專利名稱：一株灰樹花菌株及利用該菌株進(jìn)行液體發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)漆酶和β-葡聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)漆酶和β-葡聚糖的菌株，特別涉及一種漆酶與灰樹花β-葡聚糖聯(lián)產(chǎn)的菌株和生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
灰樹花(Grifola frondosa)又名貝葉多孔菌，俗稱栗子蘑，在分類學(xué)上屬于擔(dān)子菌亞門、多孔菌科、多孔菌屬。長期以來人們對(duì)灰樹花進(jìn)行的大量研究主要集中在多糖方面，而對(duì)其產(chǎn)酶特性的研究極少。1883年，日本學(xué)者吉田首次從日本紫膠漆樹漆液中發(fā)現(xiàn)一種可催化漆固化過程的
蛋白質(zhì)。1894年，Bertrand將這種蛋白質(zhì)命名為漆酶(Laccase)。漆酶(Laccase)是一種含銅的多酚氧化酶，具有廣泛的作用底物，不僅能氧化多種芳香族化合物，還能降解木質(zhì)素、去除許多有毒酚類物質(zhì)的毒性，還可以使多種染料脫色及去除有機(jī)廢水的毒性。近年來在造紙、環(huán)保、食品等領(lǐng)域有了廣泛的應(yīng)用。我國最早研究漆酶的是劉國智、黃葆同等，他們于20世紀(jì)50年代末利用漆酶在催化反應(yīng)中需要消耗氧氣的特性，設(shè)計(jì)了漆酶酶活的測定方法。但直到20世紀(jì)80年代末，國內(nèi)對(duì)漆酶的研究一直停留在漆酶酶活的測定、漆酶表觀特性的描述性研究上。專利CN201010289892. 3公開了一種利用密孔菌屬菌株以豆柏(或硝酸鈉)為氮源、以麥芽糖(或葡萄糖、果糖、纖維二糖)等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法；專利CN200810198678. X公開了一種產(chǎn)漆酶的靈芝菌株，該靈芝菌是韋伯靈芝TZCl (Ganodermaweberianum TZC1),它在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 2648 ;趙玉良等報(bào)道了一種利用灰樹花發(fā)酵制備漆酶的方法，其所用菌株購自上海食用菌研究所，為灰樹花子實(shí)體栽培菌株，液體培養(yǎng)采用葡萄糖天冬酰胺培養(yǎng)基，260C下，搖瓶液體培養(yǎng)10天，發(fā)酵液中的酶活達(dá)到最高值，期間采用I. 5%濃度的木質(zhì)素進(jìn)行產(chǎn)酶誘導(dǎo)。所產(chǎn)漆酶采用30%的硫酸銨沉淀回收。上述漆酶制備方法中，僅僅是利用灰樹花菌株發(fā)酵制備漆酶，通過硫酸銨沉淀獲得粗酶，未涉及如何利用灰樹花發(fā)酵菌絲體，由于發(fā)酵的目標(biāo)產(chǎn)物和發(fā)酵時(shí)間不同，使得菌絲體內(nèi)的多糖構(gòu)成和多糖的含量均與現(xiàn)有的不同。以葡聚糖為目標(biāo)產(chǎn)品時(shí)，發(fā)酵周期僅為48-96h，而以漆酶為目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，發(fā)酵周期長達(dá)196-240h,此時(shí)菌絲體老化，或者易發(fā)生自溶而消亡，或者多糖開始變化，水溶多糖減少，有生物活性的β_葡聚糖大量損失。菌絲體一般被當(dāng)做廢棄物低價(jià)出售，不及時(shí)處理時(shí)，會(huì)因腐爛造成環(huán)境污染。另外，在漆酶的分離過程中，使用了高濃度的硫酸銨作為沉淀劑，分離漆酶之后的發(fā)酵液成為高濃度含鹽廢水，雖然含有大量的N元素，但由于含S元素過高，不能直接作為肥料使用，需耗費(fèi)大量資金進(jìn)行處理才能夠達(dá)標(biāo)排放。且以硫酸銨作為沉淀劑，實(shí)際上是實(shí)驗(yàn)室中作為分離蛋白質(zhì)的常用方法，不適于工業(yè)化應(yīng)用。因此該方法無法應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，缺乏使用價(jià)值。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)存在的不足，提供一株的灰樹花菌株，該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo. 1709，該菌株可以用于生產(chǎn)漆酶。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵菌絲體中含有大量β_葡聚糖，故該菌株可用于β_葡聚糖的生產(chǎn)。 此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過適當(dāng)調(diào)整后在灰樹花的發(fā)酵液中，含有大量漆酶活性的蛋白，因此可利用該菌株作為漆酶的產(chǎn)生菌。利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，發(fā)酵周期短，漆酶酶活水平高，且菌絲體中β -葡聚糖含量高，達(dá)到漆酶與灰樹花水溶性β -葡聚糖聯(lián)產(chǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明首先獲得了一株灰樹花菌株，該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 1709，發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)通過調(diào)整發(fā)酵工藝，該菌株既可產(chǎn)生漆酶，又可產(chǎn)生葡聚糖。
