檢測血液中微生物的方法及裝置的制造方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及微生物檢測，特別是血液中的微生物的檢測方法、宿主感染病原體的 檢測方法及其裝置。
【背景技術】
[0002] 基于宿主與微生物的關系，宿主中的微生物可分為多種，包括正常菌群、與宿主共 生的包括寄生的微生物、引起機體感染致病的微生物--病原體等。宿主的血漿含有游離 DNA，包括來源于宿主的和來源于微生物的游離DNA片段。
[0003] 不明原因發(fā)熱（fever of undetermined origin, fever of unknown origin，F(xiàn)UO)，是指反復發(fā)熱超過38. 3°C，病程持續(xù)3周以上，并且經(jīng)1周詳細的檢查仍無 法明確診斷的疾病。根據(jù)潛在病因將FU0分為4種亞型-經(jīng)典型（classic FU0)、院內(nèi)型 (nosocomial FU0)、免疫缺陷型（neutropenic FU0)和 HIV相關型（HIV associated FU0)。
[0004] 據(jù)文獻報道，目前FU0大約占發(fā)熱病例的10%，其確診率大約在90%左右。在已 確診的病例中，感染性疾病大約占到50% -55%，其中細菌感染大約占感染性疾病75%，占 診斷明確疾病40%左右；病毒感染大約占感染性疾病20%，占診斷明確疾病10%左右；其 他感染約占感染性疾病4%，占診斷明確疾病2%左右，包括真菌感染、支原體感染、立克次 體感染、及寄生蟲感染。非感染性疾病占45% -50%，其中自身免疫疾病約占非感染性疾病 50%，占診斷明確疾病23%左右；腫瘤性疾病占非感染性疾病49%，占診斷明確疾病16%。
[0005] 不明原因發(fā)熱的診斷關鍵在找出病因，臨床上主要應鑒別4類疾病，即感染性疾 病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病及其他可引起發(fā)熱的疾病。目前針對不明原因發(fā)熱病因診斷 展開了大量的研究，研究證明感染仍是不明原因發(fā)熱研究性報告中最為普遍的病因。
[0006] 目前，不明原因發(fā)熱明確診斷方法中以血清學和（或）細菌學為主，其次為組織學 活檢，再次為臨床過程和（或）治療反應、影像學檢查、體液或骨髓檢查、手術探查。這些技 術在臨床診斷中已發(fā)揮了巨大的作用，但仍存在一些不足之處，例如培養(yǎng)技術繁瑣而費時， 組織學活檢及手術探查等可能會給病人帶來痛苦及負擔，這些不足之處需要應用新的技術 去彌補。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明一方面提供一種檢測血液中微生物的方法，微生物包括細菌、病毒和真菌， 包括：（1)提取血液樣本核酸，對核酸的至少一部分進行序列測定，獲得測序數(shù)據(jù)；（2)去除 (1)中的測序數(shù)據(jù)中的宿主測序數(shù)據(jù)；(3)將（2)中余下的測序數(shù)據(jù)比對到微生物參考數(shù)據(jù) 庫，獲得比對結果，所說的微生物參考數(shù)據(jù)庫包含多種細菌的參考序列和多種病毒的參考 基序列；(4)依據(jù)（3)的比對結果，確定微生物包含的物種及物種的豐度。
[0008] 本發(fā)明的另一方面提供一種確定宿主感染病原體的方法，所說的宿主包括人和哺 乳動物，所說的病原體包括致病細菌和/或致病病毒，該方法包括：（1)提取宿主血液樣本 核酸，對核酸的至少一部分進行序列測定，獲得測序數(shù)據(jù)；（2)去除（1)中的測序數(shù)據(jù)中的 宿主測序數(shù)據(jù)；（3)將（2)中余下的測序數(shù)據(jù)比對到病原體參考數(shù)據(jù)庫，獲得比對結果；(4) 依據(jù)（3)的比對結果，確定樣本包含的致病物種及其豐度；（5)將（4)中致病物種的豐度與 所述致病物種的不致病豐度進行比較，兩者有顯著性差異則確定該宿主感染這種病原體。
