專利名稱：：一種加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥物殘留分析和免疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及喹諾酮類的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，特別涉及一種加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：加替沙星(GAT)是一種喹諾酮類的廣譜抗生素，價格低廉，殺菌效果好，被廣泛用于治療人體和動物體的感染。但是，加替沙星在食物鏈中會累積殘留，并引起患者體內(nèi)血糖代謝異常，所以越來越多的國家設(shè)定了喹諾酮類的最高檢出限。鑒于此，為了保障人民身體健康，保證進出口動物源性產(chǎn)品的質(zhì)量，需要尋求一種快速、靈敏、方便的加替沙星殘留的檢測方法。己經(jīng)報道的檢測加替沙星殘留的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、色/質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS)和酶聯(lián)免疫法。HPLC和LC-MS都有高靈敏度、高特異性的特點，但是它們均為昂貴笨重且難以攜帶的儀器，并需大量的有機溶劑及費時的樣品處理過程。ELISA分析與其它方法相比，優(yōu)勢在于靈敏度高，特異性強，儀器設(shè)備要求不高，測定成本低，方法快速、簡便，試劑保存時間較長，自動化程度高，無放射性同位素污染，可現(xiàn)場操作且檢測批量大。故研究開發(fā)一種快速、靈敏、方便的加替沙星的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有直接的經(jīng)濟效益和社會效益。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種檢測加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)試劑；其特征在于，所述酶標(biāo)板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由加替沙星與卵清蛋白偶聯(lián)制成；所述試劑包括加替沙星的多克隆抗體、酶標(biāo)二抗即辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體、加替沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發(fā)光液。其中所述酶標(biāo)板優(yōu)選乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板。所述包被抗原濃度優(yōu)選5wg/mL。所述包被抗原制備具體由加替沙星通過EDC(碳二亞氨活化酯)法與分子量范圍是6.7KDa6.8KDa的卵清蛋白(0VA)偶聯(lián)制成。上述加替沙星的多克隆抗體的工作濃度優(yōu)選1:4000。所述加替沙星的多克隆抗體是由加替沙星通過EDC法與分子量范圍是6.7KDa6.8KDa的牛血清蛋白(BSA)偶合制成的偶聯(lián)物作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備得到；其涉及的反應(yīng)方程式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>上述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中所述辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體的工作濃度優(yōu)選1:1000。所述加替沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.05ng/mL、0.lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL禾口2ng/mL。所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaCl80g、KH貝2.0g、N&HTO,.12H2029.0g、KC12.Og的水溶液。所述濃縮洗滌液是含有體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的pH7.5、0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液。所述發(fā)光液是O.01M魯米諾與pH=8.8、O.OOIM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液和體積比濃度為3/10000&02的混合液。所述魯米諾為發(fā)光底物，對甲苯酚為發(fā)光增強劑。本發(fā)明的原理是將抗體-抗原反應(yīng)的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結(jié)合起來，利用酶催化底物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測產(chǎn)物濃度。用對甲苯酚作為增強發(fā)光反應(yīng)，其機理為自由基機理。其中涉及的發(fā)光反應(yīng)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>DMFEDCGAT4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒最低檢測限可達0.01ng/ml，線性檢測范圍在0.05-2ng/ml，板內(nèi)變異系數(shù)在4-19%以內(nèi)，尿樣品中回收率在83-113°/。之間。本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具備如下的特點(1)所制備的抗體對于加替沙星有著很高的特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)對尿樣中加替沙星的殘留進行專一的檢測和評定。(2)樣品前處理簡單，無需過柱凈化。