專利名稱：動(dòng)物源性產(chǎn)品中冠狀病毒檢測(cè)基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及動(dòng)物源性產(chǎn)品疫病檢測(cè)技術(shù)，具體涉及8種冠狀病毒包括牛冠狀病毒(BCV)、犬冠狀病毒(CCV)、貓冠狀病毒(FCVO、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、火雞冠狀病毒(TCV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和人呼吸道冠狀病毒(HCV)在動(dòng)物源性產(chǎn)品內(nèi)的快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
冠狀病毒又名日冕病毒，目前所知，冠狀病毒科病毒可感染人和多種脊椎動(dòng)物，與人和多種動(dòng)物的疾病有關(guān)，具有胃腸道、呼吸道和神經(jīng)系統(tǒng)嗜性，感染后分別引起相應(yīng)的癥候群，主要引起人和動(dòng)物呼吸道、消化道、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。特別是2003年世界一些國(guó)家相繼爆發(fā)了人嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，造成五百多人死亡，帶來巨大的生命和經(jīng)濟(jì)損失，造成嚴(yán)重的社會(huì)動(dòng)蕩，其病原已被確定為一種新型的冠狀病毒，從而冠狀病毒更加被人們所重視。
同一群的不同冠狀病毒間核苷酸和氨基酸序列間均具有較高的同源性，而不屬于同一群的不同冠狀病毒間核苷酸和氨基酸序列間的同源性則較低，并且不同冠狀病毒間的基因組有重組現(xiàn)象，因此僅靠對(duì)一個(gè)冠狀病毒的單個(gè)基因的診斷，很難準(zhǔn)確對(duì)該冠狀病毒感染進(jìn)行診斷.需要克隆一個(gè)冠狀病毒的多個(gè)不同基因片斷，特別是分離和鑒定區(qū)分不同種屬冠狀病毒的基因片段克隆，再利用這些基因片段同時(shí)對(duì)該冠狀病毒進(jìn)行診斷，才能更為準(zhǔn)確診斷冠狀病毒感染。
基因芯片是90年代中期發(fā)展起來的一項(xiàng)尖端技術(shù)，將大量核酸片段(寡核苷酸/RNA、cDNA、基因組DNA)以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體上組成密集分子排列，當(dāng)熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后，通過激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)(CCD)對(duì)熒光信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量?；蛐酒谝晃⑿〉幕?硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子識(shí)別探針。
2003年6月，科技部863計(jì)劃十五重大專項(xiàng)“功能基因組和生物芯片”正式立項(xiàng)，并啟動(dòng)了由上海出入境檢驗(yàn)檢疫局主持的“生物芯片在動(dòng)物源性食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用”項(xiàng)目，開展了對(duì)動(dòng)物源性產(chǎn)品中冠狀病毒基因芯片檢測(cè)技術(shù)的系統(tǒng)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)動(dòng)物源性產(chǎn)品中冠狀病毒的基因芯片，固定在芯片上的核苷酸片斷為1～8種冠狀病毒相對(duì)應(yīng)的特征性cDNA片段的固相載體和每種病毒特異的引物混合組。
上述8種冠狀病毒是牛冠狀病毒(BCV)、犬冠狀病毒(CCV)、貓冠狀病毒(FCVO)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、火雞冠狀病毒(TCV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和人呼吸道冠狀病毒(HCV)。