[0009] 本發(fā)明的再一方面提供一種確定宿主感染病原體的裝置，該裝置包括：A.核酸提 取單元，用于提取宿主血液/血漿/血清樣本核酸，對核酸的至少一部分進行序列測定，獲 得測序數(shù)據(jù)；B.數(shù)據(jù)去除單元，連接A單元，用于接收A中的測序數(shù)據(jù)，去除測序數(shù)據(jù)中的 宿主測序數(shù)據(jù)；C.比對單元，連接B單元或者連接A和B單元，用于將B中余下的測序數(shù)據(jù) 比對到病原體參考數(shù)據(jù)庫，獲得比對結果；D.豐度計算單元，與C單元連接，用于接收C中 的比對結果，確定樣本包含的病原體種類及各種病原體的豐度；E.判定單元，與D單元連 接，用于接收D中的致病物種的豐度，將致病物種的豐度與該致病物種的不致病豐度進行 比較，二者有顯著性差異則確定宿主感染該致病物種。
[0010] 本發(fā)明提供的血液微生物的檢測方法、檢測宿主感染病原體的方法和裝置，是基 于新一代的高通量測序技術來進行的，本發(fā)明提供的方法只需要宿主的血液/血漿/血清 即可，與組織學活檢及手術探查等技術相比可以大大的減輕受檢者的痛苦。同時，本發(fā)明的 方法僅需要2-3天左右的時間，可以盡早的為受檢者找到相關的微生物或病原體，以便及 時的調(diào)整治療方案以解除受檢者或者患者的痛苦。此外，本發(fā)明的方法或裝置的成本也相 對較低，通量高，符合大多數(shù)受檢者或患者的支付水平，可以在臨床中廣泛推廣，快速檢測 用于輔助臨床診斷。還可用于血質(zhì)的檢測，利于健康輸血用血。
【附圖說明】
[0011] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施方式的描述中將 變得明顯和容易理解，其中：
[0012] 圖1是本發(fā)明的一個【具體實施方式】中的四個血漿樣本病原體細菌豐度 (abundance2)表達值前10位的數(shù)據(jù)趨勢圖；
[0013] 圖2是本發(fā)明的一個【具體實施方式】中的四個血漿樣本病原體病毒豐度 (abundance2)表達值前10位的數(shù)據(jù)趨勢圖；
[0014] 圖3是本發(fā)明的一個【具體實施方式】中的不明原因發(fā)熱病原體檢測信息分析流程 示意圖。
【具體實施方式】
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，提供了一種檢測血液中微生物的方法，所說的微生 物包括細菌、病毒和真菌，該方法包括如下步驟：
[0016] 步驟一：獲得血液樣本核酸測序數(shù)據(jù)
[0017] 所說的血液樣本，包括全血樣本、血漿樣本和/或血清樣本。獲得宿主血液樣本 后，可處理血液樣本獲得血清或者血漿樣本，提取血清或血漿中的核酸，對核酸的至少一部 分進行序列測定，獲得測序數(shù)據(jù)。血漿或血清中的核酸為游離核酸，為來自宿主以及宿主 中的微生物的核酸混合物。這邊的宿主可以是人也可以是其它哺乳動物，這邊核酸可以是 DNA，也可以是RNA，測定DNA和/或RNA的序列，可以依據(jù)所選用的測序方法進行相應的 文庫制備，可選用的測序方法根據(jù)來自的測序平臺包括但不限于BGISEQ1000、BGISEQ100、 Illumina/Solexa、ABI/SOLiD和Roche 454,依據(jù)所選測序平臺進行相應的單端或雙端測 序文庫的制備。