專利名稱：多態(tài)性檢測方法
多態(tài)性檢測方法本發(fā)明涉及一種用于一全測特定核酸序列的方法，該方法尤其適用于 鑒定含有多態(tài)性或突變的序列，此外，本發(fā)明還涉及實施此類分析的試劑盒。越來越多的不同方法能用于檢測特定的核酸序列，尤其是用于測定 核酸的精確序列。在這些方法中，很多是基于核酸擴增反應，比如多聚酶鏈反應(PCR)和連接酶鏈反應(LCR)。這些方法用于種類繁多的方法中以檢測或診斷例如由于諸如細菌 和病毒等病原導致的疾病。這些方法還尤其適用于存在多態(tài)性的遺傳分析或診斷，所以多態(tài)性尤其是能夠導致疾病狀態(tài)、或者能導致特定疾病 狀態(tài)傾向(predisposition)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs )。隨著人類基因組測序的完成，以及日益增多的關于特定多態(tài)性和特 定疾病或特定疾病傾向之間關系的知識，正在進^亍的以i貪斷為目的的分 析數(shù)量也日益增加。連接酶鏈反應是一種特別有用的檢測多態(tài)性的方法。在該反應中， 將一對互補探針加入到待測試樣品中，該對探針在合適模板存在的情況 下能在模板上相互雜交。在此種雜交可發(fā)生的條件下，它們進行雜交， 然后在核苷酸存在的情況下，使用連接酶進行連接，該核苷酸通常為三 磷酸腺苷(ATP),但尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)也可以使用。在該過程中，發(fā)生了三步連接事件，例如在J.M. Pascal等的文章 [Nature, (2004)432, pp473-478]中有實例說明，在每一個連接事件中，有 一分子的單磷酸腺苷(AMP)作為副產(chǎn)物被釋放出來。被連接的探針和原始模板然后充當另 一輪雜交和連接的另外的模 板。這通過以下來實現(xiàn)，首先對混合物加熱，使核酸《連發(fā)生變性，例如， 加熱到8 0 - 9 0 。C的溫度，合適的溫度為8 5 。C左右；隨后，將混合 物冷卻到一定溫度，例如4 0 - 6 0 。C,典型的溫度為5 0 。C左右，此 時探針退火，連接發(fā)生。當隨后的循環(huán)進行時，只有樣品中包含合適模 板時才能得到擴增。通過使用4個探針，每一對探針對應于原始雙鏈模板分子的一條 鏈，可以導致指數(shù)擴增的發(fā)生。在這種情況下，在起始步驟要對雙鏈 DNA模板進行變性?？拷?，但相互之間并不直接毗鄰。在這種情況下，還需要在反應混合物 中加入使上游探針延伸通過探針之間小的缺口 (一般為2 - 3堿基對) 所必需的聚合酶、核苷酸和其它試劑，使得在連接之前上游探針(其隨 后作為聚合酶延伸反應的引物)能延伸通過該缺口。只有在上游探針的 3'端堿基和模板的相應堿基匹配的情況下，延伸反應才會發(fā)生。如果 不匹配，例如因多態(tài)性或類似原因所致，隨后的連接反應將不會發(fā)生。隨后，探針連接的產(chǎn)物可以通過根據(jù)大小分離產(chǎn)物，例如在電泳凝 膠上，并對凝膠染色以檢測它們來進行檢測。對應于已連接探針的條帶 要比單一的探針大，因此，出現(xiàn)這樣的條帶就表明連接反應已經(jīng)發(fā)生， 在樣品中有合適的模板存在。但是，該分離步驟和檢測步驟完成起來比較慢，而且復雜。只有在 試驗室條件下才能進行，對操作者的操作技能水平要求高，并且需要好 幾個單獨的反應階段。在某些情況下，在反應混合物中可能會加入同雙鏈DNA結合的熒改變。如^擴增反應已經(jīng)進行，就會通^t染料的萸光信^特性檢測出 來。但在這種情況下，需要使用熒光計才能檢測到信號，熒光計是一種 相對復雜的儀器。必須為樣品提供特定波長的萸光，然后對不同波長的 發(fā)射信號進行檢測。根據(jù)本發(fā)明，提供了 一種用于檢測樣品核酸序列中特定位置上是否 存在多態(tài)性的方法，該方法包4舌i) 在基本不含有ATP的反應混合物中，使一對探針與該核酸序列 退火，該對探針被設計為在退火時能相互鄰近，并且僅能對一種形式的 序列完全退火；ii) 在NAD和核酸連接酶存在時，將任何完全退火的成對探針連接 起來，該連接酶以NAD為底物；iii) 將連接事件中釋放的任何AMP磷酸化成ATP; iv )在得到的反應混合物中4全測ATP。