該菌株可以應(yīng)用于常規(guī)生產(chǎn)，特別是可以應(yīng)用于漆酶及灰樹花葡聚糖的生產(chǎn)，該生產(chǎn)過程主要包括灰樹花液體發(fā)酵、固液分離、漆酶分離提取、β -葡聚糖分離提取等步驟。在灰樹花的發(fā)酵過程中應(yīng)用了漆酶產(chǎn)生過程的誘導(dǎo)和積累過程的誘導(dǎo)工序。
所述的漆酶產(chǎn)生過程的誘導(dǎo)和積累過程的誘導(dǎo)工序具體步驟如下
Α.誘導(dǎo)因子篩選
從漆酶可以作用的底物、菌株發(fā)酵過程所需的生長因子、酶系的調(diào)控三個(gè)方面篩選誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)因子選自含特定金屬離子的鹽或灰樹花生長因子或漆酶底物；
B.誘導(dǎo)因子使用方法
含特定金屬離子的鹽、特定生長因子及漆酶底物添加入培養(yǎng)基中用于調(diào)控菌絲體細(xì)胞內(nèi)酶系；
C.發(fā)酵控制
首先用普通濃度的碳源使菌體生長，進(jìn)入生產(chǎn)期后再陸續(xù)補(bǔ)加碳源、氮源，并始終使碳源濃度維持在相對(duì)較低但較穩(wěn)定的濃度水平上，通過不斷補(bǔ)料把菌體維持在生長狀態(tài)，從而提聞漆酶的廣率。
其中所述誘導(dǎo)因子中的特定金屬離子選自含鈣離子或鎂離子或銅離子或鋅離子或鈷離子或錳離子中的一種或幾種鹽的混合物；生長因子選自B族維生素；底物選自愈創(chuàng)木酚、木素、木屑、小麥秸桿等中的一種或幾種混合物。
之所以選擇上述的物質(zhì)作為誘導(dǎo)因子，主要是由于漆酶是含銅離子的酶系，它的底物主要是愈創(chuàng)木酚、木素、木屑、小麥秸桿等富含木素等物質(zhì)，發(fā)明人經(jīng)過研究后發(fā)現(xiàn)針對(duì)本發(fā)明所述的菌株而言，要使其產(chǎn)生漆酶，誘導(dǎo)調(diào)控的方法主要通過三種方式1、添加底物，如愈創(chuàng)木酚、木素、木屑、小麥秸桿等富含木素等物質(zhì)；2、補(bǔ)充生物生長必須的營養(yǎng)因子，如B族維生素等；3、補(bǔ)充菌體中各種酶系的輔酶離子，主要選擇自特定金屬離子，一般可以采用其可溶性金屬鹽的形式，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過上述三種方式的誘導(dǎo)，結(jié)合對(duì)于發(fā)酵過程的碳源和氮源濃度調(diào)整及參數(shù)條件控制，可以實(shí)現(xiàn)膠漆酶產(chǎn)量的提高。在灰樹花產(chǎn)酶發(fā)酵的過程中，首先用正常濃度的碳源使菌體生長，進(jìn)入生產(chǎn)期后再陸續(xù)補(bǔ)加碳、氮源，并始終使碳源濃度維持在相對(duì)較低但較穩(wěn)定的濃度水平上，通過不斷補(bǔ)料把菌體維持在生長狀態(tài)，從而提聞漆酶的廣率。
整個(gè)生產(chǎn)工藝的具體生產(chǎn)步驟如下CN 102972213 A書明說3/9頁
(I)灰樹花液體發(fā)酵
A.斜面菌種活化；
B.液體搖瓶種子制備；
C.誘導(dǎo)產(chǎn)酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備；
D.發(fā)酵菌種活化后，經(jīng)液體發(fā)酵擴(kuò)繁種子菌懸液，再利用液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)得到發(fā)酵液；
發(fā)酵的具體過程為，將液體種子以2-10% (v/v)的接種量接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 初始還原糖濃度為18. 26mg/mL，26°C培養(yǎng)72h，流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w) 的氮源，控制發(fā)酵液還原糖在O. 5-2mg/mL水平,氨基氮在100_500mg/L之間，同時(shí)控制代謝過程的pH在5. 0-6. 5之間，共培養(yǎng)120-240h ;經(jīng)上述工藝發(fā)酵后，漆酶發(fā)酵水平達(dá)到500U/ HlL以上；
在上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備時(shí)，除培養(yǎng)基正常組成成分外，發(fā)明人還加入上述的產(chǎn)酶誘導(dǎo)因子，如一定量含特定金屬離子的鹽，可以是含鈣離子或鎂離子或銅離子或鋅離子或鈷離子或錳離子中的一種或幾種鹽的混合物；或者加入漆酶的底物，如愈創(chuàng)木酚、木素、木屑、小麥秸桿等中的一種或幾種混合物；或者在培養(yǎng)基滅菌后加入B族維生素的一種或幾種；上述誘導(dǎo)因子的加入，再加上流加碳源物質(zhì)和氮源物質(zhì)控制還原糖和氨基氮水平， 兩個(gè)作用積累，使漆酶發(fā)酵水平較現(xiàn)有技術(shù)提高了 5-10倍。
