專利名稱：草酸診斷/測定試劑盒及草酸濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種草酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定草酸濃度 的方法，屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域。
技術背景草酸作為一種最簡單的二元羧酸，普遍存在于植物界中，植物草酸具有 重要的生理功能，并且在植物抗逆性中發(fā)揮積極作用。草酸多以鉀鹽或媽鹽 的形式存在，而在秋海棠、芭蕉中卻以游離酸的形式存在，草酸有毒，能溶 解于水。草酸是一種重要的化工原料，廣泛用于醫(yī)藥、染料、涂料、稀土金 屬的分離和提純以及衣物的漂白。測定草酸的方法有離子色譜法、電導離子色譜法、HPLC方法。臨床上大多數(shù)結石屬草酸鈣結石。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術，計量通過酶聯(lián)反應 生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導致 在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定草酸濃度的方法，同時，本 發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的草酸診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以 在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行草酸濃度測定，而且測定速 度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發(fā)明草酸濃度測定方法原理如下-草酸+氧草酸氧化酶 二氧化碳+過氧化氫 過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水這個方法應用草酸氧化酶(oxalate oxidase; EC 1.2.3.4)偶聯(lián)過氧化物酶 (peroxidase ; EC 1.11丄7)酶促反應終點/速率比色法。草酸氧化酶酶解草 酸反應產(chǎn)生過氧化氫，再通過過氧化物酶的作用下，將無色的還原型色原體 組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400—700nm(根 據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染料一B引嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大?。煌ㄟ^測 量400—700nrn (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的程度/ 速度，得出草酸濃度大小測定結果。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 如下成分關系的本發(fā)明草酸診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑 過氧化物酶 草酸氧化酶 還原型色原體組合500 mmol/L 30000 U/L 1畫0U/L 0.1-20 mmol/L所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙1^乙基~^^- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-齊基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3- 甲基-2-苯噻唑酮腙 2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3_甲基_2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻哇-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本發(fā)明的草酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試劑盒可 以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、草酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、草酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、過氧化物酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、草酸氧化酶在試劑l、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的草酸診斷/測定試劑為單試劑，包括-三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L草酸氧化酶 10000 U/L過氧化物酶 30000 U/L4-氨基抗砒 2 mmol/L石碳酸 10 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，測試主波長505nm，測試副波長600nm，被測草酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。實施例二本實施例的草酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括-試劑l三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 0.2 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 草酸氧化酶 過氧化物酶 4-氨基抗砒500 mmol/L 10000 U/L 30000 U/L0.6 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間IO分鐘，測試主波長546nm，測試副波長600nm，被測草酸樣品與試劑的體積比例為1/20，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。實施例三 ' 本實施例的草酸診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑3-甲基-2-苯噻唑酮腙100 mmol/L 50 mmol/L 0.6 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L過氧化物酶 30000 U/L雙甲基苯胺 2mmol/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L草酸氧化酶 10000 U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37i:，反應時間10分鐘，測試主波長578nm,測試副波長660nm，被測草酸樣品與試劑的體積比例為1/30，反應 方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約O分鐘 左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出草酸的濃度 大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原 體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不 另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分析儀器 得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)量污染。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法技術的草酸濃度測定方法，其方法原理如下草酸+氧 草酸氧化酶 二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出草酸濃度大小測定結果。
2. —種草酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括-緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L過氧化物酶 500——80000 U/L草酸氧化酶 1000——80000 U/L還原型色原體組合 0.1——20mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據(jù)權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成單 劑試劑。4. 根據(jù)權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成雙 劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、草酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。5. 根據(jù)權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶組成。過氧化物酶、還原型色原體組合草酸 氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。6. 根據(jù)權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基""N- G-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3_甲基_2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 ，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2,4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒 6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒3,5-雙氯石碳酸磺酸 4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻挫-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的草酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定草酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、草酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出草酸濃度的大小。
文檔編號C12Q1/26GK101329333SQ20071002472
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司