步驟(i)可以釆用此類反應的常規(guī)方法進行。至此，如果探針的相 鄰末端同模板完全匹配，探針就會以直接相互毗鄰的方式結合在模板鏈 上，導致步驟(11)中連接反應的發(fā)生。或者，探針可以結合使得二者之間會有一小的缺口，前提是在該缺 口區(qū)域沒有腺。票呤堿基。在這種情況下，反應混合物中包含必需的聚合 酶、腺。票呤以外的核苷酸和任何其它試劑，從而只有在探針的3，端能 夠和模板的對應堿基完全匹配的情況下，使上游引物延伸填補此缺口 ， 并允許連接發(fā)生。如果該堿基不匹配，則探針不能延伸填補缺口，步驟(ii)的連接反應就不會發(fā)生。使用這種方法，只有樣品中包含有兩個探針都能完全結合的序列 時，步驟(11)的連接反應才會發(fā)生。在步驟(iv),通過片全測ATP,就可以測定是否有導致此種匹配的 核酸序列存在，該ATP來源于連接反應中所釋放的AMP。如果形成檢測靶標的核酸序列中發(fā)生突變或變化，尤其是在探針相 互毗鄰結合的位置出現(xiàn)這種情況時，其中 一個探針的末端不能和靶序列 結合，則步驟(ii)的連接事件就不會發(fā)生。結果就沒有AMP產(chǎn)生，而 步驟(iii)的磷酸化也不會產(chǎn)生任何ATP。在步驟(iv)的反應混合物 中缺乏ATP則表明，樣品中不包含靶核酸，因此可能存在不同的形式。能夠以NAD和ATP或者代替ATP作為底物的核酸連4妄酶是已知 的。這種連接酶的一個特殊例子是Eco/z'連纟妄酶。連接反應的副產(chǎn)物AMP可以在步驟(iii)中通過酶促反應直接磷 酸化成ATP，或者通過產(chǎn)生二磷酸腺苷(ADP)的途徑而磷酸化成ATP。用于將產(chǎn)生的AMP轉化成ATP(上述步驟(iii))的一種或多種酶可 以選自，例如磷酸烯醇式丙酮酸合酶，該酶在-岸酸和磷酸烯醇式丙酮酸 存在時能由AMP直接產(chǎn)生ATP,磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸也要作為試 劑被加入到反應混合物中。另一種選擇是，三磷酸核苷-腺苷酸激酶和 NTP的組合會產(chǎn)生二磷酸腺苷(ADP),后者在包含或加入像腺普酸激酶 的酶時會轉化為ATP。其它適合的酶的實例包括，比如Eisaki等在Biochem. et Biophys Acta 1431(1999) 363-373中描述的丙酮酸石粦酸二激酶。通過使用NAD替代常規(guī)用于LCR的ATP ,可以使用基于ATP檢 測的信號系統(tǒng)的可能性增加了 。關于該類型反應的系統(tǒng)已經(jīng)知道很多種。但是這些反應系統(tǒng)一般能 快速進行，可以《會出，例如清晰的可見的原位信號。因此，可以以均質
的方式對連接反應進行測定，而不需要對連接產(chǎn)物的大小進4于分析。尤其是可以使用生物發(fā)光系統(tǒng)對ATP進行檢測。使用此類檢測系統(tǒng) 的實例，例如在WO 96/02665中有描述。能和存在的ATP反應的特別合適的生物發(fā)光試劑包括熒光素和熒 光素酶，在需要的情況下還伴有鎂離子源，例如醋酸鎂。在ATP存在時， 這些試劑產(chǎn)生發(fā)光信號，其可以很容易地被監(jiān)測到，例如使用常規(guī)的發(fā) 光檢測儀設備。這些操作和應用起來一般要比熒光計更筒單。在產(chǎn)生信號的時候，這些試劑重新產(chǎn)生了 AMP分子，在存在步驟 (in)的酶和/或試劑時，AMP可以重新被轉化成ATP。因此信號就以 指數(shù)形式積累，可以很容易和快速地被檢測到。Sakakibara等在 Analytical Biochemistry, 268, 94-101 (1999)中描述了這種系統(tǒng)的一個實 例。這種信號的指數(shù)增長意味著可以直接進行檢測，而這種情況在以前 則可能需要擴增反應。生物發(fā)光信號系統(tǒng)(signalling system )比熒光系統(tǒng)更敏感。此外，通過使用簡單的光檢測器例如相機，可以簡單和容易地對該 反應進行檢測。因此避免了使用復雜設備，例如在廣泛應用的熒光信號 系統(tǒng)中用于檢測信號所必需的熒光計和類似設備。