上述發(fā)酵過程中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入的產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑中，所篩選出的金屬離子對(duì)β -葡聚糖的產(chǎn)量影響不大，而加入發(fā)明人篩選出的漆酶底物雖然會(huì)稍微延長葡聚糖積累的時(shí)間，但對(duì)β -葡聚糖產(chǎn)量影響不大，而選用的灰樹花生長因子B組維生素會(huì)促進(jìn)菌絲體的產(chǎn)量提高，進(jìn)而提高葡聚糖的產(chǎn)量，可見本發(fā)明發(fā)明人篩選添加的誘導(dǎo)因子對(duì)于 β-葡聚糖的生產(chǎn)并沒有造成不利影響，實(shí)現(xiàn)了與漆酶生產(chǎn)的共存；而菌絲體中積累葡聚糖的過程和菌絲體向胞外分泌漆酶的過程在時(shí)間上有一個(gè)差異。菌絲體生長過程中，有限積累β -葡聚糖，在48-96h之間達(dá)到高峰，然后增長緩慢，并逐漸處于平穩(wěn)狀態(tài)；而漆酶的產(chǎn)生在72-240h之間達(dá)到最高峰，之后開始下降。可見，在同時(shí)以葡聚糖和漆酶作為目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，由于控制了發(fā)酵培養(yǎng)基中的還原糖水平和氨基氮水平始終保持一個(gè)較低而平穩(wěn)的水平，雖然整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間的加長會(huì)會(huì)使β-葡聚糖產(chǎn)生的時(shí)間延長，但不會(huì)使β-葡聚糖的產(chǎn)量下降反而會(huì)有所上升，同時(shí)保證了漆酶的產(chǎn)量。因而從總體經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量來看，總的產(chǎn)品收益要高于單一產(chǎn)品的收益的總和?？傮w來說，本發(fā)明所篩選的產(chǎn)酶誘導(dǎo)因子在發(fā)酵過程中的加入不會(huì)影響葡聚糖的產(chǎn)量，更不會(huì)抑制葡聚糖的產(chǎn)生。此外，由于葡聚糖屬于灰樹花細(xì)胞壁成分，經(jīng)誘導(dǎo)后，會(huì)使胞內(nèi)蛋白溶出，從而提高β_葡聚糖的純度， 反而更加有利于葡聚糖的純化。
(2)漆酶提取分離和純化步驟
Α.發(fā)酵液預(yù)處理調(diào)整發(fā)酵液pH值6-8，固液分離；固體菌絲做提取灰樹花水溶性β-葡聚糖使用；
B.膜分離固液分離后的發(fā)酵液采用孔徑O. 1-0. 5 μ m的膜微濾，澄清液用2-6KD 的超濾膜濃縮，得到2-5wt%的漆酶濃縮液，添加保護(hù)劑，混合均勻后干燥；
C.干燥進(jìn)風(fēng)溫度180_260°C、出風(fēng)溫度60_90°C的條件下，將加入保護(hù)劑的濃縮液噴霧干燥，得到漆酶產(chǎn)品；
其中保護(hù)劑可以是玉米淀粉、糊精、可溶性玉米淀粉中的一種或幾種混合物；(3)灰樹花β -葡聚糖的提取分離和純化步驟如下Α.干燥粉碎將上述發(fā)酵的菌絲體經(jīng)固液分離后，菌絲體干燥、粉碎，得到灰樹花菌絲粉；B.水提菌絲粉加入10-30 (w/w)倍質(zhì)量的水提取，提取溫度80_140°C，提取時(shí)間O. 5-2h，提取次數(shù)1-2次，經(jīng)固液分離后，得到固形物I，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后，經(jīng)噴霧干燥，得到灰樹花提取物；C.堿提向水處理所得固形物I中加入氫氧化鈉溶液，加入的氫氧化鈉溶液體積為固形物I體積的10-30倍(v/v)，氫氧化鈉溶液濃度為4%-12% (w/v)，處理溫度為80-90°C，攪拌反應(yīng)時(shí)間lh，提取1-2次；堿提取后所得清液用乙酸中和，中和時(shí)，控制清液的PH范圍為5. 0-6. 0，離心，得到清液，沉淀經(jīng)處理用于飼料加工； D.脫鹽堿提后的清液采用孔徑O. 1-0. 5 μ m的微濾膜過濾，澄清液再用6KD的超濾膜脫鹽；E.酶解脫鹽后的清液，用去離子水調(diào)整多糖濃度l_2wt%，調(diào)整pH值在7. 5-8. 5，添加O. 01-0. 1% (w/v)的蛋白酶在50-60°C的條件下，酶解2_4h，100°C滅活I(lǐng)Omin ；所述蛋白酶可以是中性蛋白酶、堿性蛋白酶中的一種或幾種混合物。F.濃縮、干燥酶解液采用孔徑O. 1-0. 5 μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，然后噴霧干燥，噴霧干燥條件進(jìn)風(fēng)溫度180-260°C、出風(fēng)溫度60-90°C的條件下干燥，得到水溶性灰樹花葡聚糖。更為具體的過程如下(I)灰樹花液體發(fā)酵Α.菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4-8h ；B.液體種子制備在無菌操作臺(tái)上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個(gè)三角瓶，振蕩培養(yǎng)24-48h制備得到種子液；C.