專利名稱:一種定量檢測(cè)傳染性非典型肺炎冠狀病毒拷貝數(shù)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及診斷試劑領(lǐng)域,特別是涉及一種定量檢測(cè)病毒拷貝數(shù)的試劑盒。
基于TaqMan探針的熒光定量PCR技術(shù)是一種定量檢測(cè)病毒拷貝數(shù)的方法。德國(guó)ATRUS公司和中國(guó)華美生物工程公司已開(kāi)發(fā)出了用上述方法檢測(cè)SARS-COV的試劑盒。但ATRUS公司的HPA-Coronavirus LC RT PCR Reagents只是一套PCR擴(kuò)增和檢測(cè)試劑組合,沒(méi)提供相應(yīng)的標(biāo)本處理試劑和方案。而華美生物工程公司的SARS Coronavirus核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒只是一種定性試劑盒,無(wú)法提供定量病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明提供一種定量檢測(cè)傳染性非典型肺炎冠狀病毒拷貝數(shù)的試劑盒,克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種定量檢測(cè)傳染性非典型肺炎冠狀病毒拷貝數(shù)的試劑盒,可以定量檢測(cè)傳染性非典型肺炎冠狀病毒拷貝數(shù),克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。在實(shí)踐中,既可以對(duì)感染SARS病毒的人群進(jìn)行早期臨床診斷,也可以對(duì)病人的治療情況進(jìn)行定量檢測(cè),效果極為良好。
本發(fā)明的定量測(cè)定傳染性非典型肺炎冠狀病毒拷貝數(shù)的試劑盒,包含裂解液,硅膠吸附柱,洗滌液,洗脫液,引物,探針,定值標(biāo)準(zhǔn)品,陰性對(duì)照樣品,和酶混合物,其中,所述裂解液為裂解血清、血漿、液化痰液或漱口水標(biāo)本中病毒顆粒的硫氰酸胍溶液;所述洗滌液為含乙醇溶液;所述洗脫液低鹽緩沖液或水;所述引物為編碼傳染性非典型肺炎冠狀病毒基因組orflab區(qū)的序列;所述探針為T(mén)aqMan探針;所述酶混合物為逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA擴(kuò)增酶、dNTP;所述定值標(biāo)準(zhǔn)品為經(jīng)定量的編碼傳染性非典型肺炎冠狀病毒基因組orflab區(qū)的體外轉(zhuǎn)錄RNA。其中,所述硅膠吸附柱采用負(fù)壓抽提方法純化病毒RNA。
本發(fā)明的試劑盒對(duì)標(biāo)本處理沒(méi)有采用類似于中國(guó)華美生物工程公司的液相提取法,而是采用硅膠柱吸附純化法。該技術(shù)原應(yīng)用于各類科研用分子生物學(xué)試劑盒,其原理是利用病毒核酸與其他核酸、蛋白質(zhì)在不同條件下與硅膠吸附柱結(jié)合能力的差異,通過(guò)負(fù)壓抽提組件和含乙醇洗滌液,將非病毒核酸類雜質(zhì)去除,再用低鹽或水,將仍吸附于硅膠吸附柱上的病毒洗脫下來(lái)。將該技術(shù)應(yīng)用于本診斷試劑盒后,一方面避免了傳統(tǒng)方法中使用酚、氯仿、異戊醇等有毒試劑,另一方面引入機(jī)械化操作,減少了人為操作因素對(duì)結(jié)果的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員只需自行選用由一個(gè)負(fù)壓形成系統(tǒng)(如真空泵)和一個(gè)或若干個(gè)與硅膠吸附柱接口組成的負(fù)壓抽提組件,即可使用本硅膠柱吸附純化系統(tǒng)。
本發(fā)明的試劑盒中所用的引物和探針序列來(lái)自于傳染性非典型肺炎冠狀病毒基因組orflab開(kāi)放讀碼框架。其特征為傳染性非典型肺炎冠狀病毒所特有,而其他感染人的病毒所不含有。在特定實(shí)施例中,本發(fā)明所確認(rèn)的最優(yōu)引物序列為傳染性非典型肺炎冠狀病毒BJ03病毒株(GenBank編號(hào)AY278490.3)第18181-18200bp和第18261-18240bp,引物序列為5’-gtt tat cac ccg cga aga ag-3′和5′-tct cta gtt gca tga cag ccc t-3′。探針采用TaqMan探針類型,即在探針堿基兩段分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán),最優(yōu)探針序列為傳染性非典型肺炎冠狀病毒BJ03病毒株(GenBank編號(hào)AY278490.3)第18212-18235bp,TagMan探針序列為5′-FAM-gct cgt gcg tgg att ggc ttt gat-TAMRA-3′。在PCR擴(kuò)增時(shí),對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè),信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)檢測(cè)器閥值時(shí)的PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(CT)與標(biāo)本中模板數(shù)成正比。
