HBV)抗原；及(b)一種人乳頭瘤病毒(HPV)抗原；該佐劑為TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激物。
本發(fā)明疫苗組合物給予青少年是非常有益的，青少年可能尤其有HBV和/或HPV感染的危險(xiǎn)。
本發(fā)明的疫苗組合物可任意選擇地另外包括下文描述的許多其它抗原中的一種或更多種。
已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物出人意外地沒顯示出干擾；也就是說，針對(duì)本發(fā)明組合物中每種抗原的免疫應(yīng)答，與通過結(jié)合作為TH1細(xì)胞應(yīng)答優(yōu)先刺激物的佐劑單獨(dú)給予每種抗原而獲得的免疫應(yīng)答基本上一樣。
同樣得自SmithKline Beecham Biologicals的疫苗Havrix(商標(biāo))是可以用來預(yù)防甲型肝炎傳染的疫苗的一個(gè)實(shí)例。用氫氧化鋁作為佐劑來配制它。這種疫苗包括一種用甲醛溶液(甲醛)滅活的甲型肝炎病毒HM-175的減毒株；參見Andre等的論文(Prog.med.Virol.，第37卷，第1-24頁)。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語甲型肝炎病毒(HAV)抗原用來表示來源于甲型肝炎病毒的一種蛋白或HAV的一種減毒株，該減毒株可任意選擇地是例如用甲醛滅活的減毒株。如果所述HAV抗原是一種來源于甲型肝炎病毒的蛋白，則它可以任選地為一種重組蛋白。
疫苗Twinrix(商標(biāo))是重組的乙型肝炎抗原和前面提到的滅活的減毒甲型肝炎病毒的組合?？梢杂迷撘呙鐏硗瑫r(shí)防御甲型肝炎與乙型肝炎。
歐洲專利0 339 667(Chemo Sero)描述了使一種甲型肝炎抗原和一種乙型肝炎抗原混合而制造一種聯(lián)合疫苗的一般概念。在該說明書中，據(jù)說所使用的佐劑不是關(guān)鍵性的它應(yīng)當(dāng)僅能夠增強(qiáng)免疫活性至所需程度而不引起任何副作用。認(rèn)為可以使用鋁凝膠，特別是氫氧化鋁凝膠和磷酸鋁凝膠。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種疫苗組合物，所述組合物包含與一種佐劑結(jié)合的(a)一種乙型肝炎病毒(HBV)抗原，(b)一種人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，及(c)一種甲型肝炎病毒(HAV)抗原；該佐劑為TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激物。
這樣的疫苗給予青少年是非常有益的，青少年可能尤其有HBV和/或HPV感染、和/或HAV感染的危險(xiǎn)。
免疫應(yīng)答可以大致分成兩個(gè)極端類型體液免疫應(yīng)答或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(傳統(tǒng)上分別根據(jù)保護(hù)作用的抗體機(jī)制和細(xì)胞效應(yīng)物機(jī)制來加以鑒定)。已把這些類型的應(yīng)答稱為TH1型應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和TH2型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
可根據(jù)抗原特異性的單倍型限制的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生以及天然殺傷性細(xì)胞的應(yīng)答，來鑒定極端的TH1型免疫應(yīng)答。就小鼠而論，通常根據(jù)IgG2a亞型抗體的產(chǎn)生來鑒定TH1型應(yīng)答；而就人類而言，這些對(duì)應(yīng)于IgG1型抗體。TH2型免疫應(yīng)答的特征在于產(chǎn)生一系列免疫球蛋白的同種型，在小鼠中包括IgG1。
可以認(rèn)為，這兩種類型免疫應(yīng)答發(fā)生的推動(dòng)力是細(xì)胞因子。高水平的TH1型細(xì)胞因子往往會(huì)有助于誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的、對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答；而高水平的TH2型細(xì)胞因子往往會(huì)有助于誘導(dǎo)針對(duì)所述抗原的體液免疫應(yīng)答。
TH1型免疫應(yīng)答和TH2型免疫應(yīng)答的區(qū)別不是絕對(duì)的。事實(shí)上，個(gè)體將支持被稱作主要是TH1或主要是TH2的免疫應(yīng)答。無論如何，根據(jù)由Mosmann和Coffman(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2細(xì)胞不同的淋巴因子分泌型式導(dǎo)致不同的功能特性。Annual Review ofImmunology，7，第145-173頁)就鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆描述的內(nèi)容，考察細(xì)胞因子家族通常是方便的。傳統(tǒng)上，TH1型應(yīng)答與由T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子干擾素-γ有關(guān)。通常與誘導(dǎo)TH1型免疫應(yīng)答直接相關(guān)的其它細(xì)胞因子不是由T-細(xì)胞產(chǎn)生的；所述細(xì)胞因子例如IL-12。比較起來，TH2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)的分泌有關(guān)。
已知某些疫苗佐劑特別適合于激發(fā)TH1型細(xì)胞因子應(yīng)答或TH2型細(xì)胞因子應(yīng)答。傳統(tǒng)上，接種或感染之后免疫應(yīng)答的TH1∶TH2平衡的最佳指標(biāo)包括在用抗原再刺激后，由T淋巴細(xì)胞在體外產(chǎn)生TH1細(xì)胞因子或TH2細(xì)胞因子的直接測(cè)量結(jié)果；和/或抗原特異性抗體應(yīng)答的IgG1∶IgG2a之比率的測(cè)量結(jié)果(至少就小鼠而論)。
因此，TH1型佐劑是這樣一種物質(zhì)，當(dāng)在體外用抗原再刺激后，該物質(zhì)刺激分離的T-淋巴細(xì)胞群體產(chǎn)生高水平的TH1型細(xì)胞因子，并且誘發(fā)與TH1型同種型有關(guān)的抗原特異性免疫球蛋白應(yīng)答。
在國際專利申請(qǐng)第WO 94/00153號(hào)和第WO 95/17209號(hào)中描述了能夠優(yōu)先刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑。
3脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A(monophosphoryl lipid A)(3D-MPL)就是一種這樣的佐劑?？蓮腉B 2220211(Ribi)了解這種佐劑。在化學(xué)上，它是一種具有4、5或6條酰化鏈的3脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A的混合物，由Ribi Immunochem Montana制造。在歐洲專利0 689 454 B1(SmithKlineBeecham Biologicals SA)中公開了3脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A的一種優(yōu)選形式。
3D-MPL的微粒最好是小到足以通過一張0.22微米的膜而被過濾除菌(如在歐洲專利第0 689 454號(hào)中所述)。3D-MPL將以每劑10μg-100μg、且優(yōu)選25μg-50μg的范圍存在，其中所述抗原一般將以每劑2-50μg的范圍存在。
另一種優(yōu)選的佐劑包含一種來源于皂樹Quillaja Saponaria Molina樹皮、經(jīng)Hplc純化的無毒級(jí)分QS21。可任意選擇地將這種QS21與3脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)和任選的一種載體混合。
在美國專利第5,057,540號(hào)中公開了QS21的生產(chǎn)方法。
先前已描述了包含QS21的非反應(yīng)原性佐劑制劑(WO 96/33739)。已經(jīng)證明當(dāng)與一種抗原一起配制這樣的包含QS21和膽固醇的制劑時(shí)，這樣的制劑是成功的TH1激發(fā)佐劑。因此，構(gòu)成本發(fā)明一部分的疫苗組合物可包括QS21和膽固醇的組合。
作為TH1細(xì)胞應(yīng)答優(yōu)先刺激物的另外的佐劑包括免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸，例如在WO 96/02555中公開的未甲基化的CpG序列。
當(dāng)提供一種作為TH1細(xì)胞應(yīng)答之優(yōu)先刺激物的佐劑的時(shí)侯，也考慮了不同的TH1激發(fā)佐劑(例如在上文提到的那些佐劑)的組合。例如，QS21可以與3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比率一般將約為1∶10至10∶1，優(yōu)選1∶5至5∶1，且通常大體上為1∶1。適合于最適協(xié)同作用的優(yōu)選范圍是2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。
在根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物中最好也存在一種載體。所述載體可以是一種水包油乳狀液，或是一種諸如磷酸鋁或氫氧化鋁之類的鋁鹽。
一種優(yōu)選的水包油乳狀液包含一種可代謝的油，例如角鯊烯、α-生育酚和吐溫80。另外，所述水包油乳狀液可包含span 85和/或卵磷脂和/或甘油三辛酸酯。
在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，將根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物中的抗原與3D-MPL及明礬混合。
通常，對(duì)于給予人類，QS21和3D-MPL將以每劑1μg-200μg的范圍存在于疫苗中；例如它們將以每劑10-100μg且優(yōu)選每劑10-50μg的范圍存在于疫苗中。通常，所述的水包油將包含2-10％的角鯊烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的吐溫80。角鯊烯α-生育酚的優(yōu)選比率等于1或小于1，因?yàn)檫@提供更穩(wěn)定的乳狀液。span 85也可以以1％的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗還包含一種穩(wěn)定劑可能是有益的。
無毒的水包油乳狀液最好包含在水性載體中的一種例如角鯊烯或角鯊?fù)榈臒o毒油、一種例如吐溫80的乳化劑。該水性載體可以例如是磷酸緩沖鹽溶液。
在WO 95/17210中描述了在一種水包油乳狀液中包含QS21、3D-MPL和生育酚的一種特別有效的佐劑制劑。
本發(fā)明組合物中的所述HPV抗原最好來源于HPV 16和/或HPV18、或者HPV 6和/或HPV 11、或者HPV 31、HPV 33或HPV 45。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的疫苗組合物中的所述HPV抗原包含HPV的主要衣殼蛋白L1，且可任選地包含L2蛋白，特別是來自HPV 16和/或HPV 18的上述蛋白。在這個(gè)實(shí)施方案中，L1蛋白的優(yōu)選形式是截短的L1蛋白。該L1最好是呈病毒樣顆粒(VLP)的形式?？梢詫⑺鯨1蛋白融合到另一種HPV蛋白上，尤其是融合到E7上，從而形成L1-E7融合體。特別優(yōu)選包括L1-E或L1-L2-E的嵌合病毒樣顆粒。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中的所述HPV抗原來源于E6蛋白或E7蛋白，特別是來源于連接到一種具有T細(xì)胞表位的免疫融合配偶體上的E6或E7。
在本發(fā)明這個(gè)實(shí)施方案的一種優(yōu)選形式中，所述免疫融合配偶體來源于流感嗜血菌B(Heamophilus influenza B)的蛋白D。所述蛋白D的衍生物最好包含該蛋白大約前1/3，尤其是包含N-末端的約前100-110個(gè)氨基酸。
在本發(fā)明這個(gè)實(shí)施方案中的優(yōu)選融合蛋白包括蛋白D-來自HPV16的E6、蛋白D-來自HPV 16的E7、蛋白D-來自HPV 18的E7和蛋白D-來自HPV 18的E6。所述蛋白D部分最好包含蛋白D的前1/3。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述HPV抗原呈L2-E7融合體的形式，特別是來自HPV 6和/或HPV 11的L2-E7融合體。
優(yōu)選在大腸桿菌中表達(dá)本發(fā)明的蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)具有組氨酸尾的所述蛋白，所述組氨酸尾包含5-9個(gè)組氨酸殘基，優(yōu)選包含6個(gè)組氨酸殘基。這些組氨酸殘基在幫助純化方面是有益的。在同時(shí)待審的GB 9717953.5號(hào)英國專利申請(qǐng)中，全面描述了這樣蛋白的制造說明。
可以使所述疫苗組合物中的HPV抗原吸附到Al(OH)3上。優(yōu)選使所述L1 VLP吸附到Al(OH)3上。
本發(fā)明的組合物中的乙型肝炎病毒(HBV)抗原一般是乙型肝炎表面抗原。