發(fā)酵在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基總重量O. 01-0. 05%的含特定金屬離子的鹽，如含鈣離子或鎂離子或銅離子或鋅離子或鈷離子或錳離子中的一種或幾種鹽的混合物，及占培養(yǎng)基總重量O. 005-0. 02%的生長因子，如維生素B6、B12等，以及占培養(yǎng)基總重量O. 1-5%的底物，如愈創(chuàng)木酚、木素、木屑、小麥秸桿等富含木素等物質(zhì)；生長因子將液體種子以5-10% (v/v)的接種量在無菌條件下接到已滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)72h,流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w)的氮源，控制發(fā)酵液還原糖在O. 5_2mg/mL水平，氨基氮在100-500mg/L之間，同時(shí)控制代謝過程的pH在5. 0-6. 5之間，共培養(yǎng)120-240h。發(fā)酵終止時(shí)，發(fā)酵液中的酶活為506U/mL，發(fā)酵液中的多糖含量為I. 2g/L，菌絲體中的β -葡聚糖含量為60g/kg (干基計(jì))；(2)漆酶提取分離和純化步驟A.發(fā)酵液預(yù)處理調(diào)整發(fā)酵液pH值6-8，固液分離；固體菌絲做提取灰樹花水溶性β -葡聚糖使用；預(yù)處理結(jié)束時(shí)，酶活為458U/mL ；
B.膜分離固液分離后的發(fā)酵液采用孔徑O. 1-0. 5 μ m的膜微濾，澄清液用2-6KD 的超濾膜濃縮，得到2-5wt%的漆酶濃縮液，添加保護(hù)劑，保護(hù)劑可以是玉米淀粉、糊精、 可溶性玉米淀粉中的一種或幾種混合物，混合均勻后干燥；濃縮結(jié)束時(shí)，濃縮液的酶活為 2085U/mL ；
C.干燥進(jìn)風(fēng)溫度180_260°C、出風(fēng)溫度60_90°C的條件下，將加入保護(hù)劑的濃縮液噴霧干燥，得到漆酶產(chǎn)品。該產(chǎn)品的酶活為34300U/g。
(3)灰樹花β -葡聚糖的提取分離和純化步驟如下
Α.干燥粉碎將上述發(fā)酵的菌絲體經(jīng)固液分離后，菌絲體干燥、粉碎，得到灰樹花菌絲粉；
B.水提菌絲粉加入15-30 (w/w)倍質(zhì)量的水提取，提取溫度90_140°C，提取時(shí)間l_2h，提取次數(shù)1-2次，經(jīng)固液分離后，得到固形物I，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后，經(jīng)噴霧干燥，得到灰樹花提取物；
C.堿提向水處理所得固形物I中加入堿溶液，加入的堿溶液體積為沉淀I體積的10-30倍，堿溶液濃度為4%-12%(w/v)，處理溫度為80-90°C，攪拌反應(yīng)時(shí)間lh，提取1_2 次，堿提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH范圍為5. 0-6. 0，離心，得到清液；
D.脫鹽清液采用孔徑O. 1-0. 5 μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜脫鹽；
E.酶解脫鹽后的清液，用去離子水調(diào)整多糖濃度l_2wt%，調(diào)整pH值在7. 5-8. 5， 添加O. 01-0. I (w/v)的蛋白酶在50-60°C的條件下，酶解2_4h，100°C滅活I(lǐng)Omin ；
F.濃縮、干燥酶解液采用孔徑O. 1-0. 5 μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，然后噴霧干燥，噴霧干燥條件進(jìn)風(fēng)溫度180-260°C、出風(fēng)溫度60-90°C的條件下干燥， 得到水溶性灰樹花β-葡聚糖；
其中，在發(fā)酵過程中，灰樹花菌株產(chǎn)漆酶的條件通過如下方法確定
(I)采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過改變溫度、初始pH值、接種量、裝液量和培養(yǎng)時(shí)間，確定液體種子最佳培養(yǎng)條件和液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件；
(2)采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過改變培養(yǎng)基的碳氮源和無機(jī)鹽種類，確定該菌株液體種子最佳培養(yǎng)基組成和液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成。
經(jīng)過上述單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了該菌株液體種子培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件如下
液體種子培養(yǎng)基組成，按重量份計(jì)(w/w)為馬鈴薯1%，酵母浸粉O. 15%，麩皮2%， 葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 3%，硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為 121。。，O. 15Mpa 滅菌 30min ；