(3)結(jié)果靈敏度高，性能穩(wěn)定，比傳統(tǒng)的比色酶聯(lián)免疫檢測法，有著更高的靈敏度和更低的檢測下限。圖1為本發(fā)明加替沙星抗體的抑制率曲線。圖2為本發(fā)明加替沙星抗體的工作曲線。具體實施方式實施例1加替沙星免疫原、包被抗原、及多克隆抗體的制備(1)免疫原的制備A，分別稱取GAT(加替沙星)15.0mg(40wmol)，EDC(碳二亞氨活化酯，76.5mg，400Pmol)，NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，22.5mg，200wmol)依次溶于5mLDMF(N-N二甲基甲酰胺)中，避光、室溫攪拌反應(yīng)24小時；B，將90.0mg(1.3wmol)cBSA(活化的牛血清蛋白)溶于10mLPBS(磷酸鹽緩沖液，O.OIM，pH7.4)中；C，將"A"反應(yīng)液緩慢加入到"B"反應(yīng)液中，室溫攪拌反應(yīng)3小時；反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，在0-4°C用PBS透析3天，其間每4-6小時換一次透析液；隨后用高純水透析3天，其間每4-6小時換一次透析液；透析完畢，用冷凍干燥機凍干，得白色絮狀固體即為加替沙星的免疫原，-20°C保存，備用。(2)包被抗原的制備稱取13mg(35wmol)GAT以500DMF促溶，加入到10mLPBS(0.01M，pH7.4)中，再將OVA(卵清蛋白，40mg，0.887pmol)、EDC67mg(350wmol)、NHS20rag(175/mol)依次溶于上述GAT溶液中，室溫攪拌反應(yīng)3小時。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，在0-4°C用PBS(0.01M，pH7.4)透析3天，其間每4-6小時換一次透析液；隨后用高純水透析3天，其間每4-6小時換一次透析液；透析完畢，用冷凍干燥機凍干，得白色絮狀固體即為包被抗原，-20°C保存，備用。(3)多克隆抗體的制備合成的免疫原被用來免疫兩只雄性新西蘭大白兔。首次免疫，用注射器對抽法將弗氏完全佐劑與免疫原按1:1混合成油包水的乳濁液，每只兔注射0.5mg免疫原，進行背部皮下多點注射(5-IO點)。首免兩周后第一次加強免疫用弗氏不完全佐劑與同樣量的抗原混合，進行第二次免疫，劑量、方法同首免。以后每隔兩周加強免疫一次，劑量減半。第五次不加佐劑只用生理鹽水進行末次免疫，注射七天后進行心臟采血。血液在4°C靜置過夜，次日10000g/min離心15分鐘，分離出抗血清，得到多克隆抗體。實施例2化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附檢測法(CL-ELISA)的建立(一)抗體與包被抗原濃度的優(yōu)選(方陣)酶標(biāo)板縱向用100z/L/孔的，濃度梯度按80.0//g/mL、40.Owg/mL、20.0//g/raL、10.Owg/mL、5.Owg/mL、2.5wg/mL、1.25//g/mL、和O.625wg/mL的包被抗原溶液包被，4。C放置過夜，用280/iL/孔的洗滌液洗板三次，再用250wL/孔封閉液封閉，室溫放置2.5小時，洗滌三次；橫向加入100/iL/孔，稀釋梯度按l:100、1:2001:51200的抗體溶液，室溫放置2小時，洗漆三次；加入100^L/孔的1:IOOO的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫放置l小時，洗滌三次；加入100^L/孔的發(fā)光液，測定發(fā)光值。以發(fā)光值隨包被抗原的濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進行特異性測定。(二)抗體靈敏度的測定(見圖l)經(jīng)上述方陣法優(yōu)選，申請人選擇包被抗原濃度為5;ig/mL，抗體濃度為1:4000，進行抗體的靈敏度的測定(1)包被過程用0.05MpH9.6的碳酸鹽緩沖液，將加替沙星的包被抗原配成g/mL的溶液，每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加lOOwL，4。C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，280wL/孔，每次5分鐘，拍干。(此步簡稱洗滌，下同)。(2)封閉過程用250;/L/孔的封閉液封閉上述已包被的酶標(biāo)板，室溫孵育2.5小時，洗滌。(3)競爭過程加稀釋抗體(1:2000)50wL/孔與不同濃度的藥物50wL/孔于上述已封閉的反應(yīng)孔中，室溫孵育2-4小時，洗滌。(4)酶標(biāo)過程于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體(1:1000)100wL/孔，室溫孵育1.5小時，洗滌。(5)發(fā)光過程于各反應(yīng)孔中加入IOO^L/孔臨時配制的發(fā)光液，立即用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測。(6)計算過程檢測結(jié)果以抑制率計算，％抑制率=%B/Bo，B是加入競爭者的發(fā)光值，Bo是沒有競爭者的發(fā)光值。計算50%抑制率時藥物的濃度即為該抗體的靈敏度。以加替沙星的濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，作圖得到抑制率曲線(圖l)。(三)工作曲線的建立(見圖2)(1)包被過程用0.05MpH9.6的碳酸鹽緩沖液，將加替沙星的包被抗原配成g/mL的溶液，每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加IOOaL，4。C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，280wL/孔，每次5分鐘，拍干。(此步簡稱洗滌，下同)。(2)封閉過程用250wL/孔的封閉液封閉上述已包被的酶標(biāo)板，室溫孵育2.5小時，洗滌。(3)競爭過程:加稀釋抗體(1:2000)50^L/孔與濃度梯度為0.05ng/mL、0.lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL和2ng/raL的加替沙星溶液50#L/孔于上述已封閉的反應(yīng)孔中，室溫孵育2-4小時，洗漆。