已有大量的文獻(xiàn)資料記載了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的制備。參見例如，Harford等，Develop.Biol.Standard 54，第125頁(1983)；Gregg等，Biotechnology 5，第479頁(1987)；EP-A-0 226 846；EP-A-0 299 108以及在其中的參考文獻(xiàn)。
當(dāng)用于本文時(shí)，在本文縮寫成‘HBsAg’或‘HBS’的表述‘乙型肝炎表面抗原’，包括任一HBsAg抗原或顯示HBV表面抗原之抗原性的其片段。人們會(huì)明白除了226個(gè)氨基酸序列的HBsAg S抗原(參見Tiollais等，Nature，317，489(1985)以及在其中的參考文獻(xiàn))外，如果需要，本文描述的HBsAg可包含在上面參考文獻(xiàn)中和在EP-A-0 278 940中描述的完整的或部分的前-S序列。本文描述的HBsAg也可指變異體，例如在WO 91/14703中描述的‘逃逸(escgpe)突變體’。在另一個(gè)方面，所述HBsAg可包含一種在歐洲專利申請(qǐng)第0 414 374號(hào)中描述為L(zhǎng)*的蛋白，亦即這樣一種蛋白，其氨基酸序列由乙型肝炎病毒大(L)蛋白(ad亞型或ay亞型)氨基酸序列的多個(gè)部分組成，其特征在于該蛋白的氨基酸序列由以下任一個(gè)組成(a)所述L蛋白的殘基12-52，后接殘基133-145，再后接殘基175-400；(b)所述L蛋白的殘基12，后接殘基14-52，后接殘基133-145，再后接殘基175-400。
HBsAg也可指在EP 0 198 474或EP 0 304 578中描述的多肽。
所述HBsAg通常呈顆粒狀態(tài)。它可以只包含S蛋白，或者可作為復(fù)合顆粒，例如(L*，S)，其中L*是如同上文釋義的且S表示乙型肝炎表面抗原之S-蛋白。
可以如WO 93/24148中描述的，使該HBsAg吸附于磷酸鋁。
用于本發(fā)明制劑中的乙型肝炎(HBV)抗原最好是用于商品Engerix-B(商標(biāo)；SmithKline Beecham Biologicals)中的HBsAg S-抗原。
在歐洲專利申請(qǐng)0 633 784中描述了一種包含與3D-MPL結(jié)合的乙型肝炎表面抗原的疫苗。
現(xiàn)在描述來自另外病原體的、可被包含在按照本發(fā)明之組合物中的抗原的實(shí)例。
作為皰疹病毒群中一員的EB病毒(EBV)在人類中引起作為原發(fā)性疾病的傳染性單核細(xì)胞增多癥。它主要影響兒童或年輕人。普通成人人口的90％以上被EBV感染，EBV終身存留在外周B-淋巴細(xì)胞中。該病毒終身在腮腺中產(chǎn)生，且主要通過來自排出該病毒個(gè)體的唾液交換而傳播。感染EBV的兒童大部分是無癥狀的或有很輕微的癥狀，而被感染的青少年和成人則產(chǎn)生典型的傳染性單核細(xì)胞增多癥，其特征為發(fā)熱、咽炎以及腺病。已被感染的人在他們生命的剩余時(shí)間里保持抗-EBV的抗體，因此對(duì)進(jìn)一步的感染是免疫的。
除了EBV的傳染特性外，已證明EBV使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成快速分裂的細(xì)胞，因此與包括非洲伯基特淋巴瘤(BL)在內(nèi)的幾種不同的淋巴瘤有關(guān)。EBV也可參與引起鼻咽癌(NPC)。在世界范圍內(nèi)，估計(jì)有80,000鼻咽癌病例發(fā)生，且鼻咽癌在人種學(xué)的中國人種群中是更普遍的。傳染性單核細(xì)胞增多癥是EBV原發(fā)性感染的結(jié)果。如果不存在另外的危險(xiǎn)因素，則傳染性單核細(xì)胞增多癥不是威脅生命的疾病。
已描述了構(gòu)成EBV病毒被膜的、所謂膜抗原復(fù)合物的四種蛋白。通常將它們稱為gp 220/350或gp 250/350或者簡(jiǎn)稱為gp 250或gp 350(參見EP-A-151079)。有令人信服的證據(jù)表明，gp 350和gp 250誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，且針對(duì)gp 350和gp 250的抗體具有中和能力。因此，這些蛋白是可能的EBV疫苗的候選物。有關(guān)gp 250/350在預(yù)防和治療與EBV相關(guān)疾病方面之應(yīng)用的進(jìn)一步資料，參見EP 0 173 254。
主要的EBV表面糖蛋白gp350/220通過與細(xì)胞膜蛋白CD21相互作用而感染人的靶細(xì)胞。在人體中，gp350/220是EBV中和抗體的主要靶，且已表明gp350/220的某些形式保護(hù)人類抵抗EBV相關(guān)疾病。雖然可使用其它的保護(hù)性抗原，但按照本發(fā)明的疫苗組合物最好包含EBV的gp350。
HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體。HSV-2和HSV-1(唇皰疹的病原體)的特征在于其主要在神經(jīng)元之神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中既誘發(fā)急性疾病、又建立潛伏感染的能力。
僅在美國，估計(jì)大約500萬人發(fā)生生殖器皰疹，每年記錄有50萬臨床病例(原發(fā)性感染和復(fù)發(fā)性感染)。原發(fā)性感染一般發(fā)生在青春期之后，其特征為局部出現(xiàn)有持續(xù)2至3周的疼痛性皮膚病變。在原發(fā)性感染之后的接下來的六個(gè)月內(nèi)，50％的患者將經(jīng)歷該病的一次復(fù)發(fā)。大約25％的患者每年可經(jīng)歷10-15次該病的復(fù)發(fā)性發(fā)作。在免疫妥協(xié)的患者中，高頻復(fù)發(fā)的發(fā)生率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于正?；颊呷后w中的發(fā)生率。
HSV-1和HSV-2病毒都有許多位于病毒表面的糖蛋白組分。這些組分稱為gB、gC、gD和gE等等。
當(dāng)在本發(fā)明組合物中包括HSV抗原時(shí)，所述HSV抗原最好來源于HSV-2，通常為糖蛋白D。糖蛋白D位于該病毒的膜上，也可見于受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(Eisenberg R.J.等，J of Virol 1980，35，428-435)。它由393個(gè)氨基酸組成，包括一段信號(hào)肽，分子量大約為60kD。在所有的HSV被膜糖蛋白中，這種糖蛋白大概是表征得最為清楚的(Cohen等，J.ofVirology60，157-166)。在體內(nèi)，已知糖蛋白D在病毒附著到細(xì)胞膜方面起重要作用。此外，已表明糖蛋白D能夠在體內(nèi)激發(fā)中和抗體(Eing等，J.Med.Virology 12759-65)。然而，盡管在所述患者的血清中存在高效價(jià)的中和抗體，但潛伏的HSV-2病毒仍可被再激活并誘導(dǎo)該病復(fù)發(fā)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，存在一種截短的、308個(gè)氨基酸的HSV-2糖蛋白D，所述糖蛋白D包括天然存在的糖蛋白的1至306號(hào)氨基酸，并且在缺乏其膜錨區(qū)的該截短蛋白之C末端添加天冬酰胺及谷氨酰胺。所述蛋白的這種形式包括信號(hào)肽；切去該信號(hào)肽，則產(chǎn)生一種283個(gè)氨基酸的成熟蛋白。在Genentech的歐洲專利EP-B-139 417里描述了在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生一種這樣的蛋白。