其中采用的特征性片段來源于8種冠狀病毒包括BCV、CCV、FCV、FIPV、PRCV、TCV、TGEV和HCV的特異cDNA克隆。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的獨(dú)立研究構(gòu)建了8種冠狀病毒103個(gè)特異克隆，經(jīng)過雜交篩選后選擇無交叉的特異51個(gè)克隆，煮沸裂解法制備質(zhì)粒DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物抽干濃縮后溶于50％二甲基亞砜，終濃度為300ng/μl，點(diǎn)制冠狀病毒基因芯片。然后對(duì)待檢樣品應(yīng)用3～5對(duì)特異的引物進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增過程中單色熒光cy-3標(biāo)記的dCTP隨機(jī)滲入進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)42℃水浴3個(gè)小時(shí)進(jìn)行冠狀病毒基因芯片的雜交，通過激光共聚焦掃描。具體如下本發(fā)明的檢測(cè)動(dòng)物源性產(chǎn)品中冠狀病毒的基因芯片包括固定與8種冠狀病毒相對(duì)應(yīng)的特征性cDNA片段的固相載體、每種病毒特異的引物混合組。
固相載體為回收特異的PCR探針片段，抽干后每個(gè)片段加入50％二甲基亞砜15μl，使各個(gè)終濃度達(dá)到300ng/μl。按照冠狀病毒基因芯片點(diǎn)陣的矩陣排布圖的順序，轉(zhuǎn)移入384孔板中進(jìn)行點(diǎn)樣。固定2小時(shí)，避光保存?zhèn)溆谩?br> 每種病毒特異的引物混合物為根據(jù)冠狀病毒基因芯片的點(diǎn)陣排布圖，確定每個(gè)點(diǎn)陣所對(duì)應(yīng)的基因克隆和相應(yīng)的引物，每一種病毒的3~5對(duì)引物分為一組。具體引物組為BCV(BCV6、BCV3、BCV8、BCV9、BCV10和BCV2、BCV7、BCV12、BCV13BCV14)、CCV(CCV1、CCV2、CCV5、CCV7)、FCV(FCV6、FCV7、FCV8、FCV9)、FIPV(FIPV2、FIPV7、FIPV8、FIPV9)、PRCV(PRCV1、PRCV2、PRCV3)、TCV(TCV1、TVC2、TCV3、TCV5和TCV6、TCV7、CV9)、HCV(HCV3、HCV4、HCV5、HCV12和HCV6、HCV8、HCV13、HCV15)、TGEV(TGEV3、TGEV4、TGEV5、TGEV6)和通用引物。
其檢測(cè)程序?yàn)?1)芯片變性水煮沸無氣泡后，放入芯片，變性90秒，取出，放入-20℃預(yù)冷的無水乙醇中驟冷2min，放入離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘甩干，備用；(2)應(yīng)用商品化的不同試劑盒提取樣品中不同冠狀病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用每種病毒特異的引物混合組和通用引物PCR擴(kuò)增，同時(shí)加入Cy3-dCTP。反應(yīng)體系cDNA模板3μL、蒸餾水15.7μL、10倍Taq酶緩沖液(Mg2+free)2.5μL、MgCl21.5μL、dNTP(10∶1)0.5μL、引物(上下游混合引物)1μL、Taq酶0.3μL、Cy3-dCTP0.5μL。利用合成的通用引物，cDNA混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)條件為94℃變性5min；94℃、45sec，40℃、45sec，72℃、60sec，5個(gè)循環(huán)；94℃、45sec，50℃、60sec，72℃、60sec，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。；(3)cy-3標(biāo)記病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物芯片雜交液的配制將多重PCR對(duì)病毒cDNA的擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物放入Eppendorf Concentrator中。56℃，30~90分鐘抽干，加入5.5μL滅菌去離子水溶解，加入芯片雜交液，配制雜交反應(yīng)體系，其組成如下(按雜交模板的不同采用不同濃度的甲酰胺)PCR產(chǎn)物濃縮液5.5μL、20×SSC2.25μL、50×Denhardt’s1.5μL、甲酰胺(25％終濃度)3.75μL、50mM1270.5μL、2％SDS1.5μL。對(duì)混合好的PCR產(chǎn)物雜交體系，96℃變性5-10分鐘，然后立即放置冰上。
(4)基因芯片的雜交將變性好的芯片放入雜交盒中，雜交盒中預(yù)先加入200μL蒸餾水，將雜交反應(yīng)液加到芯片上，蓋好蓋，置42℃水浴鍋中雜交2-3h。
(5)基因芯片的洗滌雜交結(jié)束后，取出芯片，放入洗液I中，在42℃恒溫?fù)u床中100轉(zhuǎn)/分鐘，洗滌4-5分鐘，然后取出基因芯片，放入洗液II中，在42℃恒溫?fù)u床中100轉(zhuǎn)/分鐘，洗滌4分鐘，放入離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘甩干，備用。
