專利名稱：一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的培養(yǎng)基，還涉及一種生產(chǎn)塊菌多糖的液體深層發(fā)酵的方法，該培養(yǎng)基適用于塊菌的液體深層發(fā)酵以及工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖。
背景技術(shù)：
塊菌是世界上最珍貴的藥食兩用真菌之一，其子囊果呈球形、半球形或塊狀，直徑一般在1.5-12厘米，成熟后為褐色、紅褐色至深褐色，基部常凹陷，表面布以大小不一的小疣。塊菌的產(chǎn)地狹窄，主要分布于歐洲大陸的北溫帶和寒帶地區(qū)，其產(chǎn)量在市場(chǎng)上一直供不應(yīng)求，價(jià)值顯赫。
塊菌(Truffle)是地下生菌物中一個(gè)比較重要的子囊菌類群，子實(shí)體在土壤中生長(zhǎng)，除個(gè)別種類在成熟時(shí)半露出土表外，大部分種類自始至終埋生于地下，是與樹(shù)木共生的外生菌根型藥食兩用真菌。
塊菌在生物分類學(xué)上屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、塊菌目(Tuberales)、塊菌科(Tuberaceae)、塊菌屬(Tuber)，常見(jiàn)的塊菌有黑孢塊菌(Tuber melanosporum Vittad)、印度塊菌(Tuber indicum Cooke)、中國(guó)塊菌(Tuber sinense Tao et Liu)等。我國(guó)云南產(chǎn)的印度塊菌和和四川產(chǎn)的中國(guó)塊菌在外形上與黑孢塊菌相似，其品質(zhì)亦可與歐洲產(chǎn)的黑孢塊菌相媲美，目前國(guó)際市場(chǎng)上每公斤新鮮黑孢塊菌的價(jià)格高達(dá)1000多美元，其昂貴的價(jià)格和黑色、疣狀的外形被賦予森林中“黑鉆石”的美譽(yù)。
有關(guān)塊菌多糖的研究開(kāi)始于上個(gè)世紀(jì)九十年代，當(dāng)時(shí)的研究側(cè)重于如何從塊菌的子實(shí)體中提取塊菌多糖及其生物活性，如文獻(xiàn)胡慧娟，李佩珍，林濤，杭秉茜，郭躍偉。塊菌多糖對(duì)小鼠腫瘤及免疫系統(tǒng)的影響。中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1994；25(5)289-292首次報(bào)道了從中國(guó)塊菌的子實(shí)體中提取出一種新的蛋白結(jié)合多糖——塊菌多糖，連續(xù)通過(guò)10天給藥接種有S-180肉瘤、EAC肉瘤液的小鼠，發(fā)現(xiàn)25毫克/千克、50毫克/千克的塊菌多糖能明顯的抑制小鼠S-180肉瘤及EAC肉瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)通過(guò)連續(xù)給藥發(fā)現(xiàn)塊菌多糖對(duì)小鼠脾臟的重量、外周血中的白細(xì)胞數(shù)及T淋巴細(xì)胞百分率具有明顯的增加作用；能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高小鼠血清中IgG水平等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，塊菌多糖作為一個(gè)新的真菌多糖，毒性低、水溶性好、抑制腫瘤作用明顯，可望開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤免疫療法的藥物。
塊菌作為一種藥食兩用真菌具有可培養(yǎng)性，能夠通過(guò)廉價(jià)的培養(yǎng)基快速簡(jiǎn)單地獲得大量的塊菌菌絲體及其發(fā)酵代謝產(chǎn)物，同時(shí)可以通過(guò)代謝工程的原理有針對(duì)性地設(shè)計(jì)合適的培養(yǎng)基組分，誘導(dǎo)塊菌多糖高效積累，使發(fā)酵過(guò)程朝著有利于塊菌多糖生產(chǎn)的方向進(jìn)行，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程容易放大到工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模。但目前的發(fā)酵研究主要側(cè)重于如何獲得塊菌的菌絲體，如文獻(xiàn)陳惠群，劉洪玉，李子平。中國(guó)塊菌主要生理特性初步研究。食用菌學(xué)報(bào)，1998，5(4)26-30報(bào)道了將中國(guó)塊菌(Tuber sinense Tao et Liu)在鮮松針培養(yǎng)基(洋芋20％、鮮松針3％、葡萄糖1％、麥芽糖1％、蛋白胨0.5％、硫酸鎂0.05％、瓊脂2％)上進(jìn)行純培養(yǎng)，通過(guò)比較菌絲的生長(zhǎng)量和菌落直徑大小分別考察了溫度、碳源、氮源、pH對(duì)中國(guó)塊菌菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)論表明中國(guó)塊菌的最適宜生長(zhǎng)溫度為23-25℃、最適pH為5-6，菌絲生長(zhǎng)最好的碳源為麥芽糖、蔗糖、果糖，菌絲生長(zhǎng)最好的氮源為蛋白胨和硫酸銨。
塊菌多糖可以直接從塊菌子實(shí)體中提取，亦可以通過(guò)塊菌液體深層發(fā)酵的方法獲得，但前者不適應(yīng)于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，原因主要在于1.塊菌作為一種生長(zhǎng)于地下的藥食兩用真菌，在自然界中要求生長(zhǎng)于堿性土壤、氣候溫和的環(huán)境，同時(shí)與橡樹(shù)、櫟樹(shù)等樹(shù)種的根系共生，苛刻的生長(zhǎng)條件直接導(dǎo)致了其天然產(chǎn)量的供不應(yīng)求。