在本發(fā)明的疫苗制劑中，優(yōu)選使用重組的成熟HSV-2糖蛋白D的截短物，且將其稱為rgD2t。
在WO 92/16231中描述了與佐劑3D-MPL聯(lián)合的這種HSV-2抗原的組合。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明疫苗組合物另外包括一種水痘帶狀皰疹病毒抗原(VZV抗原)。適合于在所述疫苗制劑中包含的VZV的抗原包括由Longnecker等描述的gpI-V(Longnecker等，Prog Natl Acad Sci USA 84，4303-4307(1987))。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用gpI(參見Ellis等，美國專利4,769,239)。也參見0 405 867 B1號(hào)歐洲專利。
在另一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明的疫苗組合物另外包括人巨細(xì)胞病毒(HCMV)抗原。HCMV是一種屬于皰疹病毒科的、人DNA病毒。在世界的大多數(shù)地方，HCMV是地方病的病毒。在兩種群體之中，HCMV導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)疾病。HCMV是新生兒中先天缺陷的一個(gè)主要原因。有危險(xiǎn)的第二個(gè)群體是免疫妥協(xié)患者，例如受到HIV感染的那些患者和經(jīng)受移植的那些患者。臨床上該病引起各種各樣的癥狀，包括發(fā)熱、肝炎、肺炎和傳染性單核細(xì)胞增多癥?？晒┽槍?duì)HCMV的疫苗用的一種優(yōu)選抗原是WO 95/31555中描述的gB685**。在WO 94/00150(City of Hope)中描述的一種HCMV基質(zhì)蛋白pp65也提供可供HCMV疫苗用的免疫原。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的疫苗組合物另外包含一種VZV抗原和一種HCMV抗原兩者，特別是上面描述的那些抗原。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的疫苗組合物另外包含一種鼠弓形體(Toxoplasma gondii)抗原。鼠弓形體是一種在包括人類在內(nèi)的溫血?jiǎng)游镏幸鸸误w病的專性細(xì)胞內(nèi)原生動(dòng)物寄生物。雖然它在健康個(gè)體中通常是無臨床癥狀的；但在懷孕婦女和免疫妥協(xié)患者中，弓形體病可以引起嚴(yán)重的并發(fā)癥?？晒┽槍?duì)鼠弓形體的疫苗用的一種優(yōu)選抗原是在WO96/02654中描述的SAGl(也稱為P30)或是在WO92/11366中描述的Tg34。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的疫苗組合物另外包括和一種鼠弓形體抗原聯(lián)合的一種VZV抗原或一種HCMV抗原，特別是上面描述的那些抗原。
在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明疫苗組合物是一種多價(jià)疫苗，例如一種四價(jià)疫苗或一種五價(jià)疫苗。
在誘發(fā)保護(hù)性免疫方面，甚至用很低劑量的抗原(例如低到5μg的rgD2t)，本發(fā)明的制劑也是非常有效的。
它們提供針對(duì)原發(fā)性感染的極好保護(hù)，且有利地既刺激特異性的體液(中和抗體)免疫應(yīng)答、又刺激效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的(DTH)免疫應(yīng)答。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種本文描述的、供醫(yī)學(xué)治療之用的疫苗制劑，特別是提供供治療或預(yù)防人乳頭瘤病毒感染及乙型肝炎病毒感染之用的疫苗制劑。
本發(fā)明的疫苗將包含免疫保護(hù)量的所述抗原，且可以用常規(guī)技術(shù)來制備本發(fā)明的疫苗。
在Pharmaceutical Biotechnology，Vol.61，Vaccine Design-the subunitand adjuvant approach，Powell和Newman編輯，Plenum Press，1995中，以及在New Trends and Developments in Vaccines，Voller等編輯，UniversityPark Press，Baltimore，Maryland，美國，1978中，全面地描述了疫苗的制備。例如，F(xiàn)ullerton的美國專利4,235,877描述了在脂質(zhì)體內(nèi)的包封。例如，Likhite的美國專利4,372,945和Armor等的美國專利4,474,757公開了將蛋白結(jié)合到大分子上。
每劑疫苗中的蛋白量選擇為在典型的疫苗中誘發(fā)免疫保護(hù)性應(yīng)答而無顯著不良副作用的量。這樣的量將根據(jù)使用哪一種特定的免疫原而變化。通常，預(yù)期每一劑將包含1-1000μg的蛋白，優(yōu)選2-100μg，最優(yōu)選包含4-40μg的蛋白?？赏ㄟ^涉及觀測(cè)抗體效價(jià)及受接種者的其它反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究，來確定特定疫苗的最適量。在初次接種以后，受接種者可過大約4周接受一次加強(qiáng)。
除了為易患HPV感染或HSV感染的人接種外，可用本發(fā)明的藥用組合物來免疫治療性地治療受到所述病毒感染的患者。
在本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種本文描述的制造方法，其中該方法包括將一種人乳頭瘤病毒抗原及一種乙型肝炎病毒抗原與例如3D-MPL的一種TH1誘發(fā)佐劑混合，且優(yōu)選與例如明礬的一種載體混合。
如果需要，可以以任何方便的順序來添加其它的抗原，從而提供本文描述的多價(jià)疫苗組合物。