液體種子培養(yǎng)條件接種量為每個(gè)三角瓶接種I支菌株斜面培養(yǎng)物,pH值自然，培養(yǎng)溫度24°C 28°C，搖床轉(zhuǎn)速75-200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為24 48h ；
經(jīng)過上述單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)所獲得菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件如下
液體培養(yǎng)基組成，按重量份計(jì)(w/w)為馬鈴薯1%，愈創(chuàng)木酚O. 1%，酵母浸粉 O. 15%，麩皮2%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 3%，硫酸鎂O. 1%，硫酸銅O. 02%,磷酸二氫鉀O. 05%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌30min ；
利用本發(fā)明所獲菌株生產(chǎn)漆酶聯(lián)產(chǎn)灰樹花β -葡聚糖具有以下優(yōu)點(diǎn)
I.采用灰樹花菌株發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，由于采用誘導(dǎo)產(chǎn)酶技術(shù)，不僅不影響葡聚糖的產(chǎn)量還有所增加，在菌絲體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)溶出的同時(shí)，使細(xì)胞壁β_葡聚糖相對(duì)含量增加，減少了雜蛋白的量，有利于β_葡聚糖的提取純化；2.整個(gè)工藝漆酶發(fā)酵水平達(dá)到500U/mL，產(chǎn)品酶活10000U/g以上，高于市售產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)；3.生產(chǎn)菌株為灰樹花,是一種傳統(tǒng)習(xí)用的藥食兩用真菌,利用該菌株生產(chǎn)漆酶的同時(shí)，所得副產(chǎn)物灰樹花菌絲體也是一種食用真菌，具有較高的附加值；4.該工藝生產(chǎn)漆酶的同時(shí)生產(chǎn)灰樹花β-葡聚糖,達(dá)到漆酶與灰樹花β-葡聚糖聯(lián)產(chǎn)的目的，降低漆酶生產(chǎn)成本的同時(shí)，也降低了灰樹花β_葡聚糖的成本；綜上所述，本發(fā)明提供了一株產(chǎn)漆酶的灰樹花菌株和利用灰樹花生產(chǎn)漆酶聯(lián)產(chǎn)灰樹花β -葡聚糖的工藝，該菌株可應(yīng)用于生產(chǎn)漆酶，發(fā)酵水平500U/mL，產(chǎn)品酶活10000U/g以上；灰樹花β -葡聚糖含量> 75wt%，滿足歐盟水溶性β -葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)。保藏信息保藏時(shí)間2006年5月11日保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心保藏編號(hào)CGMCCNo. 1709保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所分類命名灰樹花，GrifolaFrondosa
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍，下述實(shí)施例中所采用的菌種均為保藏號(hào)為CGMCCNo. 1709的菌種。實(shí)施例I(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺(tái)上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，無菌條件下沖洗入裝有滅菌種子培養(yǎng)基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個(gè)三角瓶，PH值自然，培養(yǎng)溫度24°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；種子培養(yǎng)基組成(w/w)為按重量計(jì)(w/w)為馬鈴薯1%，酵母浸粉0. 15%，麩皮2%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨0. 3%，硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,加水至IOOOmL ；滅菌條件為121°C，0. 15Mpa滅菌30min ；(3)發(fā)酵、調(diào)控過程將液體種子以10% (v/v)的接種量接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速175r/min，26°C培養(yǎng)48h，同時(shí)流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w)的氮源，其中所述的碳源選自葡萄糖，所述的氮源選自的酵母浸粉，從而使還原糖和氨基氮穩(wěn)定在一個(gè)較低而平穩(wěn)的水平上，其中控制發(fā)酵液還原糖在1.5mg/m L左右的水平，氨基氮在200mg/L的水平，流加時(shí)間控制24h，總共培養(yǎng)196h ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為馬鈴薯1%，酵母浸粉0. 15%，麩皮2%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 3%，硫酸鎂O. 1%，硫酸銅O. 02%,磷酸二氫鉀O. 05%,加水至 10OOmT,；
