專利名稱：：微生物快速測(cè)試卡及其使用方法微生物快速測(cè)試卡及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能快速檢測(cè)微生物的測(cè)試卡及其使用方法，屬于微生物檢驗(yàn)檢測(cè)裝置及其使用方法領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：隨著人們生活水平的不斷提高，食品安全問題越來越受到人們的重視，微生物對(duì)食品的污染問題也相應(yīng)地備受關(guān)注。在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物將大量繁殖而引起食品腐敗變質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致食源性感染和食物中毒。特別是近年來隨著環(huán)境污染的加劇和生態(tài)平衡的不斷破壞，可導(dǎo)致人類感染的致病菌種類越來越多，病原微生物對(duì)人類的威脅越來越大。采用適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)方法來對(duì)食品進(jìn)行檢測(cè)，是預(yù)防食源性中毒的重要手段。利用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，主要包括形態(tài)和生化檢驗(yàn)，其準(zhǔn)確性、靈敏性均較高；但涉及的實(shí)驗(yàn)較多、操作繁瑣、需要時(shí)間較長(zhǎng)、準(zhǔn)備和收尾工作繁重。為此，人們相繼提出了一系列簡(jiǎn)便、快捷、敏感、準(zhǔn)確的檢測(cè)新思路?？焖贉y(cè)試片法是近年來得到快速發(fā)展的一種新型的檢測(cè)方法。微生物快速測(cè)試卡是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)通過特定凝膠劑粘附在載體上而制成的，通過微生物在上面的生長(zhǎng)、顯色來測(cè)試食品中污染的微生物。測(cè)試卡始創(chuàng)于1955年，德國學(xué)者FJ.Forg發(fā)明了一種簡(jiǎn)單快速的大腸菌群快速檢測(cè)法——紙片法，使檢測(cè)周期由72小時(shí)縮短到15小時(shí)，材料成本降低了3/4，同時(shí)大大簡(jiǎn)化了操作程序。從此，這種集化學(xué)、高分子學(xué)和微生物學(xué)于一體的檢測(cè)方法開始發(fā)展起來。快速測(cè)試卡檢測(cè)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)第一，對(duì)樣品的數(shù)量要求較低，檢樣前一般不需要進(jìn)行培養(yǎng)基的制備和器皿的滅菌，也不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)器材，觀察結(jié)果后只需滅菌不需要清洗工作，因而能大大減少檢測(cè)的工作量，縮短檢測(cè)周期，操作簡(jiǎn)便迅速，故適用于實(shí)驗(yàn)條件有限的基層實(shí)驗(yàn)室、生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)和野外環(huán)境工作使用；第二，由于測(cè)試卡體積較小便于運(yùn)輸、保存、攜帶和滅菌，除紙片等載體外不產(chǎn)生其他任何廢液廢物，大大減少對(duì)環(huán)境的污染。第三，測(cè)試卡檢樣所需的時(shí)間較短，降低了因檢樣存放時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致被檢測(cè)微生物增殖而影響了定量計(jì)數(shù)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。另外，測(cè)試卡也適合不宜采用瓊脂傾注法的受傷損微生物的檢測(cè)。近年來國內(nèi)以濾紙為載體的測(cè)試卡和美國3M公司以Petrifilm為載體的測(cè)試卡已逐步被應(yīng)用。但是現(xiàn)有的快速測(cè)試片仍存在許多問題國內(nèi)的測(cè)試卡產(chǎn)品用濾紙作載體，濾孔過大，導(dǎo)致濾紙雙面都有菌落生長(zhǎng)而難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；濾紙保水性差，檢驗(yàn)培養(yǎng)中又不能保持濕度，不利于菌體生長(zhǎng)；濾紙測(cè)試卡還存在營養(yǎng)物質(zhì)分布不均勻的問題，檢樣液由于不能迅速擴(kuò)散，從而導(dǎo)致菌落生長(zhǎng)和分布不均勻；另外，由于顯色指示劑系統(tǒng)單一，國內(nèi)的測(cè)試卡產(chǎn)品不能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，真菌測(cè)i式卡產(chǎn)品用于酵母菌的檢測(cè)存在同樣的問題，所以難以全面推廣。3MPetrifilm測(cè)試片上覆蓋一層薄膜，當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)氣、產(chǎn)粘液過多時(shí)會(huì)出現(xiàn)菌落的擴(kuò)散和融合，影響計(jì)數(shù)；其次凝膠劑吸水比較緩慢，如果操作不慎，會(huì)使檢樣液從邊緣流出，從而影響結(jié)果；Petrifilm使用不同明的底板材料，因此難以通過自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)；同時(shí)，進(jìn)口產(chǎn)品價(jià)格昂貴，不易被國內(nèi)客戶所接受。