下面的實(shí)施例闡明了本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例1用明礬/3D-MPL配制的HPV抗原/HBs組合之相當(dāng)?shù)拿庖咴砸杂妙A(yù)先吸附于Al(OH)3或AlPO4上的抗原或3D-MPL的整體式材料(monobulk)，將以下四種不同的抗原與明礬/3D-MPL(AS04)一起配制1.HPV16 L1病毒樣顆粒(VLP-16)，2.HPV18 L1病毒樣顆粒(VLP18)，3.來自HPV-16的PD 1/3 16E7 2M(E7)，4.HBsAg，用所配制的抗原在Balb/C小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫原性研究。
將3D-MPL/Al(OH)3制劑稱為AS04D，而將基于3D-MPL/AlPO4的制劑稱為AS04C。
評(píng)價(jià)下面的疫苗1.VLP16+VLP18 AS04D，2.基于E7的制劑，3.HBs AS04C；并評(píng)價(jià)組合這些疫苗的潛力。
本實(shí)驗(yàn)的目的如下
1)比較不同的AS04組合物的免疫原性；所述組合或者是VLP16+VLP18的組合，或者為E7與HBs Ag的組合。
2)當(dāng)或者用AS04C、或者用AS04D配制所述的單價(jià)疫苗時(shí)比較用AlPO4制備的或用具有不同比率之“明礬”形式的AlPO4/Al(OH)3混合物制備的不同HBs AS04制劑的免疫原性；并且根據(jù)包含VLP抗原或E7抗原的組合物中的Al(OH)3和AlPO4與3D-MPL/Al(OH)3的比值，來評(píng)價(jià)3D-MPL的吸附作用。
在材料與方法一節(jié)中全面地描述了所述實(shí)驗(yàn)方案。
總之，用基于不同抗原的制劑(1/10HD)，以3周的間隔為各組小鼠肌內(nèi)免疫兩次，每組10只小鼠。在第二次免疫后第14天，通過ELISA，來監(jiān)測(cè)通過接種誘導(dǎo)的針對(duì)HBs、E7和VLP Ag的抗體應(yīng)答以及同種型的分布型。在同一時(shí)間點(diǎn)，在體外用或者HBs抗原、VLP抗原或者E7抗原再刺激脾細(xì)胞后，分析所述的CMI(淋巴組織增生應(yīng)答或所述細(xì)胞因子的產(chǎn)生(干擾素γ/IL5))。材料與方法制劑制劑組合物AS04C或AS04D上的VLP16、VLP18、PD1/3-HPV16E7-His及HBs。
所用的成分
吸附a)VLP的吸附以2μgVLP/10μgAl(OH)3，將純化的VLP16和VLP18材料(bulk)添加到Al(OH)3中。把該混合物貯藏在2-8℃之間直到最后的配制為止。
b)HBs的吸附將2μgHbs與40μgAlPO4混合。將這種混合物貯藏在2-8℃之間直至最后的配制為止。
將2μgHbs與10μgAlPO4混合。將這種混合物貯藏在2-8℃之間直至最后的配制為止。
c)PD1/3-HPV16E7-His的吸附將2μgE7與10μgAl(OH)3混合。將這種混合物貯藏在2-8℃之間直至最后的配制為止。
d)3D-MPL的吸附將5μg3D-MPL與10μgAl(OH)3混合。將這種混合物貯藏在2-8℃之間直至最后的配制為止。
將5μg3D-MPL與10μgAlPO4混合。將這種混合物貯藏在2-8℃之間直至最后的配制為止。
將2.5μg3D-MPL與5μgAl(OH)3混合。將這種混合物貯藏在2-8℃之間直至最后的配制為止。
將2.5μg3D-MPL與5μgAlPO4混合。將這種混合物貯藏在2-8℃之間直至最后的配制為止。
配制混合水和NaCl(10x濃縮的)，在室溫下攪拌10分鐘后，添加不同的成分吸附的抗原、吸附的3D-MPL和Al(OH)3(參見下表)。在室溫下將它們搖動(dòng)10分鐘并貯藏在4℃，直至注射為止。然后，可以進(jìn)行所述制劑的體外特性鑒定。
組別及制劑詳情表
小鼠血清學(xué)抗HBs血清學(xué)運(yùn)用HBs(Hep 286)作為包被抗原，通過ELISA完成抗HBs抗體的定量。以每孔50μl的量使用抗原溶液和抗體溶液。以1μg/ml的終濃度，用PBS稀釋該抗原，且在4℃使該抗原過夜吸附到96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麥)的各孔中。然后，使所述板與包含1％牛血清白蛋白和0.1％吐溫-20的PBS(飽和緩沖液)在37℃保溫1小時(shí)。把血清在飽和緩沖液中的2倍稀釋液(以1/100稀釋液開始)添加到HBs包被板上，并在37℃將其保溫1小時(shí)30分鐘。用含有0.1％吐溫-20的PBS洗滌所述板四次，并往每個(gè)孔中添加用飽和緩沖液以1/1500稀釋的結(jié)合生物素的抗小鼠Ig(Amersham，UK)，或添加用飽和緩沖液分別以1/4000、1/8000、1/4000稀釋的IgG1、IgG2a、IgG2b(IMTECH，美國)；且在37℃將其保溫1小時(shí)30分鐘。在一個(gè)洗滌步驟之后，加入用飽和緩沖液以1/1000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記的過氧化物酶復(fù)合物(Amersham，UK)，并在37℃再保溫30分鐘。如上所述洗滌所述板，并將其與一種溶液保溫20分鐘，所述溶液為0.04％的鄰苯二胺(Sigma)和0.03％H2O2溶于0.1％吐溫-20 0.05M檸檬酸鹽緩沖液pH 4.5中的溶液。用2N的H2SO4終止該反應(yīng)，并在490/630nm讀數(shù)。用SoftmaxPro(用一個(gè)四參數(shù)方程)，根據(jù)參比來計(jì)算ELISA效價(jià)，并以EU/ml表示。
抗E7的血清學(xué)運(yùn)用PD1/3 16E7 2M作為包被抗原，通過ELISA完成抗E7抗體的定量。以每孔100μl的量使用抗原溶液和抗體溶液。以0.5μg/ml的終濃度，用PBS稀釋該抗原，且在4℃使該抗原過夜吸附到96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麥)的各孔中。然后，將所述板與包含1％牛血清白蛋白和0.1％吐溫-20的PBS(飽和緩沖液)在37℃保溫1小時(shí)。把血清在飽和緩沖液中的2倍稀釋液(以1/100或1/400稀釋液開始)添加到E7包被板上，并在37℃將其保溫1小時(shí)30分鐘。用PBS 0.1％吐溫-20洗滌所述板四次，并往每個(gè)孔中添加用飽和緩沖液以1/1500稀釋的結(jié)合生物素的抗小鼠Ig、IgG1、IgG2a、IgG2b(Amersham，UK)；且在37℃將其保溫1小時(shí)30分鐘。在一個(gè)洗滌步驟之后，加入用飽和緩沖液以1/5000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記的過氧化物酶復(fù)合物(Amersham，UK)，并在37℃再保溫30分鐘。如上述地洗滌所述板，并將其與一種溶液保溫20分鐘，所述溶液為用檸檬酸鹽緩沖液(0.1M pH＝5.8)2倍稀釋的N-四甲聯(lián)苯胺(TMB)(Biorad，USA)的溶液。用0.5N的H2SO4終止該反應(yīng)，并在450/630nm讀數(shù)。用SoftmaxPro(用一個(gè)四參數(shù)方程)，根據(jù)參比來計(jì)算ELISA效價(jià)，并以EU/ml表示。