2.為彌補(bǔ)塊菌天然產(chǎn)量的不足曾有不少學(xué)者進(jìn)行了半人工模擬栽培的研究，但從接種到收獲一般需要7-9年時(shí)間，周期較長(zhǎng)，需要耗費(fèi)大量的人力和物力。
3.由于塊菌生長(zhǎng)于地下，人工發(fā)現(xiàn)的難度較大，采集過(guò)程中易受到損傷，同時(shí)塊菌生長(zhǎng)于自然界受環(huán)境變化的影響較大，品質(zhì)較難保證。
4.目前歐美市場(chǎng)上每千克新鮮的黑孢塊菌的價(jià)格高達(dá)1000美元，云南產(chǎn)的中國(guó)塊菌的市場(chǎng)價(jià)亦高達(dá)400元/公斤。因此若直接以塊菌子實(shí)體作為塊菌多糖的生產(chǎn)原料則無(wú)法回避原料價(jià)格昂貴、產(chǎn)量有限等問(wèn)題。
目前的文獻(xiàn)報(bào)道僅是針對(duì)中國(guó)塊菌的生理特性研究進(jìn)行了純培養(yǎng)和在黑孢塊菌的半人工模擬栽培過(guò)程中對(duì)塊菌的菌絲體生長(zhǎng)進(jìn)行了初步研究，涉及到通過(guò)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的塊菌純培養(yǎng)的研究尚未見(jiàn)到有關(guān)報(bào)道，相關(guān)的培養(yǎng)基配方研究在本發(fā)明中屬于第一次報(bào)道?？傊环N既適合塊菌生長(zhǎng)又適合塊菌胞外多糖生產(chǎn)的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)整個(gè)塊菌多糖生產(chǎn)的工藝和成本而言至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方合理，成本低廉，制作簡(jiǎn)便；中國(guó)塊菌在該液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速、塊菌胞外多糖產(chǎn)量高；利用塊菌在該培養(yǎng)基中深層發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)塊菌多糖能夠解決塊菌子實(shí)體產(chǎn)量不足等問(wèn)題。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的制備方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，適合塊菌多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案以中國(guó)塊菌(Tuber sinense Tao et Liu)為出發(fā)菌株，有關(guān)該菌株的內(nèi)容詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)(陳惠群 劉洪玉.中國(guó)塊菌主要生理特性初步研究，食用菌學(xué)報(bào)，1998，5(4)26-30)。采用斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)、和液體深層發(fā)酵的生產(chǎn)流程來(lái)生產(chǎn)塊菌胞外多糖。在液體深層發(fā)酵階段，通過(guò)考察不同的碳源、氮源和起始pH值對(duì)塊菌胞外多糖產(chǎn)量的影響來(lái)優(yōu)化最佳的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體步驟如下一、斜面菌種培養(yǎng)本發(fā)明所采用的斜面培養(yǎng)基為麥芽糖30-150克/升、硫酸鎂1.0-10克/升、磷酸二氫鉀1.0-10克/升、瓊脂10-30克/升、馬鈴薯提取液1.0升、pH值5-8。滅菌條件為121℃、20分鐘。將中國(guó)塊菌接種于新鮮配置的斜面培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度15-40℃，培養(yǎng)時(shí)間2-20天。
二、液體種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基配方為麥芽糖30-150克/升、蛋白胨5.0-50克/升、硫酸鎂1.0-10克/升、磷酸二氫鉀1.0-10克/升、pH值5-8；培養(yǎng)溫度15-40℃，搖床轉(zhuǎn)速50-300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間2-20天。將步驟一中所培養(yǎng)的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有一級(jí)液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)，該培養(yǎng)液即為含有菌種的一級(jí)液體種子。將所培養(yǎng)的一級(jí)液體種子轉(zhuǎn)接入搖瓶中進(jìn)行二級(jí)液體種子培養(yǎng)，接種量按體積比計(jì)為10％，該培養(yǎng)液即為含有菌種的二級(jí)液體種子。