(6)芯片掃描，數(shù)據(jù)分析。
本發(fā)明判定標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性參照點(diǎn)、雜交質(zhì)量控制點(diǎn)顯示很強(qiáng)的熒光信號(hào)，陰性對(duì)照點(diǎn)和空白對(duì)照點(diǎn)不顯示信號(hào)。樣品多重PCR對(duì)應(yīng)的各點(diǎn)顯示很強(qiáng)的熒光信號(hào)為陽(yáng)性結(jié)果。
本發(fā)明有益的積極效果是操作簡(jiǎn)單、快速、高通量，為食品安全檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好滿足目前對(duì)冠狀病毒檢測(cè)的迫切需要，用于進(jìn)出口檢疫、食品衛(wèi)生部門檢測(cè)等，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)高通量、快速、準(zhǔn)確。應(yīng)用基因芯片可達(dá)到一次試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)多種疾病或分析多種生物樣品的目的，可以有效診斷冠狀病毒感染，對(duì)預(yù)防、控制和消滅冠狀病毒感染有著廣闊的前景。通過PCR擴(kuò)增可以增加cy-3標(biāo)記的待檢樣品的數(shù)量，進(jìn)一步提高冠狀病毒基因芯片的檢測(cè)信號(hào)，且一次可以檢測(cè)一種冠狀病毒的多個(gè)基因片段，更利于準(zhǔn)確地診斷和鑒定冠狀病毒的感染。
(2)操作簡(jiǎn)便快速，批量檢測(cè)?？梢酝瑫r(shí)對(duì)大量樣品是否攜帶8種冠狀病毒進(jìn)行檢測(cè)，在5-6小時(shí)內(nèi)即可準(zhǔn)確判定檢測(cè)結(jié)果。
(3)結(jié)果判定形象、準(zhǔn)確、可靠。以激光掃描、熒光信號(hào)的有無顯示檢測(cè)結(jié)果，判定形象。采用激光掃描儀器，準(zhǔn)確可靠。
(4)靈敏度高冠狀病毒基因芯片與多重PCR結(jié)合比傳統(tǒng)的多重PCR對(duì)冠狀病毒cDNA的檢測(cè)，敏感性至少高出1000倍。


圖1為本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例8種冠狀病毒基因芯片點(diǎn)陣的矩陣排布。圖中QC質(zhì)量控制對(duì)照，10μM HEX(擬南芥某基因序列)，BC空白對(duì)照，50％的二甲基亞砜，NC陰性對(duì)照，127(SARS)，ECHLA的PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，較佳實(shí)施例的具體制備如下1、固定與8種冠狀病毒相對(duì)應(yīng)的特征性cDNA片段的固相載體回收特異的PCR探針片段，抽干后每個(gè)片段加入50％二甲基亞砜15μl，使各個(gè)終濃度達(dá)到300ng/μl。按照冠狀病毒基因芯片點(diǎn)陣的矩陣排布圖的順序，轉(zhuǎn)移入384孔板中進(jìn)行點(diǎn)樣。固定2小時(shí)，避光保存?zhèn)溆谩?br> 2、每種病毒特異的引物混合物根據(jù)冠狀病毒基因芯片的點(diǎn)陣排布圖，確定每個(gè)點(diǎn)陣所對(duì)應(yīng)的基因克隆和相應(yīng)的引物，每一種病毒的3~5對(duì)引物分為一組。具體引物組為BCV(BCV6、BCV3、BCV8、BCV9、BCV10和BCV2、BCV7、BCV12、BCV13BCV14)、CCV(CCV1、CCV2、CCV5、CCV7)、FCV(FCV6、FCV7、FCV8、FCV9)、FIPV(FIPV2、FIPV7、FIPV8、FIPV9)、PRCV(PRCV1、PRCV2、PRCV3)、TCV(TCV1、TVC2、TCV3、TCV5和TCV6、TCV7、CV9)、HCV(HCV3、HCV4、HCV5、HCV12和HCV6、HCV8、HCV13、HCV15)、TGEV(TGEV3、TGEV4、TGEV5、TGEV6)和通用引物。冠狀病毒RNA聚合酶基因的通用PCR引物上5’-actca(a/g)(a/t)t(a/g)aat(t/c)tnaaata(t/c)gc-3’，下5’-tcaca(c/t)tt(a/t)ggata(g/a)tccca-3。