抗VLP16和抗VLP18的血清學(xué)用VLP16 503/1(20/12/99)和VLP18 504/2(25/10/99F)作為包被抗原，通過ELISA完成抗VLP16抗體和抗VLP18抗體的定量。以每孔50μl的量使用抗原溶液和抗體溶液。以0.5μg/ml的終濃度，用PBS稀釋所述抗原，且在4℃使該抗原過夜吸附到96孔微量滴定板(MaxisorbImmuno-plate，Nunc，丹麥)的各孔中。然后，使所述板與包含1％牛血清白蛋白的PBS在37℃保溫1小時(shí)。把血清在飽和緩沖液中的2倍稀釋液(以1/400的稀釋液開始)添加到所述VLP包被板上，并在37℃將其保溫1小時(shí)30分鐘。用PBS 0.1％吐溫-20洗滌所述板四次，并往每個(gè)孔中添加用飽和緩沖液以1/1500稀釋的結(jié)合生物素的抗小鼠Ig(Amersham，UK)，且在37℃將其保溫1小時(shí)30分鐘。在一個(gè)洗滌步驟之后，加入用飽和緩沖液以1/1000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記的過氧化物酶復(fù)合物(Amersham，UK)，并在37℃再保溫30分鐘。如上所述洗滌所述板，并將其與一種溶液保溫20分鐘，所述溶液為0.04％的鄰苯二胺(Sigma)和0.03％H2O2溶于0.1％吐溫-20 0.05M檸檬酸鹽緩沖液pH4.5中的溶液。用2N的H2SO4終止該反應(yīng)，并在490/630nm讀數(shù)。用SoftmaxPro(用一個(gè)四參數(shù)方程)，根據(jù)參比來計(jì)算ELISA效價(jià)，并以EU/ml表示。
T細(xì)胞的增殖在第二次免疫后兩周，殺死小鼠，無菌切取脾臟并將其匯集(每組1個(gè)5個(gè)器官的匯集物)。用包含2mM L-谷氨酰胺、抗生素、5×10-5M的2-巰基乙醇以及1％正常同源小鼠血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)，來制備細(xì)胞懸浮液。在具有不同濃度(10-0.03μg/ml)各種抗原(VLP抗原、E7抗原或HBs抗原)的圓底96孔板中，在200μl中以2×106個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度培養(yǎng)脾細(xì)胞。每個(gè)試驗(yàn)以四個(gè)復(fù)份進(jìn)行。在5％的CO2下，于37℃培養(yǎng)96小時(shí)后，用3H-胸腺嘧啶核苷(Amersham，UK，5Ci/mmol)以0.5μCi/孔脈沖處理所述細(xì)胞達(dá)18小時(shí)，然后，用一種細(xì)胞收獲器在Unifilter板(Packard)上將其收獲。用一臺(tái)閃爍計(jì)數(shù)器(Topcount，Packard)測(cè)定摻入的放射性。以cpm(四個(gè)重復(fù)孔中的平均cpm)表示結(jié)果或以刺激指數(shù)(在具有抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物中的平均cpm/在沒有抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物中的平均cpm)的形式表示結(jié)果。細(xì)胞因子的產(chǎn)生在第二次免疫后兩周，殺死小鼠，無菌地切取脾臟并將其匯集。用包含2mM L-谷氨酰胺、抗生素、5×10-5M的2-巰基乙醇以及5％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)，來制備細(xì)胞懸浮液。在具有不同濃度(10-1μg/ml)的各種抗原(VLP抗原、E7抗原或HBs抗原)的平底24孔板上，在1ml中，以5×106個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度培養(yǎng)細(xì)胞。96小時(shí)后收獲上清液；并使其冷凍，直到通過ELISA檢驗(yàn)干擾素γ和IL5的存在。
干擾素γ(Genzyme)用來自Genzyme的試劑，通過ELISA進(jìn)行干擾素γ的定量測(cè)定。以每孔50μl的量使用樣品溶液和抗體溶液。在4℃，用50μl在pH9.5碳酸鹽緩沖液中以1.5μg/ml稀釋的倉鼠抗小鼠干擾素γ包被96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麥)過夜。然后，使所述板與100μl包含1％牛血清白蛋白和0.1％吐溫-20的PBS(飽和緩沖液)在37℃保溫1小時(shí)。把得自體外刺激的上清液在飽和緩沖液中的2倍稀釋液(以1/2開始)添加到抗-干擾素γ包被板上，并在37℃將其保溫1小時(shí)30分鐘。用包含0.1％吐溫的PBS(洗滌緩沖液)洗滌所述板四次，并往每個(gè)孔中添加用飽和緩沖液以0.5μg/ml之終濃度稀釋的結(jié)合生物素的山羊抗小鼠干擾素γ，且在37℃將其保溫1小時(shí)。在一個(gè)洗滌步驟之后，在37℃，加入用飽和緩沖液以1/10000稀釋的AMDEX綴合物(Amersham)達(dá)30分鐘。如上所述洗滌所述板，并將其與50μlTMB(Bioard)保溫10分鐘。用0.4N的H2SO4終止該反應(yīng)，并在450/630nm讀數(shù)。用SoftmaxPro(四參數(shù)方程)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(小鼠干擾素γ標(biāo)準(zhǔn))來計(jì)算濃度，并以pg/ml表示。
IL5(Pharmingen)用來自Pharmingen的試劑，通過ELISA進(jìn)行IL5的定量測(cè)定。以每孔50μl的量使用樣品溶液和抗體溶液。在4℃，用50μl在pH9.5碳酸鹽緩沖液中以1μg/ml稀釋的大鼠抗小鼠IL5包被96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麥)過夜。然后，使所述板與100μl包含1％牛血清白蛋白和0.1％吐溫-20的PBS(飽和緩沖液)在37℃保溫1小時(shí)。把得自體外在飽和緩沖液中刺激的上清液的2倍稀釋液(以1/2開始)添加到抗-IL5包被板上，并在37℃將其保溫1小時(shí)30分鐘。用包含0.1％吐溫的PBS(洗滌緩沖液)洗滌所述板四次，并往每個(gè)孔中添加用飽和緩沖液以1μg/ml之終濃度稀釋的結(jié)合生物素的大鼠抗小鼠IL5；且在37℃將其保溫1小時(shí)。在一個(gè)洗滌步驟之后，在37℃，加入用飽和緩沖液以1/10000稀釋的AMDEX綴合物(Amersham)達(dá)30分鐘。如上所述洗滌所述板，并將其與50μlTMB(Bioard)保溫15分鐘。用0.4N的H2SO4終止該反應(yīng)，并在450/630nm讀數(shù)。用SoftmaxPro(四參數(shù)方程)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(重組的小鼠IL-5)來計(jì)算濃度，并以pg/ml表示。組別用下面制劑對(duì)10只一組的各組Balb/C小鼠進(jìn)行肌內(nèi)免疫。