由于PCR擴(kuò)增易受多種因素影響而擴(kuò)增失敗,使試劑盒使用人員得出檢測(cè)標(biāo)本為陰性的錯(cuò)誤結(jié)論。為避免試劑盒使用人員得出上述錯(cuò)誤判斷,本發(fā)明的試劑盒的最優(yōu)組成中使用內(nèi)參照擴(kuò)增質(zhì)控系統(tǒng),即在裂解液中加入特定序列的內(nèi)參照RNA,與標(biāo)本共同經(jīng)過(guò)裂解、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)各步驟。該內(nèi)參照RNA序列為一與待測(cè)標(biāo)本無(wú)關(guān)的質(zhì)粒片段(如pUC18質(zhì)粒片段),兩端含試劑盒中所用的引物序列,故可與待測(cè)標(biāo)本共用同一對(duì)引物擴(kuò)增。所用內(nèi)參照探針為包含特異性針對(duì)該無(wú)關(guān)序列的TagMan探針。如果檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)本、內(nèi)參照均為陰性,則表明擴(kuò)增失敗,實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效;如果檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)本陰性、內(nèi)參照陽(yáng)性或標(biāo)本陽(yáng)性、內(nèi)參照陽(yáng)性或標(biāo)本陽(yáng)性、內(nèi)參照陰性,則結(jié)果可信。在特定實(shí)施例中,當(dāng)試劑盒采用上節(jié)所述引物序列時(shí),所述內(nèi)參照是將pGEM-T質(zhì)粒與用引物5′-gtt tat cac ccg cga aga aga aag ttc tgc tat gtg gcg c-3′和5′-tct cta gtt gca tgacag ccc tga gta ctc aac caa gtc att-3′擴(kuò)增的pUC18質(zhì)粒片段連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后,體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA。不含內(nèi)參照的試劑盒盡管缺少了一道質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),但不影響正常使用。
本發(fā)明的試劑盒是一種定量檢測(cè)試劑盒,使用中需將待測(cè)標(biāo)本的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的CT值比較,求出待測(cè)標(biāo)本病毒拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品同步提取和擴(kuò)增得到。本發(fā)明的試劑盒采用的定值標(biāo)準(zhǔn)品為經(jīng)定量的編碼傳染性非典型肺炎冠狀病毒基因組orflab區(qū)片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA。其來(lái)源是通過(guò)從傳染性非典型肺炎患者液化痰液標(biāo)本中抽提病毒顆粒,RT-PCR獲得orflab區(qū)片段,接入質(zhì)粒后在大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增,最后將質(zhì)粒線性化后體外轉(zhuǎn)錄為RNA,并定量。較之常規(guī)的是以傳染性非典型肺炎患者病毒陽(yáng)性標(biāo)本做定值標(biāo)準(zhǔn)品的方法,本發(fā)明的試劑盒在安全性上有顯著優(yōu)勢(shì)。在特定實(shí)施例中,最優(yōu)選的體外轉(zhuǎn)錄片段是由序列為5′-atg aat tac caa gtc aat ggt tac-3′[傳染性非典型肺炎冠狀病毒BJ03病毒株(GenBank編號(hào)AY278490.3)第18149-18172bp]和5′-cat aac cagtcg gta cag cta c-3′[傳染性非典型肺炎冠狀病毒BJ03病毒株(GenBank編號(hào)AY278490.3)第18338-18317bp]的引物從病毒顆粒中RT-PCR得到。將pGEM-T質(zhì)粒(Promega公司)與上述擴(kuò)增獲得的orflab區(qū)基因片段連接后在大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增,最后將質(zhì)粒線性化后體外轉(zhuǎn)錄為RNA。
本發(fā)明的試劑盒的陰性對(duì)照采用健康人血清(各傳染性指標(biāo)如HBV,HCV,HIV,TP及SARS等均為陰性)。
本發(fā)明的試劑盒需配合熒光定量PCR儀使用。在特定實(shí)施例中,在使用不含內(nèi)參照的試劑盒配方時(shí),推薦的PCR儀為ROCHE公司Lightcycle型PCR儀。在使用含內(nèi)參照的試劑盒配方時(shí),推薦的PCR儀為MJ公司DNA Engine Opticon2型PCR儀。本領(lǐng)域技術(shù)人員亦可從BIO-RAD、Applied Biosystems等公司獲得同類的PCR儀。