3、樣品病毒核酸的提取與標(biāo)記應(yīng)用商品化的不同試劑盒提取樣品中不同冠狀病毒RNA，采用Takara公司的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系制備cDNA，其反應(yīng)體系如下RNA溶液41μL、逆轉(zhuǎn)錄酶5倍濃縮緩沖液13μL、dNTP2.0μL、引物OligodT(100pmol/L)1.5μL、RNA酶抑制劑1.5μL、逆轉(zhuǎn)錄酶6μL。上述反應(yīng)體系室溫放置10min后，置PCR儀上42℃反應(yīng)1h，冰水中冷卻2分鐘，得cDNA模板。根據(jù)冠狀病毒基因芯片的點(diǎn)陣排布圖，確定每個(gè)點(diǎn)陣所對(duì)應(yīng)的基因克隆和相應(yīng)的引物，每個(gè)病毒的3~5對(duì)引物分為一組，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每組多重PCR的分組情況、所用引物和循環(huán)條件如表1所示，PCR反應(yīng)體系如下cDNA模板3μL、蒸餾水15.7μL、10倍Taq酶緩沖液(Mg2+free)2.5μL、MgCl21.5μL、dNTP(10∶1)0.5μL、引物(上下游混合引物)1μL、Taq酶0.3μL、Cy3-dCTP0.5μL。利用合成的通用引物，cDNA混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)條件為94℃變性5min；94℃、45sec，40℃、45sec，72℃、60sec，5個(gè)循環(huán)；94℃、45sec，50℃、60sec，72℃、60sec，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。
4、試劑盒檢測(cè)操作程序(1)芯片變性水煮沸無氣泡后，放入芯片，變性90秒，取出，放入-20℃預(yù)冷的無水乙醇中驟冷2min，放入離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘甩干，備用。
(2)應(yīng)用商品化的不同試劑盒提取樣品中不同冠狀病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用每種病毒特異的引物混合組和通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)加入Cy3-dCTP。反應(yīng)體系如下所示。cDNA模板3μL、蒸餾水15.7μL、10倍Taq酶緩沖液(Mg2+free)2.5μL、MgCl21.5μL、dNTP(10∶1)0.5μL、引物(上下游混合引物)1μL、Taq酶0.3μL、Cy3-dCTP0.5μL。利用合成的通用引物，對(duì)BCV、CCV、FCV、FIPV、PRCV、HCV、TCV和TGEV的cDNA混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)條件為94℃變性5min；94℃、45sec，40℃、45sec，72℃、60sec，5個(gè)循環(huán)；94℃、45sec，50℃、60sec，72℃、60sec，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。
(3)cy-3標(biāo)記病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物芯片雜交液的配制將多重PCR對(duì)病毒cDNA的擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物放入Eppendorf Concentrator中。56℃，30~90分鐘抽干，加入5.5μL滅菌去離子水溶解，加入芯片雜交液，配制雜交反應(yīng)體系，其組成如下(按雜交模板的不同采用不同濃度的甲酰胺)PCR產(chǎn)物濃縮液5.5μL、20×SSC2.25μL、50×Denhardt’s1.5μL、甲酰胺(25％終濃度)3.75μL、50mM1270.5μL、2％SDS1.5μL。對(duì)混合好的PCR產(chǎn)物雜交體系，96℃變性5-10分鐘，然后立即放置冰上。
(4)基因芯片的雜交將變性好的芯片放入雜交盒中，雜交盒中預(yù)先加入200μL蒸餾水，將雜交反應(yīng)液加到芯片上，蓋好蓋，置42℃水浴鍋中雜交2-3h。
(5)基因芯片的洗滌雜交結(jié)束后，取出芯片，放入洗液I中，在42℃恒溫?fù)u床中100轉(zhuǎn)/分鐘，洗滌4-5分鐘，然后取出基因芯片，放入洗液II中，在42℃恒溫?fù)u床中100轉(zhuǎn)/分鐘，洗滌4分鐘，放入離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘甩干，備用。
(6)芯片掃描，數(shù)據(jù)分析。
5、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性參照點(diǎn)、雜交質(zhì)量控制點(diǎn)顯示很強(qiáng)的熒光信號(hào)，陰性對(duì)照點(diǎn)和空白對(duì)照點(diǎn)不顯示信號(hào)。