表1組別與制劑
在上述“材料與方法”里的所述表中，描述了制劑的詳情。結(jié)果1.血清學(xué)a)HBs應(yīng)答用HBsAg(Hep286)作為包被抗原，通過ELISA測(cè)定體液應(yīng)答(Ig和同種型)。在第二次免疫后的第14天分析血清。


圖1顯示了在第二次免疫后的第14天對(duì)個(gè)體血清測(cè)定的抗HBs抗體應(yīng)答。
在所述疫苗中具有不同比率Al(OH)3和AlPO4的情況下使3D-MPL吸附于單獨(dú)的Al(OH)3或單獨(dú)的AlPO4的所應(yīng)用的方案(組C、組D、組E)之間，沒有觀測(cè)到其抗HBs抗體應(yīng)答有差異(GMT為27905 EU/ml對(duì)30832或26670EU/ml)。
與只有HBs的組(組C)相比較，在包含VLP抗原和HBs抗原的組合組G和H中，觀測(cè)到稍微弱些的抗HBs抗體應(yīng)答(GMT分別為27905EU/ml對(duì)10635EU/ml或15589EU/ml)。用E7/HBs組合而得到的抗HBs的GMT達(dá)到19235EU/ml。
在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之前，對(duì)各群體應(yīng)用T-Grubbs檢驗(yàn)以進(jìn)行數(shù)據(jù)排除。為了分析，排除組C中的一只小鼠。
在將第二次免疫后的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換后，對(duì)所述抗HBs之效價(jià)進(jìn)行單因素方差分析。觀測(cè)到各制劑之間有顯著性差異(p-值＝0.0108)，然后進(jìn)行Student Newman Keuls檢驗(yàn)以進(jìn)行多重比較。在組H(VLP/HBs)或組F(HBs/E7)的組合與組C(HBs AS04C)之間，沒觀測(cè)到有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。在組G(VLP/HBs)和組C(HBs AS04C)之間，顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p值＝0.0291)；然而，2個(gè)組的95％置信區(qū)間重疊，并且這種達(dá)到2.5比率的差異在生物學(xué)上可能是不恰當(dāng)?shù)摹?br> 用所匯集的血清分析出的同種型再劃分如下，且顯示出在6個(gè)組之間沒有較大的差異。
b)抗E7應(yīng)答使用PD1/3 16E7 2M作為包被抗原，通過ELISA測(cè)定體液應(yīng)答(Ig和同種型)。分析第二次免疫后第14天的組B和組F的血清。
圖2顯示了在第二次免疫后第14天用個(gè)體血清測(cè)定的抗E7抗體應(yīng)答。
與單獨(dú)的E7相比較，觀測(cè)到HBs/E7組合之抗E7應(yīng)答的微小減弱，GMT減少2倍(22447EU/ml對(duì)9626EU/ml)。采用Student Newman Keuls檢驗(yàn)確定這在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。
在由所述的兩種制劑誘導(dǎo)的同種型分布型方面，沒觀測(cè)到差異如在下面表中報(bào)道的，主要是IgG1應(yīng)答(97-98％的IgG1)。
用所匯集的血清分析出的同種型再劃分如下
c)抗VLP16應(yīng)答用VLP16 503-1(20/12/99)作為包被抗原，通過ELISA測(cè)定體液應(yīng)答(Ig)。分析第二次免疫后第14天的血清。
圖3顯示了在第二次免疫后第14天用個(gè)體血清測(cè)定的抗VLP16 Ig抗體應(yīng)答。
在用HBs和VLP的組合(組G和組H)進(jìn)行免疫后，所獲得的抗VLP16效價(jià)與單價(jià)VLP制劑(組A)的類似(GMT為19570 EU/ml或23448EU/ml對(duì)30311EU/ml)。
在采用使3D-MPL僅吸附于Al(OH)3(組G)與使3D-MPL混合吸附于Al(OH)3和AlPO4(組H)相比的任一種方式制備的兩種組合物之間，觀測(cè)到相當(dāng)?shù)男r(jià)(GMT為19570EU/ml對(duì)23448EU/ml)。
采用單因素方差分析檢驗(yàn)，表明這些差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。
d)抗VLP18應(yīng)答用VLP18 504-2(25/10/99)作為包被抗原，通過ELISA測(cè)定體液應(yīng)答(Ig)。分析第二次免疫后第14天的血清。
圖4顯示了在第二次免疫后第14天用個(gè)體血清測(cè)定的抗VLP18 Ig抗體應(yīng)答。
在用HBs和VLP的組合(組G和組H)進(jìn)行免疫后，或用單價(jià)VLP制劑(組A)進(jìn)行免疫后，得到類似的抗VLP18效價(jià)(GMT為37285EU/ml或51202EU/ml對(duì)56504EU/ml)。
在采用使3D-MPL僅吸附于Al(OH)3(組G)與使3D-MPL混合吸附于Al(OH)3和AlPO4(組H)相比的任一種方式制備的組合物之間，觀測(cè)到相當(dāng)?shù)男r(jià)(組G和組H)。
采用單因素方差分析檢驗(yàn)，表明這些差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。2.細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在體外用或HBs抗原、E7抗原或用各VLP抗原再刺激脾細(xì)胞后，在第二次免疫后的第14天，評(píng)價(jià)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(淋巴組織增生、干擾素γ/IL5的產(chǎn)生)。對(duì)于小鼠的每個(gè)組，建立5個(gè)器官的匯集物。
在上面的“材料與方法”中，全面地描述了這個(gè)實(shí)驗(yàn)的步驟。3.細(xì)胞因子的產(chǎn)生a)體外用HBs再刺激圖5顯示了在體外用HBs再刺激96小時(shí)后于脾細(xì)胞中監(jiān)測(cè)到的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
對(duì)于所有的組，觀測(cè)到低水平的干擾素γ和IL5的產(chǎn)生；但正如在表2中所顯示的，與IL5的產(chǎn)生相比，觀測(cè)到較高水平的干擾素γ的產(chǎn)生，干擾素γ/IL5之比率表明用單價(jià)疫苗和聯(lián)合疫苗誘發(fā)相當(dāng)?shù)腡H1應(yīng)答。不應(yīng)該考慮組C的結(jié)果，因?yàn)樵跇O限以下的數(shù)據(jù)可能表示缺乏用于再刺激的抗原。
表2在體外用HBs再刺激后的干擾素γ/IL-5之比率
