專利名稱：麥芽糖測(cè)定試劑盒及麥芽糖的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種麥芽糖測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定麥芽糖濃 度的方法，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
麥芽糖分子為無(wú)色或白色晶體，還原性二糖，有醛基反應(yīng)，能發(fā)生銀鏡 反應(yīng)，也能與班氏試劑(用硫酸銅、碳酸鈉或苛性鈉、檸檬酸鈉等溶液配 制)共熱生成磚紅色氧化亞銅沉淀。能使溴水褪色，被氧化成麥芽糖酸。 用作食品、營(yíng)養(yǎng)劑等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù) 監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得 以測(cè)定麥芽糖濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的麥芽 糖測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生 化分析儀上進(jìn)行麥芽糖濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以 得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明麥芽糖濃度測(cè)定方法原理如下-
麥牙糖+磷酸根麥芽糖磷酸化酶葡萄糖+葡萄糖1-磷酸 葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶腺苷二磷酸+葡萄糖6磷酸 葡萄糖-6-磷酸+輔酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡糖酸內(nèi)酯磷酸+還原型輔酶
這種方法應(yīng)用麥芽糖磷酸化酶(Disaccharidephosphorylases; EC 2.4.1.8) 酶(偶)聯(lián)己糖激酶(hexokinase; EC2.7丄1; EC 2.7.1.2)、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶(D-glucose-6曙phosphate dehydrogenase; EC 1.1.1.49)酶《足反應(yīng)速率比 色法/終點(diǎn)法。麥芽糖磷酸化酶酶解麥芽糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，再通過(guò)(偶) 聯(lián)合己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi) 有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定 還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光 度上升的程度/速度，可以測(cè)算麥芽糖的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明麥芽糖測(cè)定試劑盒較 為理想
磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑
腺苷三磷酸 麥芽糖磷酸化f
100 mmol/L500 mmol/L
3 mmol/L
20 mmol/L
10000U/L
己糖激酶 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
本發(fā)明的麥芽糖測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖 -6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸。 試劑2
磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
輔酶、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷 酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸。
試劑2
磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。 試劑3
磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶。
輔酶、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷 酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定麥芽糖濃度的方法，其輔酶可 以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的麥芽糖測(cè)定試劑為單試劑，包括:
磷酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
腺苷三磷酸 20 mmol/L
麥芽糖磷酸化酶 10000 U/L '
己糖激酶 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)麥芽糖樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0 分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出麥芽糖的濃 度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的麥芽糖測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑l
磷酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
腺苷三磷酸 20 mmol/L 試劑2
磷酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
麥芽糖磷酸化酶 10000 U/L
己糖激酶 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光
度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)麥芽糖樣品與試
劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲
時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出麥芽糖的濃
度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的麥芽糖測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1
磷酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L腺苷三磷酸
20 mmol/L
試劑2
磷酸緩沖液
穩(wěn)定劑
己糖激酶
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶
畫mmol/L 500 mmol/L
12000U/L
12000 U/L
試劑
磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑
麥芽糖磷酸化酶
100mmol/L
500 mmol/L
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定麥芽糖濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)
間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)麥芽糖樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出麥芽糖的濃 度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同， 不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的麥芽糖的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下麥牙糖+磷酸根 麥芽糖磷酸化酶 葡萄糖+葡萄糖1-磷酸葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶 腺苷二磷酸+葡萄糖6磷酸葡萄糖-6-磷酸+輔酶 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 葡糖酸內(nèi)酯磷酸 +還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出麥芽糖的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種麥芽糖測(cè)定試劑盒，主要成分包括: 磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑腺苷三磷酸麥芽糖磷酸化酶己糖激酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。反應(yīng)中，磷酸緩沖液提供磷酸 根底物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測(cè)定試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸組成單劑試劑。-80000 U/L
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測(cè)定試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸組成雙劑試劑；試劑l，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定 齊廿、輔酶、腺苷三磷酸組成；試劑2，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖 磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成。輔酶、麥芽糖磷酸 化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測(cè)定試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸組成多劑試劑；試劑l，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定 齊廿、輔酶、腺苷三磷酸組成；試劑2，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激 酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽 糖磷酸化酶組成。輔酶、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸 脫氫酶、腺苷三磷酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的麥芽糖測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定麥芽糖濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括磷酸緩沖液、輔酶、腺苷三磷酸、麥芽糖磷酸化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出麥芽糖的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101329258SQ20071002471
公開(kāi)日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司