因此，開發(fā)具有自主產(chǎn)權(quán)的、更方便計(jì)數(shù)的測(cè)試卡，對(duì)我國微生物快速檢測(cè)的發(fā)展具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種價(jià)格低廉，使用方便，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確的微生物快速測(cè)試卡，并提供一種使用所述測(cè)試卡的方法。本發(fā)明所述的微生物快速測(cè)試卡，包括下上依次粘合的底板、吹塑紙、薄膜；底板上粘有微生物生長(zhǎng)需要的營養(yǎng)物質(zhì)(營養(yǎng)物質(zhì)及其使用量的選擇參照GB/T4789.1-152003及GB/T4789.282003)及菌落顯色需要的顯色劑(顯色劑及其使用量的選擇參照1.Manafi，M.，Kneifel，W.andBascomb，S.1991.Fluorogenicandchromogenicsubstratesusedinbacterialdiagnostics.Microbial.Rev.55:335—348.2.Manafi，M.1996,Flurogenicandchromogenicenzymesubstratesinculturemediaandidentificationtests.Int.J.FoodMicrobiol.31:45-58.3.Manafi，M.0ECDWorkshopMolecularMethodsforSafeDrinkingWater.Interlaken'98.4.Manafi，M.2000.Newdevelopmentsinchromogenicandflurogenicculturemedia.Int.J.FoodMicrobiol.60:205-218.5.盧勉飛，吳清平，劉云林等.特異性酶反應(yīng)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15(3):354-356.);吹塑紙粘著在底板上，其中間有一鏤空；薄膜粘著在吹塑紙上，薄膜上粘有吸水性凝膠劑。粘著劑為無毒膠體，如環(huán)氧樹脂、水性聚氨酯等。其中所述的底板可以是透明的，其選用過塑紙板或尼龍類物質(zhì)為材料；也可以是不透明的，其選用聚酯、聚乙烯類或聚丙烯類物質(zhì)為材料；厚度為O.10.25mm，長(zhǎng)度為7.510cm,寬度為7.09.Ocm。其中所述的吹塑紙厚度為O.080.3mm,其中間的鏤空是直徑為6cm的圓形。其中所述的薄膜可選用聚酯、聚乙烯類或聚丙烯類物質(zhì)為材料，厚度為0.050.12mm,長(zhǎng)度為7.510cm，寬度為7.09.Ocm。其中所述的吸水性凝膠劑含有聚丙烯酸鈉、黃原膠與刺槐豆膠，其制備方法包括以下步驟(1)分別粉碎聚丙烯酸鈉、黃原膠和剌槐豆膠，過160目以上篩；(2)將粉碎后的黃原膠和刺槐豆膠以3:25的質(zhì)量比混合均勻；(3)將上述混合物與粉碎后聚丙烯酸鈉以5:0.82.0的質(zhì)量比混合均勻即得所述的凝膠劑。(4)過篩法測(cè)凝膠劑的吸水率與粘度，以膠體不易流動(dòng)(粘度大于1600mpa.s)和吸水率大于100g/g為符合要求。其中所述的聚丙烯酸鈉的合成方法包括以下步驟-(1)將濃度為30%(g/g)的氫氧化鈉溶液加入丙烯酸中，使中和度達(dá)到55%80%;(2)加去離子水調(diào)節(jié)丙烯酸單體濃度至30%60%(g/g);(3)加入丙烯酸單體0.1%0.8%(g/g)的交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺后混勻；(4)在吹氮?dú)獾那闆r下加入丙烯酸單體0.3%0.6M(g/g)的引發(fā)劑過硫酸銨；(5)吹氮?dú)怛?qū)氧密封，置恒溫干燥箱中5(TC8(TC聚合36h;(6)用75%乙醇洗去未反應(yīng)的單體、低聚物等；(7)將膠體切成小塊后于105'C烘干。本發(fā)明所述的使用方法包括以下步驟-(1)將測(cè)試卡滅菌，優(yōu)選輻射滅菌(Co-60Y射線，輻射劑量為30007000Gy);(2)揭開測(cè)試卡的上層薄膜，將檢樣液lml加于測(cè)試卡中間鏤空形成的凹面內(nèi)，然后將薄膜輕輕放下，使樣液均勻分散于培養(yǎng)區(qū)；(3)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。本發(fā)明所述的測(cè)試卡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，攜帶便利，成本低廉，并且測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確。此外，優(yōu)選的聚酯、聚乙烯類或聚丙烯類物質(zhì)為材料的透明底板，可按需要選擇多種顏色的計(jì)數(shù)背景卡或通過自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，使計(jì)數(shù)更簡(jiǎn)易；其次，所用的材料均為常見的化工產(chǎn)品，使取材更簡(jiǎn)便，成本進(jìn)一步降低；再次，吹塑紙中間優(yōu)選的直徑6cm的圓形鏤空，使lml菌液剛好能在該面積上分散均勻，生長(zhǎng)更良好，結(jié)果更準(zhǔn)確。