標(biāo)本處理單元采用硫氰酸胍裂解病毒后負(fù)壓柱純化方法,要求配合負(fù)壓抽提組件使用。其組成包括1.裂解液4.8M硫氰酸胍,50mM Tris;2.硅膠吸附柱;3.洗滌液I2M硫氰酸胍,25mM Tris,30%乙醇;4.洗滌液II2mM NaCl,2mM Tris,80%乙醇;5.洗脫液DEPC處理過(guò)的純化水核酸擴(kuò)增定量檢測(cè)單元采用熒光定量PCR原理,要求配合熒光定量PCR儀使用。其組成包括1.PCR反應(yīng)液1.8mM dNTP,3.6mM DTT,3.6mM MgCl2,1.1μM引物一(序列5’-gtt tat cac ccg cga aga ag-3′),1.1μM引物二(序列5′-tctcta gtt gca tga cag ccc t-3′)及buffer;2.酶混合物0.6U/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,0.6U/μl Tag DNA聚合酶,1U/μl RNA酶抑制劑;3.探針10μM探針(序列5′-FAM-gtt cgt gcg tgg att ggc ttt gat-TAMRA-3′)4.陰性對(duì)照健康人血清;5.定量對(duì)照經(jīng)稀釋得到的拷貝數(shù)分別為1×102/ml、1×104/ml、1×106/ml的三支SARS-COV片段體外轉(zhuǎn)錄RNA實(shí)施例4 含內(nèi)參照的試劑盒各組分的配制與組裝試劑盒包括標(biāo)本處理單元和核酸擴(kuò)增定量檢測(cè)單元。
標(biāo)本處理單元采用硫氰酸胍裂解病毒后負(fù)壓柱純化方法,要求配合負(fù)壓抽提組件使用。其組成包括1.裂解液4.8M硫氰酸胍,50mM Tris,5000拷貝/毫升內(nèi)參照RNA;2.硅膠吸附柱;3.洗滌液I2M硫氰酸胍,25mM Tris,30%乙醇;4.洗滌液II2mM NaCl,2mM Tris,80%乙醇;5.洗脫液DEPC處理過(guò)的純化水核酸擴(kuò)增定量檢測(cè)單元采用熒光定量PCR原理,要求配合熒光定量PCR儀使用。其組成包括1.PCR反應(yīng)液1.8mM dNTP,3.6mM DTT,3.6mM MgCl2,1.1μM引物一(序列5’-gtt tat cac ccg cga aga ag-3′),1.1μM引物二(序列5′-tctcta ggt gca tga cag ccc t-3′)及buffer;2.酶混合物0.6U/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,0.6U/μl Tag DNA聚合酶,1U/μl RNA酶抑制劑;3.探針10μMSARS探針(序列5′-FAM-gtt cgt gcg tgg att ggc ttt gat-TAMRA-3′),5μM內(nèi)參照探針(序列5′-HEX-aag ttc tgc tat gtg gcg cgg tat-
TAMRA-3′)4.陰性對(duì)照健康人血清;5.定量對(duì)照經(jīng)稀釋得到的拷貝數(shù)分別為1×102/ml、1×104/ml、1×106/ml的三支SARS-COV片段體外轉(zhuǎn)錄RNA實(shí)施例5 試劑盒的使用取7個(gè)1.5ml離心管,編號(hào)P1、P2、P3、S0、S1、S2、S3,每管分別加入不同標(biāo)本100μl(見(jiàn)下表)
用帶濾芯吸嘴反復(fù)吹打5次后,再分別用帶濾芯吸嘴加入100μl裂解液,蓋上管蓋,振蕩混勻,離心數(shù)秒,置70℃反應(yīng)10分鐘,再用帶濾芯吸嘴加入110μl無(wú)水乙醇,振蕩混勻,離心數(shù)秒。將7支作好標(biāo)記的硅膠吸附柱固定在連接有真空泵(上海博匯真空泵廠)的接口基座上,將上述離心管內(nèi)液體移入硅膠吸附柱,開(kāi)啟真空泵,把柱內(nèi)的液體全部抽干。隨后在每個(gè)柱內(nèi)加入500μl洗滌液I,再開(kāi)啟真空泵,把柱內(nèi)的液體全部抽干。再在每個(gè)柱內(nèi)加入500μl洗滌液II,再開(kāi)啟真空泵,把柱內(nèi)的液體全部抽干。然后從接口基座上取下硅膠吸附柱,將其放入2ml離心管中,蓋上管蓋,14000rpm離心1分鐘。最后將柱放入新的2ml離心管中,在柱面中央各加50μl洗脫液,靜置1分鐘后10000rpm離心1分鐘,取2ml離心管中的收集液10μl做PCR反應(yīng)模板。
取PCR反應(yīng)液56μl,酶混合物20μl,熒光探針4μl混合,充分混勻后離心數(shù)秒,分裝至PCR毛細(xì)反應(yīng)管中,每管10μl,再分別加入10μl已處理好的標(biāo)本(即上述離心管中的洗脫液),離心數(shù)秒后放入LightCycler擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),參數(shù)設(shè)定為
選F1或F1/F2熒光檢測(cè)通道,將S1、S2、S3的拷貝數(shù)和對(duì)應(yīng)CT值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)P1、P2、P3的CT值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)的拷貝數(shù),結(jié)果如下
