引物組及其應(yīng)用、利用該引物組進行棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子標記技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及引物組及其應(yīng)用、利用該引物組進行棉 花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平 遺傳多態(tài)性的直接的反映，能穩(wěn)定遺傳，可反映生物的個體和群體特征。與其它幾種遺傳標 記一一形態(tài)學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優(yōu)點是:大多數(shù)分 子標記為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利;基因組變異極其豐富，分子標記的數(shù)量幾乎 是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析;分子標記揭示來自 DNA的變異;表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖;檢測手段簡單、迅速。 分子標記是檢測種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效工具，分子標記技術(shù)不僅能夠檢測物種內(nèi)的遺 傳多樣性，而且可以對物種間的遺傳多樣性進行比較。因此利用分子標記進行檢測，選育出 具有外源目標性狀基因、盡可能不帶或少帶不利基因、且遺傳達到平衡的新種質(zhì)，對現(xiàn)代作 物改良將是十分重要的。
[0003] SSR(Simple sequence repeat，簡稱SSR)也叫微衛(wèi)星DNA，是建立在PCR基礎(chǔ)上的 第二代分子標記。SSR標記的多態(tài)性主要依賴于基本單元重復(fù)次數(shù)的變異，而這種變異在生 物群體中是大量存在的。與其它標記相比，SSR標記數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài) 性高;具有復(fù)等位基因的特性，提供的信息量大，操作簡便，重復(fù)性好，因此已廣泛應(yīng)用于、 基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。SSR在棉花基因 組中的分布是十分廣泛的。SSR分子標記技術(shù)在棉花種質(zhì)資源的鑒定上具有非常廣闊的應(yīng) 用前景。
[0004] 種質(zhì)資源（germplasm)，亦稱遺傳資源（genetic resources)或基因資源（gene resources)，它是指一切具有一定種質(zhì)或基因的生物類型的總稱，棉花種質(zhì)資源所有的遺 傳物質(zhì)均存在于各個品種之中，所以我國習慣稱棉花種質(zhì)資源。我國國家棉花中期庫目前 已搜集整理棉花種質(zhì)資源8000多份，其中陸地棉有7000多份，這些寶貴的資源材料都保存 在本所的國家中期庫里。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種引物組及其應(yīng)用、利用該引物組進行棉花種質(zhì)資源遺 傳多樣性分析的方法。本發(fā)明利用419份有代表性的陸地棉種質(zhì)資源材料，獲得了 186對條 帶清晰，多態(tài)性高，擴增效果好的SSR引物，旨在為棉花種質(zhì)資源鑒定，遺傳多樣性分析，品 種指紋圖譜的構(gòu)建等提供核心引物。
[0006] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了用于陸地棉種質(zhì)資源鑒定的引物組；
[0008] 所述引物組由上游引物和下游引物組成，如表1所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了所述引物組在棉花種質(zhì)資源鑒定中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述引物組在棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法，包括如下步驟：
[0012]步驟1:提取獲得樣品的總DNA;
[0013] 步驟2:以步驟1獲得的總DNA為模板，以如權(quán)利要求1所述的引物組進行擴增，電泳 檢測，顯色，進行多態(tài)性統(tǒng)計分析。
[0014] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法中所述多 態(tài)性統(tǒng)計分析為按〇，1進行統(tǒng)計，用Jaccard系數(shù)計算成對品種間遺傳相似性，在遺傳相似 系數(shù)基礎(chǔ)上利用非加權(quán)平均UPGMA法對所有供試材料建立樹狀圖，相似系數(shù)和聚類分析用 NTSYS 2.1軟件完成。