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:微生物快速測(cè)試卡檢測(cè)大腸桿菌(1)將環(huán)氧樹脂膠液均勻噴在聚乙烯透明薄膜上，吸水性凝膠劑過200目篩后通過環(huán)氧樹脂膠粘著在薄膜上；(2)將環(huán)氧樹脂膠液均勻噴在不透明尼龍紙板上，可檢測(cè)大腸桿菌的培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯1^末和顯色劑TTC混合均勻后粘著在尼龍板上；(3)將上述制作完畢的薄膜、底板和吹塑紙裁剪為長(zhǎng)8.0cm、寬7.0cm的規(guī)格；(4)將上述剪好的三部分用環(huán)氧樹脂膠液粘合在一起；(5)測(cè)試卡Co-60Y射線輻照滅菌，輻射劑量為5000Gy;(6)配制大腸桿菌菌液，做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；(7)分別用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法與上述制得的微生物快速測(cè)試卡對(duì)大腸桿菌菌液樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，其結(jié)果如下表l;(8)結(jié)果表明本發(fā)明所述的微生物快速測(cè)試卡的檢測(cè)準(zhǔn)確性與培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法相同。表1微生物快速測(cè)試卡檢測(cè)大腸桿菌效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2:微生物快速測(cè)試卡檢測(cè)釀酒酵母(1)將環(huán)氧樹脂膠液均勻噴在聚乙烯透明薄膜上，吸水性凝膠劑過200目篩后通過環(huán)氧樹脂膠黏著在薄膜上；(2)將環(huán)氧樹脂膠液均勻噴在透明聚酯板上，可檢測(cè)釀酒酵母的YPD粉末和顯色劑四氮唑藍(lán)混合均勻后黏著在尼龍板上；(3)將上述制作完畢的薄膜、底板和吹塑紙裁剪為長(zhǎng)8.5cm、寬7.2cm的規(guī)格；(4)將上述剪好的三部分用環(huán)氧樹脂膠液粘合在一起；(5)測(cè)試卡Co-60Y射線輻照滅菌，輻射劑量為5000Gy;(6)配制釀酒酵母菌液，做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；(7)分別用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法與上述制得的微生物快速測(cè)試卡對(duì)釀酒酵母菌液樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，其結(jié)果如下表2;(8)結(jié)果表明兩種檢測(cè)方式所得的結(jié)果無顯著差異，說明本發(fā)明所述的微生物快速測(cè)試卡的檢測(cè)準(zhǔn)確性與培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法相同。表2微生物快速測(cè)試卡檢測(cè)釀酒酵母效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.微生物快速測(cè)試卡，其特征在于包括從下到上依次粘合的底板、吹塑紙和薄膜；其中底板上粘有微生物生長(zhǎng)需要的營養(yǎng)物質(zhì)及菌落顯色劑，粘著在底板上的吹塑紙中間有一鏤空，粘著在吹塑紙上的薄膜底面粘有吸水性凝膠劑。2.如權(quán)利要求1所述的微生物快速測(cè)試卡，其特征在于其中的底板選用聚酯、聚乙烯類或聚丙烯類物質(zhì)為材料。3.如權(quán)利要求1所述的微生物快速測(cè)試卡，其特征在于其中的底板選用過塑紙板或尼龍類物質(zhì)為材料。4.如權(quán)利要求1或2或3所述的微生物快速測(cè)試卡，其特征在于其中的底板厚度為O.10.25跳長(zhǎng)度為7.510cm，寬度為7.09.Ocm。5.如權(quán)利要求l所述的微生物快速測(cè)試卡，其特征在于其中的吹塑紙中間的鏤空是直徑為6cm的圓形。6.如權(quán)利要求5所述的微生物快速測(cè)試卡，其特征在于其中的吹塑紙厚度為0.080.3mm。7.如權(quán)利要求1所述的微生物快速測(cè)試卡，其特征在于其中的薄膜是選用聚酯或聚乙烯類或聚丙烯類物質(zhì)為材料。8.如權(quán)利要求7所述的微生物快速測(cè)試卡，其特征在于其中的薄膜厚度為0.050.12mm，長(zhǎng)度為7.510cm，寬度為7.09.Ocm。9.如權(quán)利要求1所述的微生物快速測(cè)試卡的使用方法，其特征在于使用步驟為(1)將測(cè)試卡滅菌；(2)無菌條件下打開測(cè)試卡的上層薄膜蓋，將樣液加于測(cè)試卡中間鏤空形成的凹面內(nèi)，然后將薄膜蓋輕輕合上，使樣液均勻分散于培養(yǎng)區(qū)；(3)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。10.如權(quán)利要求9所述的使用方法，其特征在于樣液的加入量為lmL。全文摘要本發(fā)明涉及一種能快速檢測(cè)微生物的測(cè)試卡及其使用方法，屬于微生物檢驗(yàn)檢測(cè)裝置及其使用方法領(lǐng)域。本發(fā)明所述的微生物快速測(cè)試卡，包括從下到上依次互相粘合的底板、吹塑紙和薄膜；其中底板上粘有微生物生長(zhǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)及菌落顯色劑，吹塑紙中間有直徑為6cm的圓形鏤空，薄膜上粘有吸水性凝膠劑。本發(fā)明所述的測(cè)試卡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，攜帶便利，成本低廉，并且測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101096634SQ20071002904公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年7月6日優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日發(fā)明者吳清平,永孫,蔡芷荷,黃汝添申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所;廣東環(huán)凱微生物科技有限公司