b)體外用E7再刺激圖6顯示了在體外用E7抗原再刺激96小時(shí)后于脾細(xì)胞中監(jiān)測(cè)到的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
當(dāng)比較用于再刺激的10μg抗原劑量和1μg抗原劑量時(shí)，觀測(cè)到一種劑量范圍效應(yīng)。
對(duì)于用HPV16/18L1的VLP免疫的組，用10μg抗原再刺激，觀測(cè)到一種非特異性應(yīng)答。
在評(píng)價(jià)的所有組(單價(jià)對(duì)組合)中，與指示明確的TH-1免疫應(yīng)答分布型的IL-5(表3)相比，干擾素-γ以高得多的濃度產(chǎn)生。
表3在體外用E7再刺激后的干擾素γ/IL-5之比率
c)體外用VLP16和VLP18再刺激圖7和圖8顯示在體外用VLP16或VLP18再刺激后，于第二次免疫后之第14天的淋巴組織的增生。
對(duì)于所有包含VLP的制劑(綜合刺激指數(shù)在12-29之間)，觀測(cè)到相當(dāng)?shù)姆植夹停?0μg再刺激劑量抗原的cpm約為30000，這表明在數(shù)據(jù)的這種讀出時(shí)，沒有不同制劑之間的干擾。
圖9顯示了在體外用VLP16再刺激96小時(shí)后于脾細(xì)胞中監(jiān)測(cè)到的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
圖10顯示了在體外用VLP18再刺激96小時(shí)后于脾細(xì)胞中監(jiān)測(cè)到的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
對(duì)于用任一種VLP抗原再刺激而言，采用10μg的抗原劑量和1μg抗原劑量還沒有觀測(cè)到對(duì)兩者的細(xì)胞因子之產(chǎn)生有劑量范圍效應(yīng)。
用所有制劑都觀測(cè)到明確的TH-1分布型。
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，所述組合物包含和一種佐劑結(jié)合的(a)一種乙型肝炎病毒(HBV)抗原，以及(b)一種人乳頭瘤病毒(HPV)抗原；所述佐劑為TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激物。
2.一種權(quán)利要求1的疫苗組合物，所述組合物另外還包括一種載體。
3.一種權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中所述TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激物選自以下佐劑3D-MPL、其中3D-MPL粒徑最好是大約100nm或小于100nm的3D-MPL、QS21、QS21與膽固醇的混合物、以及寡核苷酸CpG。
4.一種權(quán)利要求3的疫苗組合物，其中所述TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激物為3D-MPL。
5.一種權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的疫苗組合物，其中所述乙型肝炎病毒抗原是乙型肝炎病毒表面抗原。
6.一種權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的疫苗組合物，所述組合物包含選自L1、L2、E6和E7的至少一種HPV抗原，所述HPV抗原可任意選擇地為融合蛋白形式或截短物形式。
7.一種權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的疫苗組合物，其中另外還存在一種EBV抗原。
8.一種在權(quán)利要求7中限定的疫苗組合物，其中所述EBV抗原是gp350。
9.一種權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的疫苗組合物，其中另外還存在一種甲型肝炎抗原。
10.一種權(quán)利要求9的疫苗組合物，其中所述HAV抗原來源于HM-175病毒株。
11.一種權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的疫苗組合物，其中另外還存在一種單純皰疹病毒(HSV)抗原。
12.一種權(quán)利要求11的疫苗組合物，其中所述HSV抗原為HSV-2gD或其截短物。
13.一種權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的疫苗組合物，其中所述載體選自氫氧化鋁、磷酸鋁和生育酚以及水包油乳狀液。
14.一種權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的疫苗組合物，所述組合物另外還包括一種VZV抗原。
15.一種權(quán)利要求14的疫苗組合物，其中所述VZV抗原為gpI。
16.一種權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的疫苗組合物，所述組合物另外還包括一種HCMV抗原。
17.一種權(quán)利要求16的疫苗組合物，其中所述HCMV抗原為gB685**或pp65。
18.一種權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的疫苗組合物，所述組合物另外還包括一種鼠弓形體(Toxoplasma gondii)抗原。
19.一種權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述鼠弓形體抗原為SAG1或TG34。
20.一種權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的疫苗組合物，所述組合物包括HBsAgS抗原和HPV的L1、L2、E6、E7、蛋白D-E6、蛋白D-E7或L2-E7；且所述組合物可任意選擇地另外還包括HSV-2 gDt、EBVgp 350、VZVgpI、HAV HM-175滅活毒株、HCMV的gB685**或pp65以及鼠弓形體之SAG1或TG34抗原中的一種或更多種。
全文摘要
提供了新的聯(lián)合疫苗組合物,所述組合物包括一種乙型肝炎病毒抗原抗原和一種HPV抗原,且可任意選擇地另外包括下面抗原中的一種或更多種:EBV抗原、甲型肝炎抗原或滅活的減毒病毒、單純皰疹病毒抗原、VZV抗原、HCMV抗原、鼠弓形體抗原。用一種佐劑配制所述的疫苗組合物,所述佐劑是TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激物,例如3D－MPL和QS21。
文檔編號(hào)A61K39/29GK1390136SQ00815418
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2000年9月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月7日
發(fā)明者M·A·C·維滕多夫 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司