根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容,本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)即可對(duì)本發(fā)明所要求保護(hù)的定量檢測(cè)傳染性非典型肺炎冠狀病毒拷貝數(shù)的試劑盒進(jìn)行實(shí)施,并達(dá)到預(yù)期效果。本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述,但并不是構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員用顯而易見(jiàn)的相似替代物或改造,或用某些在化學(xué)上或生理上相關(guān)的制劑替代在此描述的制劑,或?qū)Ρ景l(fā)明的有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行變動(dòng),但不超出本發(fā)明的精神、范圍和思想,均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)傳染性非典型肺炎冠狀病毒拷貝數(shù)的試劑盒,包含裂解液,硅膠吸附柱,洗滌液,洗脫液,引物,探針,定值標(biāo)準(zhǔn)品,陰性對(duì)照樣品,和酶混合物,其中,所述裂解液為裂解血清、血漿、液化痰液或漱口水標(biāo)本中病毒顆粒的硫氰酸胍溶液;所述洗滌液為含乙醇溶液;所述洗脫液為低鹽緩沖液或水;所述引物為編碼傳染性非典型肺炎冠狀病毒基因組orflab區(qū)的序列;所述探針為T(mén)aqMan探針;所述酶混合物為逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA擴(kuò)增酶、dNTP;所述定值標(biāo)準(zhǔn)品為經(jīng)定量的編碼傳染性非典型肺炎冠狀病毒基因組orflab區(qū)的體外轉(zhuǎn)錄RNA。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其中,所述硅膠吸附柱采用負(fù)壓抽提方法純化病毒RNA。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其中,所述裂解液中含有濃度為200-10000拷貝數(shù)/毫升的內(nèi)參照,探針為SARS探針和內(nèi)參照探針的混合物。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒,其中,所述內(nèi)參照是包含引物序列和無(wú)關(guān)質(zhì)粒序列的體外轉(zhuǎn)錄RNA片段。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒,其中,內(nèi)參照所含無(wú)關(guān)質(zhì)粒序列來(lái)自pUC18質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其中,所述引物序列為5’-gtt tat cac ccg cga aga ag-3′和5′-tct cta gtt gca tga cag ccc t-3′。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其中,所述SARS探針序列為5′-FAM-gct cgt gcg tggatt ggc ttt gat-TAMRA-3′。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其中,所述定值標(biāo)準(zhǔn)品是由包含傳染性非典型肺炎冠狀病毒基因組orflab區(qū)基因片段的質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增、線性化、體外轉(zhuǎn)錄后所得到的產(chǎn)物。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒,其中,所述質(zhì)粒是將pGEM-T質(zhì)粒與用引物5′-atgaat tac caa gtc aat ggt tac-3′和5′-cat aac cag tcg gta cag cta c-3′從傳染性非典型肺炎冠狀病毒感染者液化痰液標(biāo)本中擴(kuò)增獲得orflab區(qū)基因片段連接獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種定量檢測(cè)傳染性非典型肺炎冠狀病毒拷貝數(shù)的試劑盒。該試劑盒標(biāo)本處理采用硅膠柱純化法,定量檢測(cè)采用TagMan探針熒光定量檢測(cè)原理,定量標(biāo)準(zhǔn)品為體外轉(zhuǎn)錄RNA。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1472342SQ0312955
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者華錦彪, 周科隆, 高愛(ài)武 申請(qǐng)人:上??迫A生物工程股份有限公司