根據(jù)本發(fā)明一種【具體實施方式】，宿主是人，提取的核酸是人血漿中游離DNA， 利用華大基因（BGI)的BGISEQ100平臺及其DNA文庫構建說明DNA測序，獲得測序數(shù)據(jù)，測 序數(shù)據(jù)由多個測序序列（reads，讀段）組成。在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，獲得測序數(shù) 據(jù)后，還去除獲自BGISEQ100平臺的測序數(shù)據(jù)中小于50bp的讀段，因為獲自BGISEQ100的 讀段長度不一，這樣較嚴格的去掉較短的讀段能提高整體讀段的質(zhì)量，提高數(shù)據(jù)利用率，利 于后續(xù)準確檢測。
[0018] 步驟二：去除測序數(shù)據(jù)中的宿豐測序數(shù)據(jù)
[0019] 將步驟一的測序數(shù)據(jù)比對到宿主人的參考序列上，將比對上人參考序列的測序數(shù) 據(jù)去除。參考序列為已知序列，他人公開或是自己測定。人的參考序列可以是已知的基因 組或是已知的基因組的一部分序列，比如組裝片段。序列比對可以利用已知軟件比如SOAP 或BWA來進行。在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，人參考基因組為HG19,獲自NCBI網(wǎng)站，t匕 對是利用Life Technologies的TMAP軟件進行的，將比對上HG19的讀段去除，屏蔽掉比對 上的序列，得到非人的測序數(shù)據(jù)。去除大量的宿主源的數(shù)據(jù)，減少對微生物源核酸數(shù)據(jù)的干 擾，便于后續(xù)微生物檢測鑒定。
[0020] 步驟三：獲得金下的測序數(shù)據(jù)的比對結果
[0021] 將步驟二中余下的測序數(shù)據(jù)比對到微生物參考數(shù)據(jù)庫，獲得比對結果，所說的微 生物參考數(shù)據(jù)庫包括多種細菌的參考基因序列和多種病毒的參考序列。細菌或病毒的參考 序列可以是已知的該細菌或病毒的基因組或是基因組的一部分序列，比如該細菌/病毒的 組裝片段。細菌或病毒基因序列可以獲自公開數(shù)據(jù)庫，比如NCBI。在本發(fā)明的一個具體實 施方式中，選擇各種與人相關的細菌和病毒的參考基因組，分別構成細菌參考數(shù)據(jù)庫和病 毒參考數(shù)據(jù)庫。針對細菌參考數(shù)據(jù)庫中的每種細菌選擇其一株菌株，優(yōu)先選擇遺傳信息數(shù) 據(jù)最多的菌株，這樣可以保證細菌參考數(shù)據(jù)庫物種的唯一性和全面性，以免受到物種內(nèi)不 同菌株由于高度近緣，序列高度相似而影響物種的定量分析；病毒參考數(shù)據(jù)庫包含所有與 宿主人相關的病毒全基因組序列，由于病毒變異較大，所以保留同種病毒不同亞型，即某種 病毒的參考基因組包括該病毒的所有亞型的參考基因組，且選擇基因組大小為600bp以上 的病毒株的基因組作為參考序列。
[0022] 步驟四：確定檢測到的微牛物物種及各物種的豐度
[0023] 依據(jù)步驟三的比對結果，確定樣本中包含的微生物種類及各物種的豐度。在本 發(fā)明的一個【具體實施方式】中，根據(jù)與細菌和/或病毒數(shù)據(jù)庫的比對結果，確定樣本中細 菌或病毒源核酸表達豐度。各微生物物種的量化，即表達豐度，包括依據(jù)比對結果中比 對上該物種的測序數(shù)據(jù)計算得到的該物種的覆蓋度和覆蓋深度。在本發(fā)明的一個具體 實施方式中，根據(jù)覆蓋度和深度信息推演獲得以下兩組病原體量化公式：公式I :豐度
:,其中，i表示物種；和/或，公式II :

j表示與物種i同一參考數(shù)據(jù)