(4)酶標(biāo)過程于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體(1:1000)100wL/孔,室溫孵育1.5小時，洗滌。(5)發(fā)光過程于各反應(yīng)孔中加入IOO^L/孔臨時配制的發(fā)光液，立即用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測。(6)計算過程檢測結(jié)果以抑制率計算，％抑制率=%B/Bo，B是加入競爭者的發(fā)光值，Bo是沒有競爭者的發(fā)光值。以加替沙星的濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，作圖得到工作曲線(圖2)。實施例3、本發(fā)明的檢測加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的組裝(1)檢測加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的組成a、包被有包被抗原(AOZ與卵清蛋白的偶聯(lián)物)的固相載體(乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板)；b、加替沙星抗體工作液(體積比濃度為1:4000);c、加替沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度分別為O.05ng/mL、0.lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL禾口2ng/mL;d、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體工作液(工作濃度為1:1000);e濃縮磷酸鹽緩沖溶液是每升含NaC180g、KH2PO42.0g、Na2HPO4.12H2O29.0g、KC12.0g的水溶液；f濃縮洗滌液是上述濃縮磷酸鹽緩沖液加入體積比濃度為0.05%的吐溫20(Tween20);g、發(fā)光液0.01M魯米諾+0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲垸溶液(pH8.8)十體積比濃度為3/10000的HA。(2)酶標(biāo)板的制備將包被抗原溶于包被液中，配成5ug/mL的溶液，酶標(biāo)板的每孔加入100iiL，4'C孵育過夜，傾去包被液，每孔加入280uL洗滌液洗滌3次，拍干，然后加入250uL/孔的封閉液,37'C孵育2h，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，用錫箔紙真空密封在4'C下保存。實施例4、本發(fā)明的加替沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒的測定程序(一)試劑盒使用的注意事項1)使用之前將所有試劑溫度升至室溫，使用后立刻將所有試劑放回冰箱，4'C下保存。2)在使用過程中務(wù)必不能讓微孔干燥。3)按照推薦的洗板順序操作。4)使用中避免光線直射,在孵育過程中用錫箔紙遮光。(二)試劑的準(zhǔn)備1)樣品稀釋液將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍后使用。2)洗滌液將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍后使用。3)發(fā)光液0.01M魯米諾+0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8)+3/10000(體積比)H202。(三)樣品前處理(1)水樣將水樣經(jīng)過0.45um的濾膜抽濾，然后加入體積比濃度為0.05%的吐溫-20。得到待測樣品。(2)牛奶將牛奶樣品在4'C、10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，脫除脂肪層；將脫脂的牛奶用洗滌液稀釋成1:10，得到待測樣品。(3)尿樣將尿樣品在4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，去掉沉淀，將剩余的豬尿用洗滌液稀釋成1:10。得到待測樣品。(4)動物組織取樣品與4mL0.1M的鹽酸混合，并且放在一起用超生波提取20rnin，然后10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15min，取上清液用10MNaOH調(diào)pH至9.5±0.5，旋渦振蕩5min，然后10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15min。取上清液加5mL異丁醇振蕩2min，混合物室溫下靜止15min，然后3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，分出有機相，水相再用異丁醇(每次lOmL)萃取兩次，三次萃取的有機相合并在一起，50-6CTC水浴減壓蒸干，殘余物用洗滌液重新溶解配成l:IO的溶液，得到待測樣品。(四)檢測步驟1)加樣向酶標(biāo)板中加入50yL/孔的加替沙星系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液或樣品溶液，然后加入加替沙星抗體工作液50yL/孔，室溫(25°C)恒溫孵育2.5h;2)洗滌傾出孔中液體，向酶標(biāo)板中加入280yL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；3)加酶標(biāo)二抗每孔加入酶標(biāo)二抗工作液100uL，室溫恒溫孵育1.5h;4)洗滌傾出孔中液體，向酶標(biāo)板中加入280yL/孔的洗漆液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；5)加發(fā)光液每孔加入發(fā)光液100nL;6)檢測用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強度。