三、塊菌液體深層發(fā)酵及其培養(yǎng)基的優(yōu)化將步驟二中所培養(yǎng)的二級(jí)液體種子轉(zhuǎn)接搖瓶進(jìn)行液體深層發(fā)酵，接種量按體積比計(jì)為10％，發(fā)酵溫度15-40℃，搖床轉(zhuǎn)速50-300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間2-20天。所述的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽成分為硫酸鎂0.1-10克/升、磷酸二氫鉀0.1-10克/升；碳源為麥芽糖50克/升、乳糖30-150克/升、果糖80克/升、或半乳糖80克/升；氮源為尿素7克/升、酵母膏34克/升、牛肉浸膏34克/升、硫酸銨15.6克/升、氯化銨12.6克/升、硝酸鈉20克/升、硝酸鉀24克/升、硝酸銨9克/升；起始pH值為2-9。根據(jù)碳源、氮源、pH值的優(yōu)化結(jié)果，得到一種液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方乳糖30-150克/升、蛋白胨5-50克/升、硫酸鎂1.0-10克/升、磷酸二氫鉀1.0-10克/升、pH值為2-9。將該培養(yǎng)基組分用水溶解，然后調(diào)至指定的pH值，置于高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌20分鐘后即完成該液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的制備。
四、塊菌胞外多糖的測(cè)定將步驟三中所獲得的含有菌絲體的發(fā)酵液離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘、30分鐘)，取其上清液用于塊菌胞外多糖的測(cè)定。采用乙醇沉淀法來(lái)獲得液體深層發(fā)酵所獲得的塊菌胞外多糖，發(fā)酵上清液加入四倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后靜置過(guò)夜，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后取沉淀，用等量的80％乙醇清洗后在13000轉(zhuǎn)/分鐘下離心5分鐘就可以得到純度較高的胞外多糖，其濃度用濃硫酸-苯酚法來(lái)測(cè)定。詳細(xì)步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)，M.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric method for determination of sugars andrelated substances，Anal.Chem.1956，(28)350-356.
本發(fā)明的有益效果由于塊菌價(jià)格昂貴，目前塊菌多糖的工業(yè)化生產(chǎn)在市場(chǎng)上沒(méi)有，本發(fā)明避免了從塊菌子實(shí)體中提取多糖過(guò)程中原料有限和價(jià)格昂貴等不利因素，大大降低其生產(chǎn)成本，有望填補(bǔ)塊菌多糖工業(yè)化生產(chǎn)的空白。同時(shí)通過(guò)對(duì)碳源、氮源、起始pH的優(yōu)化，本發(fā)明所獲得的最佳液體深層培養(yǎng)基能大大提高塊菌多糖的產(chǎn)量，更適合塊菌多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用的菌種中國(guó)塊菌(Tuber sinense Taoet Liu)。
A、斜面菌種培養(yǎng)本實(shí)施例所采用的斜面菌種培養(yǎng)基配方為麥芽糖50克/升、硫酸鎂5克/升、磷酸二氫鉀5克/升、瓊脂15克/升、馬鈴薯提取液1.0升、pH值5或6或7或8。滅菌條件為121℃、20分鐘。培養(yǎng)溫度為15或17或19或24或27或29或34或36或40℃，培養(yǎng)時(shí)間為2或5或7或9或14或16或17或20天。
B、液體種子培養(yǎng)本實(shí)施例中一級(jí)液體種子、二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的配方均為麥芽糖70克/升，蛋白胨25克/升，硫酸鎂5克/升，磷酸二氫鉀6克/升，pH值5或6或7或8。將斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有一級(jí)液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中即可進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為15或17或19或24或27或29或34或36或40℃，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為2或5或7或9或14或16或17或20天，裝液量為每250毫升搖瓶裝50毫升液體；將培養(yǎng)好的一級(jí)液體種子轉(zhuǎn)接搖瓶進(jìn)行二級(jí)液體種子培養(yǎng)，二級(jí)液體種子的培養(yǎng)基配方和以上一級(jí)液體種子培養(yǎng)基的配方相同，培養(yǎng)溫度與A步相同，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為2或4或6或8或10天，接種量為5毫升，裝液量為每250毫升搖瓶裝50毫升液體。