上面描述的方法可以合適地成為連接酶鏈反應(LCR)的一部分。這 種擴增反應可以以通常的方式進行，例如通過使用變性和退火/連接溫度 使反應混合物循環(huán)進行反應。如此以來，可以對上述步驟(i)和(ii) 進行有效重復，直至達到預期的擴增水平。適合地，該反應使用兩對探針進行， 一對探針對應于雙鏈模板核酸 序列中的一條鏈，使得擴增以指數(shù)方式進行。在這種情況下，在步驟(i) 之前要對雙鏈模板核酸序列進行變性。在這種情況下，至少上述的步驟(iv),合適的情況下包括步驟(iii) 和(iv)可能需要在反應結束時進行。這就提供了一種較好的終點檢測 方法。必要時，磷酸化試劑和生物發(fā)光試劑可以存在于或被加入到擴增反 應中，從而可以監(jiān)測反應的進程。 一般來說， 一些試劑例如萸光素酶的 熱穩(wěn)定性不足以支撐其存在于包含顯著熱循環(huán)的整個擴增過程中，因此 適合于在每個循環(huán)的末尾加入，而在下個循環(huán)開始之前進4于測定。但 是，選4奪使用熱穩(wěn)定熒光素酶，例如在EP-A-524448、 W095/25798、W099/14336、 WO00/24878、 WO01/31028和WO2003/0068801中所描述 的實例，可以更便利地監(jiān)測LCR中連續(xù)進行的步驟(iv)的某些反應。 特別地，就為了達到預期效果所要求的熱循環(huán)溫度范圍而言，如果 LCR中使用的反應條件或試劑能減小或最小化熱循環(huán)程度的話，這將會 更便利。例如，加入像Betam (N,N,N-三甲基甘氨酸)等試劑或增加像二曱基 亞砜(DMSO)或二曱基甲酰胺(DMF)等溶劑的體積可能會降低所需的 變性溫度。加入能使雙鏈體不穩(wěn)定的酶，例如拓樸異構酶或DNA旋轉酶，也 可以有效降低變性溫度，達到熒光素酶可以耐受的溫度。如果溫度降低 到去穩(wěn)定性酶能完全發(fā)揮活性時，這些酶的加入量應足以確保反應的平 衡進行，使得退火和連接都能進行。在另一種替代方式中，可以在基本等溫的情況下進行變性，例如對 反應混合物施加電化學電位，從而導致變性步驟的發(fā)生。此外， 一種熒光素再循環(huán)蛋白可以從氧化熒光素再生出焚光素，例 如在美國專利No. 5814504和WO 03/042693中所描述的蛋白，可以添 加到反應混合物中，以避免需要連續(xù)向反應混合物中加入熒光素。通過使用所屬領域已知的算法等，這些信息可以被用于對樣品中靶 核酸序列的定量。上述反應可以在很多種類的常規(guī)設備上進行。這些設備包括，例如 Pyrosequencer測序4義(可以/人5島士 Pyrosequencing AB公司獲《尋)，{亥 儀器已經(jīng)配備了合適的信號檢測手段。或者，反應也可在例如EP-A-0810030中所描述由Perkm-Elmer公司提供的千式加熱裝置、高速空氣 浴熱循環(huán)儀如 Idaho Technologys 司的 RapidCyclerTM和 LightCyclerTM、以及其它類型的如W098/24548中所描述的熱循環(huán)^義中 進行。為了確保在檢測前樣品中沒有或至少只有非常低水平的ATP存 在，優(yōu)選進行預處理步驟以去除ATP。例如，如果使用腺苷三磷酸雙磷 酸酶處理包含有核酸的樣品以去除ATP,可以進4亍該才喿作，雖然如此才喿 作會導致產(chǎn)生一些AMP,因此優(yōu)選使用脫氨基酶破壞腺嘌呤殘基。無論 如何，在珠子洗滌步驟，應確保核酸和腺苷酸有效分離，因為DNA對 其的結合增強，因此該過程可以在沒有該步驟的情況下進行。
該方法可以用于LCR目前適用的任何用途中，包括序列檢測如微生物、病毒或其它病原，以及用于疾病診斷。因此合適的情況是，樣品 為基因樣品。在另一方面，本發(fā)明提供了實施上述方法的試劑盒，該試劑盒包括以NAD為底物的核酸連接酶、磷酸化試劑、和一種或多種能產(chǎn)生生物 發(fā)光信號的試劑。合適的磷酸化試劑包括，例如上文所述的酶，其中包括磷酸烯醇式 丙酮酸合酶、磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的組合；三磷酸核苦-腺苷酸激 酶、NTP和腺苦酸激酶的組合；或者丙酮酸"奔酸二激酶。