(五)結(jié)果判斷以所測得的標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光值，除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的發(fā)光值再乘以100，得到抑制率(B/BO)，以抑制率為縱坐標(biāo)，加替沙星濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。%抑制率二％標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光值(或樣品)/0標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光值。實施例5試劑盒特異性的試驗判定試劑盒特異性的指標(biāo)是交叉率，將加替沙星以及其他沙星類藥物配成濃度梯度，用試劑盒測定各藥物的ICs。值，每個藥物4個復(fù)孔，結(jié)果列于下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例6試劑盒精密度和準(zhǔn)確度試驗取0.05，0.1，0.2，0.5，1，2ppb的加替沙星標(biāo)樣，添加到水樣品中，來檢測加替沙星回收率。每個濃度的批間變異系數(shù)都以不同的5天的5個重復(fù)數(shù)據(jù)進行計算，批內(nèi)變異系數(shù)以同一天的5次重復(fù)數(shù)據(jù)計算。根據(jù)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程進行回收率的定量計算。結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上述測定結(jié)果看，變異系數(shù)低于19%，回收率在83-113%之間。表明本試劑盒的回收率比較吻合理論值，有著可靠的準(zhǔn)確度；而且變異系數(shù)較小，重復(fù)性好。9添加濃度(ppb)批內(nèi)回收率檢測結(jié)果變異回收率系數(shù)(ppb)(%)(%)批間回收率檢測結(jié)果變異回收率系數(shù)(ppb)(%)(%)檢測次數(shù)檢測次數(shù)權(quán)利要求1、一種加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)試劑；其特征在于，所述酶標(biāo)板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由加替沙星與卵清蛋白偶聯(lián)制成；所述試劑包括加替沙星的多克隆抗體、酶標(biāo)二抗即辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體、加替沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發(fā)光液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板為乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述包被抗原濃度為5//g/mL。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述卵清蛋白的分子量范圍是6.7KDa6.8KDa。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述加替沙星的多克隆抗體是由加替沙星與分子量范圍是6.7KDa6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶聯(lián)物作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備得到；其中所述加替沙星的多克隆抗體的工作濃度為1:4000。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體的工作濃度為1:1000。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述加替沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL禾口2ng/mL。8、根據(jù)權(quán)利要求l所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaCl80g、KH2P042.0g、Na2HP04.12H2029.0g、KCl2.0g的水溶液。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液是含有體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的pH7.5、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述發(fā)光液是0.01M魯米諾與pH=8.8、O.OOIM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液和體積比濃度為3/10000&02的混合液。全文摘要本發(fā)明公開了一種加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)試劑；其中所述酶標(biāo)板的各孔包被有包被抗原，包被抗原由加替沙星與卵清蛋白偶聯(lián)制成；所述試劑包括加替沙星的多克隆抗體、酶標(biāo)二抗即辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體、加替沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發(fā)光液。本發(fā)明的試劑盒具有靈敏度高、重復(fù)性好、簡便快速、準(zhǔn)確的特點，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數(shù)量級，有望在動物源性食品(如奶樣、動物組織樣)和尿樣的加替沙星殘留檢測中發(fā)揮重要作用。文檔編號G01N21/76GK101403752SQ20081015863公開日2009年4月8日申請日期2008年11月4日優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日發(fā)明者鍇丁,偉劉,劉中秋,尹偉偉,李偉華,郗日沫申請人:山東大學(xué)