[0015] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法中步驟2 中所述擴增的 10yL反應(yīng)體系包括 10 X PCR(含20mM Mg2+) lyL，dNTP( 10mM)0.2yL，Taq酶 (2.5U/yL)0.2yL，去離子無菌水6. lyL，上游引物(5μΜ)0.75yL，下游引物(5μΜ)0.75yL，模板 DNA(50ngAiL)lyL。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法中步驟2 中所述擴增的反應(yīng)程序為95°C變性2min;94°C變性40s，57°C退火45s，72°C延伸60s，共30個 循環(huán);72°C延伸7min。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法中步驟1 中所述提取為:取棉花葉片針葉一片，放入2mL離心管中，同時裝入一粒鋼珠，放在液氮里冷 凍0.5h;取出離心管放入研磨儀中研磨2次，每次30S;研磨后取出鋼珠，加700ul60 °C水浴預(yù) 熱的提取液;60 °C水浴40-60min，每lOmin搖動離心管;取出離心管，加入等體積的氯仿-異 戊醇混合物，氯仿與異戊醇的體積比為24:1，混合；12，000g，離心10min;取上清，置于2ml離 心管，加等體積的氯仿-異戊醇混合物，氯仿與異戊醇的體積比為24:1;混合;12，000g，離心 lOmin;取上清，置于2ml離心管，加0.6倍體積的異丙醇;緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀， 靜置lOmin;倒去上清或鉤出DNA到1.5ml的離心管中，用70%乙醇洗2~3次，無水乙醇洗一 次，真空干燥;加500uL TE溶解DNA，保存于-20°C冰箱備用。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法中步驟2 中電泳檢測為:8%的聚丙烯酰胺凝膠。具體順序為:配制凝膠，丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺 (Acr:Bis30)6.7ml，5XTBE 5ml，去離子水（(1!120)13.251111，10%厶？（10%過硫酸銨35(^1，四 甲基乙二胺(TEMED)llyl。安裝好電泳槽玻璃，灌膠，待膠凝固后，拔下梳子，灌膠，電泳1個 小時。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的方法中步驟2 的染色為放在乙酸和無水乙醇及純水配制的固定液里固定7~8min，然后用硝酸銀滲透液 滲透lOmin;純水水洗兩次后放在含有氫氧化鈉、甲醛的顯色液里顯色，直到膠出現(xiàn)棕色帶 為止，最后放在含有無水碳酸鈉溶液中終止。把染好的膠放在觀片燈上照相，按有帶記為1， 無帶記為0進行統(tǒng)計。
[0020] 本發(fā)明公開了186對棉花核心SSR引物，平均分配在24條染色體上，這些引物多態(tài) 性好，條帶清晰，可以直接用于棉花品種資源的鑒定，遺傳多樣性分析，雜交品種的純度鑒 定，遺傳圖譜的構(gòu)建等。省去了通常的實驗過程中SSR引物的篩選過程，提高了實驗效率。
[0021] 本發(fā)明利用186對SSR核心引物鑒定陸地棉種質(zhì)資源的方法，實驗操作簡單，結(jié)果 好，能有效地區(qū)別不同來源背景的種質(zhì)資源材料，是一種值得推崇的種質(zhì)資源鑒定的方法。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0023] 圖1示24個代表材料對引物NAU3899(靠近M)和NAU4064(遠離M)的篩選結(jié)果;其中， 泳道Μ示Marker，泳道1~24分別是材料:冀棉8號，寶山大桃，中棉所12號，無極一枝花，南丹 巴地大花，中棉所16號，秦荔514,蘇遠04-3,軍棉1號，魯原343,中棉所17號，宿棉9108,乍得 3號，非洲棉E-40,澳SiV2,稀絮H10,中棉所81，遼陽多毛棉，岱字棉15號，Ari3697，TM-l，渝 棉1 號，J02-247,中078;
[0024] 圖2示引物NAU1042對419個材料中的1~96號（材料名稱見表3)的擴增圖；從左至 右依次為泳道M、泳道1~96;其中，泳道Μ示Marker，大小依次為:50bp，100bp，150bp，200bp， 250bp，300bp，350bp400bp，500bp;泳道 1 ~96 分別示 1 ~96 號材料；
[0025] 圖3示引物NAU1042對419個材料中的97~192號（材料名稱見表3)的擴增圖；從左 至右依次