在上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加愈創(chuàng)木酚O. 1% (w/w)，作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)因子，之后滅菌，滅菌條件為121°C，O. 15Mpa滅菌30min ；
(4)漆酶提取分離取4L發(fā)酵液，經(jīng)檢測漆酶酶活550U/mL，調(diào)整發(fā)酵液pH值7， 4000r/min離心lOmin，固體菌絲做提取灰樹花水溶性β -葡聚糖使用；發(fā)酵液采用孔徑 O. Iym的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，得到濃縮液526mL，添加52. 6g可溶性玉米淀粉，經(jīng)噴霧干燥，得到漆酶66. 8g，經(jīng)檢測，漆酶酶活達(dá)到18600U/g。
(5)灰樹花β -葡聚糖的提取分離
將菌絲體干燥、粉碎，得到灰樹花菌絲粉65g ;菌絲粉加入I. 3L的水提取，提取溫度120°C，提取時(shí)間lh，提取次數(shù)2次，經(jīng)固液分離后，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后，經(jīng)噴霧干燥，得到灰樹花提取物14. 5g ;向水處理所得沉淀物I中加入I. 31L4%的堿溶液，處理溫度為80°C，攪拌反應(yīng)時(shí)間lh，提取2次。堿提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH 范圍為6. O，離心，得到清液。采用孔徑0.1 μπι的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜脫鹽。脫鹽后的清液，用去離子水調(diào)整多糖濃度2wt%，調(diào)整pH值在8. 5，添加O. I (w/v)的堿性蛋白酶在60°C的條件下，酶解4h，100°C滅活I(lǐng)Omin ;酶解液采用孔徑O. I μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，然后噴霧干燥，得到水溶性灰樹花β -葡聚糖2. 7g，經(jīng)檢測多糖含量 81. 6wt%。
實(shí)施例2
漆酶的提取制備
取IOL發(fā)酵液，經(jīng)檢測漆酶酶活512U/mL，調(diào)整發(fā)酵液pH值6. 5，4000r/min離心 IOmin,固體菌絲做提取灰樹花水溶性β -葡聚糖使用；發(fā)酵液采用孔徑O. I μ m的膜微濾， 澄清液用6KD的超濾膜濃縮，得到濃縮液482mL，添加48. 2g玉米淀粉，經(jīng)噴霧干燥，得到漆酶59. 2g，經(jīng)檢測，漆酶酶活達(dá)到42200U/g。
實(shí)施例3
灰樹花β -葡聚糖的提取分離
將菌絲體干燥、粉碎，得到灰樹花菌絲粉168g ;菌絲粉加入3. 36L的水提取，提取溫度100°C，提取時(shí)間lh，提取次數(shù)2次，經(jīng)固液分離后，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后，經(jīng)噴霧干燥，得到灰樹花提取物34. 5g ；向水處理所得沉淀物I中加入3. 36L8%的堿溶液，處理溫度為80°C，攪拌反應(yīng)時(shí)間lh，提取2次。堿提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH 范圍為6. O，離心，得到清液。采用孔徑O. I μπι的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜脫鹽。脫鹽后的清液，用去離子水調(diào)整多糖濃度I. 2wt%，調(diào)整pH值在8. O，添加O. I (w/v)的堿性蛋白酶在60°C的條件下，酶解4h，100°C滅活I(lǐng)Omin ;酶解液采用孔徑O. I μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，然后噴霧干燥，得到水溶性灰樹花β -葡聚糖6. 5g，經(jīng)檢測多糖含量 84. 2wt%。
實(shí)施例4
漆酶提取分離