C、塊菌液體深層發(fā)酵及其培養(yǎng)基優(yōu)化所采用的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥芽糖80克/升，蛋白胨30克/升，硫酸鎂5克/升，磷酸二氫鉀6克/升，pH為2或3或4或5或6或7或8或9。發(fā)酵條件為溫度，搖與A步相同，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間與A步相同。接種量為5毫升，裝液量為每250毫升搖瓶裝50毫升液體。
胞外多糖的測(cè)定主要參考文獻(xiàn)M.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances，Anal.Chem.1956，(28)350-356。具體實(shí)施步驟如下發(fā)酵完畢后將含有菌絲體的發(fā)酵液離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘、30分鐘)，將發(fā)酵液離心后獲得的上清液用于塊菌胞外多糖的測(cè)定，采用乙醇沉淀法測(cè)定液體深層發(fā)酵所獲得的塊菌胞外多糖，取200微升離心后的上清液加入800微升的無(wú)水乙醇，混勻后靜置過(guò)夜，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心4-6分鐘后取沉淀，用1毫升80％乙醇清洗后在13000轉(zhuǎn)/分鐘下離心4-6分鐘就可以得到純度較高的胞外多糖。濃度用濃硫酸-苯酚法來(lái)測(cè)定，向得到的胞外多糖中加入1摩爾/升的氫氧化鈉1毫升，60℃保溫1小時(shí)，冷卻后取500微升補(bǔ)水至1毫升；加入5％苯酚1毫升，混勻后加入濃硫酸5毫升，25℃保溫25分鐘后于488nm下比色。用分析純的葡萄糖以同樣的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過(guò)回歸方程計(jì)算出多糖的含量為1.60克/升。
實(shí)施例2-4液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源分別為80克/升乳糖、80克/升果糖、80克/升半乳糖，其它條件與實(shí)施例1相同。分析測(cè)試結(jié)果，塊菌胞外多糖的產(chǎn)量分別為1.83克/升、1.13克/升、1.17克/升。
實(shí)施例5-12液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為乳糖，濃度分別為30克/升、50克/升、60克/升、70克/升、90克/升、110克/升、130克/升、150克/升，其它條件與實(shí)施例1相同。分析測(cè)試結(jié)果，塊菌胞外多糖的產(chǎn)量分別為0.88克/升、1.15克/升、1.35克/升、2.18克/升、1.60克/升、1.35克/升、1.19克/升、0.91克/升。
實(shí)施例13-20液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源分別為尿素7克/升、酵母膏34克/升、牛肉浸膏34克/升、硫酸銨15.6克/升、氯化銨12.6克/升、硝酸鈉20克/升、硝酸鉀24克/升、硝酸銨9克/升，其它條件與實(shí)施例1相同。分析測(cè)試結(jié)果，塊菌胞外多糖的產(chǎn)量分別為1.53克/升、0.28克/升、1.07克/升、0.50克/升、0.25克/升、0.45克/升、0.62克/升、0.64克/升。
實(shí)施例21-27液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源為尿素，濃度分別為1克/升、3克/升、5克/升、8克/升、11克/升、15克/升、20克/升，其它條件與實(shí)施例1相同。分析測(cè)試結(jié)果，塊菌胞外多糖的產(chǎn)量分別為0.65克/升、1.10克/升、1.42克/升、1.85克/升、1.87克/升、1.44克/升、1.13克/升。
實(shí)施例28-35液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨濃度為5克/升、10克/升、15克/升、20克/升、25克/升、30克/升、35克/升、50克/升，其它條件與實(shí)施例1相同。分析測(cè)試結(jié)果，塊菌胞外多糖的產(chǎn)量分別為1.41克/升、1.60克/升、1.85克/升、2.04克/升、2.23克/升、1.60克/升、1.46克/升、1.15克/升。
實(shí)施例36-42液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中起始pH值分別為2、3、4、5、7、8、9，其它條件與實(shí)施例1相同。分析測(cè)試結(jié)果，塊菌胞外多糖的產(chǎn)量分別為0.35克/升、1.39克/升、0.93克/升、1.28克/升、1.55克/升、1.68克/升、1.01克/升。
實(shí)施例43-50液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸鎂濃度為0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它條件與實(shí)施例1相同。分析測(cè)試結(jié)果，塊菌胞外多糖的產(chǎn)量分別為0.22克/升、0.44克/升、1.10克/升、1.37克/升、1.60克/升、1.42克/升、1.13克/升、1.02克/升。