樣品多重PCR對(duì)應(yīng)的各點(diǎn)顯示很強(qiáng)的熒光信號(hào)為陽(yáng)性結(jié)果。
為驗(yàn)證本發(fā)明效果的可靠性，進(jìn)行以下鑒定1、不同冠狀病毒不同基因片段多重PCR的擴(kuò)增根據(jù)冠狀病毒基因芯片的點(diǎn)陣排布圖，確定每個(gè)點(diǎn)陣所對(duì)應(yīng)的基因克隆和相應(yīng)的引物，每一種病毒的3~5對(duì)引物分為一組，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用多重PCR引物對(duì)病毒cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)加入Cy3-dCTP隨機(jī)滲入標(biāo)記多重PCR產(chǎn)物，并與冠狀病毒基因芯片雜交，洗滌后用基因芯片掃描儀掃描，并用相關(guān)的軟件進(jìn)行分析，陽(yáng)性參照點(diǎn)、雜交質(zhì)量控制點(diǎn)和多重PCR對(duì)應(yīng)的各點(diǎn)均顯示很強(qiáng)的陽(yáng)性結(jié)果，而陰性對(duì)照點(diǎn)和空白對(duì)照點(diǎn)不顯示信號(hào)。
2、對(duì)病毒cDNA檢測(cè)的敏感性測(cè)定100倍稀釋的病毒cDNA多重PCR可以擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，但1000倍稀釋的cDNA多重PCR未能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。冠狀病毒基因芯片可檢測(cè)到105倍稀釋的病毒cDNA多重PCR擴(kuò)增標(biāo)記的產(chǎn)物，而對(duì)106倍稀釋的cDNA多重PCR擴(kuò)增標(biāo)記的產(chǎn)物的檢測(cè)，幾乎觀察不到信號(hào)。
權(quán)利要求
1.動(dòng)物源性產(chǎn)品中冠狀病毒檢測(cè)基因芯片，包括芯片以及固定在芯片上的核苷酸片斷，其特征在于固定在芯片上的核苷酸片斷為1～8種冠狀病毒相對(duì)應(yīng)的特征性cDNA片段的固相載體和每種病毒特異的引物混合組。
2.按權(quán)利要求1所述動(dòng)物源性產(chǎn)品中冠狀病毒檢測(cè)基因芯片，其特征在于8種冠狀病毒是牛冠狀病毒(BCV)、犬冠狀病毒(CCV)、貓冠狀病毒(FCVO)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、火雞冠狀病毒(TCV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和人呼吸道冠狀病毒(HCV)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)動(dòng)物源性產(chǎn)品中冠狀病毒的基因芯片，芯片固定了與8種冠狀病毒相對(duì)應(yīng)的特征性cDNA片段的固相載體、每種病毒特異的引物混合組。每種病毒特異的引物混合物為根據(jù)冠狀病毒基因芯片的點(diǎn)陣排布圖，確定每個(gè)點(diǎn)陣所對(duì)應(yīng)的基因克隆和相應(yīng)的引物，每一種病毒的3～5對(duì)引物分為一組。本發(fā)明陽(yáng)性參照點(diǎn)、雜交質(zhì)量控制點(diǎn)顯示很強(qiáng)的熒光信號(hào)，陰性對(duì)照點(diǎn)和空白對(duì)照點(diǎn)不顯示信號(hào)。樣品多重PCR對(duì)應(yīng)的各點(diǎn)顯示很強(qiáng)的熒光信號(hào)為陽(yáng)性結(jié)果。該方法檢測(cè)的靈敏度比PCR敏感1000倍，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、快速、高通量，能較好滿足目前對(duì)冠狀病毒檢測(cè)的需要，適用于進(jìn)出口檢疫、食品衛(wèi)生部門檢測(cè)等，易于大范圍推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101037712SQ200710067268
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者胡永強(qiáng), 陳沁 , 李健, 熊煒, 王權(quán), 張建武 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海大學(xué), 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所