能夠產(chǎn)生生物發(fā)光反應系統(tǒng)的合適試劑包括熒光素酶和/或熒光 素。任選地，該試劑盒也可能包括鎂鹽，用于激活熒光素酶/熒光素系統(tǒng)， 4旦也可以用于LCR。該試劑盒可能還包括一對探針，該探針適合與靶核酸退火，優(yōu)選兩 對才笨針，每一對可以同目標雙《il核酸相對鏈中的對應區(qū)域退火。該試劑盒可能還包括其他適合完成LCR的試劑，例如NAD、緩沖 液(例如250mM EPPS[N畫2 -羥乙基)哌,畫N-(3-丙石黃酸)或鉀鹽。此外，該試劑盒也可能包括腺普三磷酸雙磷酸酶，或者更合適地， 包括脫氨基酶，用于完成上述的預處理步驟?，F(xiàn)在通過所附示意圖以實例的方式對本發(fā)明進行具體描述，該示意 圖對本發(fā)明的方法進行了圖解說明。在該反應圖解中，步驟1到3代表LCR反應中的一個常規(guī)循環(huán)，唯 一例外的是使用NAD作為連接酶的底物(NH2-Lys-Lig )。在第一階段， NAD同酶結合，并同AMP (在該階段不被磷酸化)分離。焦磷酸(Ppi) 在此過程中被釋放。在存在模板DNA(l)、能同模板雜交的上游探針 (2 )和下游探針(3 )情況下，該酶將AMP轉移到下游探針(3 )的5， 端，后者然后同上游探針(2) 3'末端的游離羥基基團連接，形成連接 物(4 ),并釋放游離的AMP (步驟3 )。在該階段存在或加入磷酸化酶將導致游離AMP向ATP轉化，后者 隨后可以被步驟4中所描述的常規(guī)熒光素酶/熒光素生物發(fā)光反應檢測 到。該反應體系因此提供了 一種可靠且容易操作的分析方法，尤其適用 于沖全測多態(tài)性，例如SNPs,在實施例1中有具體描述。實施例1 A.樣品制備該步驟可以在4義器中進行，例如在Thermo Labsystems KingFisher machine上進行。將血樣(200jul)加入300jul 3.8M鹽酸胍中。在室溫下混合1分 鐘，使細胞材料裂解，釋放出DNA。加入Promega MagneSil KF順磁顆 粒(20yl)(這些可以存儲到包含第一洗滌液的小孔中(見下文)，然 后從那個小孔中轉移)，混合2分鐘。抽提出的DNA同硅膠顆粒結合。 使用磁力將結合有DNA的顆粒轉移到第一個洗滌孔中，其中含有乙醇 和pH7.4TE緩沖液(TE緩沖液為10mM Tris.HCl和lmMEDTA)各500/0 的混合物。將珠子辨。汰，同第一洗滌液混合l分鐘。使用相同的洗滌液 再洗滌兩次。在第三次洗滌后，將珠子轉移到pH8.3的TE緩沖液中， 在〉50。C的溫度下混合12小時，此時DNA已孚皮從^圭基質上洗脫下來。 然后去除珠子，在其中一個洗滌孔中進行處理，制備的DNA用于下一 步驟。連接酶鏈反應(LCR)這一步驟可以在干熱循環(huán)儀(block thermal cycler)中進行，例如 Perkm Elmer 9600.將DNA同等體積的LCR Assay Mix混合，加入pH7.6的20mM Tris.HCl緩沖液使終體積為50 ju 1,該緩沖液包含100 mM KC1, 100 mM MgCl2， ImMEDTA, 10 mM 二石克蘇糖醇，10mMNAD+, 4 ju g/ml鮭魚 精子DNA， 15單位J1, "，""cm連接酶和濃度分別為5 |u M的兩種診斷 用寡核苷酸。反應在下面溫度條件下進行94。C一分鐘，65。C四分鐘， 重復40個循環(huán)。對從NAD形成的AMP進行生物發(fā)光檢測，以顯示是 否有LCR發(fā)生。所設計的診斷用寡核苷酸的熔解溫度比65。C高約2°C。生物發(fā)光一全測在室溫下，該測定在96孔微滴定板上進行，反應體積為lOOjul, <吏用來自 Thermo Labsystems的Labsystems Luminoskan Ascent plate luminometer。加入的生物發(fā)光才企測混合物中包括在90mM Tns.HCl， 10 mM
MgCl2， lmM EDTA, 10 mM 二A乾蘇糖醇中的20單位/ml腺苦酸激酶， 5mM乙酰磷酸，2單位/ml乙酸激酶，300 ng/ml焚火蟲熒光素酶和lmM D-熒光素，最終pH值為7.9。在診斷用寡核苷酸同目標DNA的互補堿 基發(fā)生末端匹配時，發(fā)射光就強，例如提示單核苷酸多態(tài)性(SNP)陽 性檢測結果的地方。