實(shí)施例51-58液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀濃度為0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、6克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它條件與實(shí)施例1相同。分析測(cè)試結(jié)果，塊菌胞外多糖的產(chǎn)量分別為1.32克/升、1.58克/升、1.76克/升、2.1 5克/升、2.30克/升、1.60克/升、1.54克/升、1.38克/升、1.01克/升。
權(quán)利要求
1.一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的制備方法，它包括下列步驟A、斜面菌種培養(yǎng)將中國(guó)塊菌菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，接種完后置于生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度15-40℃，培養(yǎng)時(shí)間2-20天，所述的斜面菌種培養(yǎng)基配方為麥芽糖30-150克/升，硫酸鎂1.0-10克/升，磷酸二氫鉀1.0-10克/升，瓊脂10-30克/升，馬鈴薯提取液1.0升，pH值為5-8；B、液體種子的培養(yǎng)將步驟A中培養(yǎng)的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有一級(jí)液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度15-40℃、搖床轉(zhuǎn)速50-300轉(zhuǎn)/分鐘、時(shí)間2-20天；該培養(yǎng)液即為含有菌種的一級(jí)液體種子，所述的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基配方為麥芽糖30-150克/升、蛋白胨5-50克/升、硫酸鎂1.0-10克/升、磷酸二氫鉀1.0-10克/升、pH值5-8，培養(yǎng)條件為溫度15-40℃、搖床轉(zhuǎn)速50-300轉(zhuǎn)/分鐘、培養(yǎng)時(shí)間2-10天；將培養(yǎng)好的一級(jí)液體種子轉(zhuǎn)接搖瓶進(jìn)行二級(jí)液體種子培養(yǎng)，二級(jí)液體種子培養(yǎng)基與一級(jí)液體種子培養(yǎng)基相同，接種量10％/體積比，所得到的培養(yǎng)液即為含有菌種的二級(jí)液體種子；C、塊菌液體深層發(fā)酵將步驟B中所培養(yǎng)的二級(jí)液體種子轉(zhuǎn)接搖瓶進(jìn)行液體深層發(fā)酵，發(fā)酵條件接種量10％/體積比、溫度15-40℃、搖床轉(zhuǎn)速50-300轉(zhuǎn)/分鐘、發(fā)酵時(shí)間2-20天，所述的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽成分為硫酸鎂0.1-10克/升、磷酸二氫鉀0.1-10克/升，碳源為麥芽糖、乳糖、果糖、或半乳糖；氮源為蛋白胨、尿素、酵母膏、牛肉浸膏、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸銨，起始pH值為2-9，根據(jù)碳源、氮源、起始pH值的選擇，將液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基用水溶解后調(diào)至指定的pH值，置于高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌20分鐘后即完成該液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的制備。
2.一種用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的塊菌液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基，其特征在于乳糖30-150克/升、蛋白胨5-50克/升、硫酸鎂0.1-10克/升、磷酸二氫鉀0.1-10克/升。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基由乳糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀按一定比例構(gòu)成，其塊菌多糖的制備步驟首先是斜面菌種培養(yǎng)，其次是液體種子培養(yǎng)，最后是液體深層發(fā)酵。本發(fā)明通過(guò)對(duì)中國(guó)塊菌的斜面菌種、一級(jí)液體種子和二級(jí)液體種子的培養(yǎng)來(lái)穩(wěn)定其生理狀況，在液體深層發(fā)酵階段著重考察了不同碳源、氮源及起始pH值對(duì)塊菌液體深層發(fā)酵過(guò)程中塊菌多糖產(chǎn)量的影響。在該培養(yǎng)基中塊菌生長(zhǎng)迅速，發(fā)酵周期短，多糖產(chǎn)量高，成本低，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)塊菌多糖。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1995322SQ20061016650
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日
發(fā)明者湯亞杰, 李冬生, 孔國(guó)平 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)