取5L發(fā)酵液，經(jīng)檢測漆酶酶活510U/mL，調(diào)整發(fā)酵液pH值7，4000r/min離心 IOmin,固體菌絲做提取灰樹花水溶性β -葡聚糖使用；發(fā)酵液采用孔徑O. I μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，得到濃縮液336mL，添加33. 6g可溶性玉米淀粉，經(jīng)噴霧干燥，得到漆酶36. 8g，經(jīng)檢測，漆酶酶活達(dá)到21900U/g。實(shí)施例5灰樹花葡聚糖的提取分離將菌絲體干燥、粉碎，得到灰樹花菌絲粉78g ;菌絲粉加入I. OL的水提取，提取溫度90°C，提取時(shí)間lh，提取次數(shù)2次，經(jīng)固液分離后，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后，經(jīng)噴霧干燥，得到灰樹花提取物15. 5g ;向水處理所得沉淀物I中加入1L10%的堿溶液，處理溫度為90°C，攪拌反應(yīng)時(shí)間lh，提取2次。堿提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH范圍為6.0，離心，得到清液。采用孔徑O. I μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜脫鹽。脫鹽后的清液，用去離子水調(diào)整多糖濃度lwt%，調(diào)整pH值在8. 5，添加O. I (w/v)的堿性蛋白酶在60°C的條件下，酶解4h，100°C滅活I(lǐng)Omin ;酶解液采用孔徑O. I μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，然后噴霧干燥，得到水溶性灰樹花β-葡聚糖3. 12g，經(jīng)檢測多糖含量82. lwt%。實(shí)施例6(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺(tái)上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，無菌條件下沖洗入裝有滅菌種子培養(yǎng)基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個(gè)三角瓶，PH值自然，培養(yǎng)溫度24°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；種子培養(yǎng)基組成(w/w)為按重量計(jì)(w/w)為馬鈴薯1%，酵母浸粉O. 15%，麩皮2%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 3%，硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,加水至IOOOmL ；滅菌條件為121 °C，O. 15Mpa滅菌30min ；(3)發(fā)酵、調(diào)控過程將液體種子以10% (v/v)的接種量接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，26°C培養(yǎng)48h，同時(shí)流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w)的氮源，其中所述的碳源選自乳糖，所述的氮源選自的硫酸銨，從而使還原糖和氨基氮穩(wěn)定在一個(gè)較低而平穩(wěn)的水平上，流加時(shí)間控制24h，控制發(fā)酵液還原糖在I. 2mg/mL左右水平，氨基氮在400mg/L，同時(shí)控制代謝過程的pH在5. 0-5. 5之間，共培養(yǎng)240h。液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為馬鈴薯1%，酵母浸粉O. 2%，麩皮1%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 15%，硫酸鎂O. 1%，硫酸銅O. 02%,磷酸二氫鉀O. 05%,加水至10OOmT,;滅菌條件為 121。。，O. 15Mpa 滅菌 30min ；滅菌完成后，添加入O. 01%過濾除菌后的維生素BI作為誘導(dǎo)因子。(4)漆酶提取分離取IOL發(fā)酵液，經(jīng)檢測漆酶酶活525U/mL，調(diào)整發(fā)酵液pH值7，4000r/min離心lOmin，固體菌絲做提取灰樹花水溶性β -葡聚糖使用；發(fā)酵液采用孔徑O. 22 um的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，得到濃縮液475mL，添加50g可溶性玉米淀粉，經(jīng)噴霧干燥，得到漆酶63. 5g，經(jīng)檢測，漆酶酶活達(dá)到37600U/g。(5)灰樹花β -葡聚糖的提取分離將菌絲體干燥、粉碎，得到灰樹花菌絲粉120g ;菌絲粉加入I. 8L的水提取，提取溫度100°c，提取時(shí)間2h，提取次數(shù)2次，經(jīng)固液分離后，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后，經(jīng)噴霧干燥，得到灰樹花提取物36. 5g ；向水處理所得沉淀物I中加入3. 6L10%的堿溶液，處理溫度為70°C，攪拌反應(yīng)時(shí)間2h，提取2次。堿提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH范圍為6. 5，離心，得到清液。采用孔徑O. 22 μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜脫鹽。脫鹽后的清液，用去離子水調(diào)整多糖濃度2wt%，調(diào)整pH值在8. 0，添加O. 05 (w/v)的堿性蛋白酶在50°C的條件下，酶解4h，100°C滅活I(lǐng)Omin ;酶解液采用孔徑O. 22 μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，然后噴霧干燥，得到水溶性灰樹花β -葡聚糖5. 2g，經(jīng)檢測多糖含量 83. 9wt%0