權利要求
1.一種用于檢測樣品中靶核酸序列內特定位置上是否存在多態(tài)性的方法，該方法包括i)在基本不含有ATP的反應混合物中，使一對探針與該核酸序列退火，該探針被設計為在退火時相互鄰近，并且僅與一種形式的序列完全退火；ii)在NAD和核酸連接酶存在時，將任何完全退火的成對探針連接起來，該核酸連接酶以NAD為底物；iii)將連接事件中釋放的任何AMP磷酸化成ATP；和iv)在得到的反應混合物中檢測ATP。
2. 根據(jù)權利要求l所述的方法，其中ATP的檢測使用生物發(fā)光系統(tǒng)。
3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其中生物發(fā)光系統(tǒng)是熒光素酶/ 熒光素系統(tǒng)。
4. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中作為預處理步驟， 含有該核酸序列的樣品被處理，以去除其中的ATP。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其中的樣品為基因樣品。
6. 根據(jù)前述任何權利要求中任一項所述的方法，其中的核酸連接 酶為熱穩(wěn)定連接酶，該方法構成連接酶鏈反應的 一部分。
7. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中使用兩對探針， 每一對對應于雙鏈輩巴核酸的一條《連。
8. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中成對的探針在靶 核酸《連上退火時直4妾相互毗鄰。
9. 根據(jù)權利要求1-7中任一項所述的方法，其中的成對探針發(fā)生結 合，使得存在小的缺口，在缺口之間不含有任何腺嘌呤堿基，反應混合 物中還包含聚合酶和核苷酸，該聚合酶和核苷酸適合于使上游探針延伸 通過該缺口前提是上游探針的3，端同靶核酸上對應的堿基匹配。
10. 用于完成前面權利要求中任一項所述方法的試劑盒，該試劑盒 包含使用NAD作底物的核酸連接酶、磷酸化試劑、和一種或多種能夠 產(chǎn)生生物發(fā)光信號的試劑。
11. 根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其中磷酸化試劑為磷酸烯醇 式丙酮酸合酶、磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的組合；三磷酸核苷-腺普酸激酶、NTP和腺苷酸激酶的組合；或者丙酮酸-岸酸二激酶。
12. 根據(jù)權利要求10或11所述的試劑盒，其中該一種或多種能 夠產(chǎn)生生物發(fā)光信號的試劑包括熒光素酶和/或熒光素。
13. 根據(jù)權利要求10至12中任一項所述的試劑盒，其中還包括適 合于和靶核酸退火的探針對。
14. 根據(jù)權利要求13所述的試劑盒，其中包含兩對探針，每一對 能和雙4連革巴核酸相對《連上的對應區(qū)域退火。
15. 根據(jù)權利要求10至14中任一項所述的試劑盒，其中還包含鎂撲jhl 。
16. 根據(jù)權利要求10至15中任一項所述的試劑盒，其中還包含 NAD、緩沖液或鉀鹽中的一種或多種。
17. 根據(jù)權利要求10至16中任一項所述的試劑盒，其中還包含脫 氨基酶。
全文摘要
一種用于檢測樣品中核酸序列內某一特定位置是否存在多態(tài)性的方法，該方法包括i)在基本不含有ATP的反應混合物中，使一對探針與該核酸序列退火，該對探針被設計為在退火時相互鄰近，并且僅同一種形式的序列完全退火；ii)在NAD和核酸連接酶存在時，將任何完全退火的成對探針連接起來，該連接酶以NAD為底物；iii)將連接事件中釋放的任何AMP磷酸化成ATP；iv)在得到的反應混合物中檢測ATP，特別是使用生物發(fā)光反應。對實施該方法的試劑盒也進行了描述，并提出了權利要求。
文檔編號C12Q1/68GK101163801SQ200680013089
公開日2008年4月16日 申請日期2006年3月22日 優(yōu)先權日2005年3月22日
發(fā)明者D·J·斯奎雷爾 申請人:恩尼格馬診斷有限公司