權(quán)利要求
1.一株灰樹花菌株，保藏號(hào)為CGMCC No. 1709，其用于生產(chǎn)漆酶的用途。
2.一種利用權(quán)利要求I所述菌株生產(chǎn)漆酶和β_葡聚糖的方法，其特征在于包括灰樹花發(fā)酵及漆酶提取分離和β -葡聚糖提取分離等步驟，在漆酶的發(fā)酵過程中應(yīng)用漆酶產(chǎn)生過程的誘導(dǎo)和積累過程的誘導(dǎo)工序 所述的漆酶產(chǎn)生過程的誘導(dǎo)和積累過程的誘導(dǎo)工序具體步驟如下 Α.誘導(dǎo)因子篩選 從漆酶可以作用的底物、菌株發(fā)酵過程所需的生長因子、酶系的調(diào)控三個(gè)方面篩選誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)因子選自含特定金屬離子的鹽或生長因子或漆酶底物； B.誘導(dǎo)因子使用方法 將酶系調(diào)控所需的含特定金屬離子的鹽、特定生長因子及漆酶底物加入培養(yǎng)基中用于調(diào)控細(xì)胞內(nèi)酶系； C.發(fā)酵控制 首先用正常濃度的碳源使菌體生長，進(jìn)入生產(chǎn)期后再陸續(xù)補(bǔ)加碳、氮源，通過不斷補(bǔ)料把菌體維持在生長狀態(tài)，從而提聞漆酶的廣率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述誘導(dǎo)因子中的特定金屬離子選自含鈣離子或鎂離子或銅離子或鋅離子或鈷離子或錳離子中的一種或幾種鹽的混合物；生長因子選自B族維生素；底物選自愈創(chuàng)木酚、木素、木屑、小麥秸桿等中的一種或幾種混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于具體步驟如下 (O灰樹花液體發(fā)酵 Α.斜面菌種活化； B.液體搖瓶種子制備； C.誘導(dǎo)產(chǎn)酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備； D.發(fā)酵菌種活化后，經(jīng)液體發(fā)酵擴(kuò)繁種子菌懸液，再利用液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)得到發(fā)酵液； 其中發(fā)酵過程具體為將液體種子以2-10% (ν/ν)的接種量接到含有誘導(dǎo)因子的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始還原糖濃度為18. 26mg/mL，26°C培養(yǎng)72h，流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w)的氮源,控制發(fā)酵液還原糖在O. 5-2mg/mL水平,氨基氮在100_500mg/L之間，同時(shí)控制代謝過程的pH在5. 0-6. 5之間，共培養(yǎng)120-240h ;經(jīng)上述工藝發(fā)酵后，漆酶發(fā)酵水平達(dá)到500U/mL以上； (2)漆酶提取分離和純化步驟 A.發(fā)酵液預(yù)處理調(diào)整上步發(fā)酵液pH值6-8，固液分離；固體菌絲做提取灰樹花水溶性β-葡聚糖使用； B.膜分離固液分離后的發(fā)酵液采用孔徑O.1-0. 5μπι的膜微濾，澄清液用2-6KD的超濾膜濃縮，得到2-5wt%的漆酶濃縮液，添加保護(hù)劑，混合均勻后干燥； C.干燥進(jìn)風(fēng)溫度180-260°C、出風(fēng)溫度60-90°C的條件下，將加入保護(hù)劑的濃縮液噴霧干燥，得到漆酶產(chǎn)品； (3)灰樹花β-葡聚糖的提取分離和純化步驟如下 Α.干燥粉碎將上述發(fā)酵的菌絲體經(jīng)固液分離后，菌絲體干燥、粉碎，得到灰樹花菌絲粉；B.水提菌絲粉加入10-30(w/w)倍質(zhì)量的水提取，提取溫度80-140°C，提取時(shí)間O.5-2h，提取次數(shù)1-2次，經(jīng)固液分離后，得到固形物I，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后，經(jīng)噴霧干燥，得到灰樹花提取物； C.堿提向水處理所得固形物I中加入氫氧化鈉溶液，加入的氫氧化鈉溶液體積為固形物I體積的10-30倍(v/v)，氫氧化鈉溶液濃度為4%-12%(w/v)，處理溫度為80_90°C，攪拌反應(yīng)時(shí)間lh，提取1-2次；堿提取后所得清液用乙酸中和，中和時(shí)，控制清液的PH范圍為5.0-6. 0，離心，得到清液，沉淀經(jīng)處理用于飼料加工； D.脫鹽堿提后的清液采用孔徑O.1-0. 5 μ m的微濾膜過濾，澄清液再用6KD的超濾膜脫鹽； E.酶解脫鹽后的清液，用去離子水調(diào)整多糖濃度l_2wt%，調(diào)整pH值在7.5-8. 5，添加O.01-0. 1% (w/v)的蛋白酶在50-60°C的條件下，酶解2_4h，100°C滅活I(lǐng)Omin ； F.濃縮、干燥酶解液采用孔徑O.1-0. 5 μ m的膜微濾，澄清液用6KD的超濾膜濃縮，然后噴霧干燥，噴霧干燥條件進(jìn)風(fēng)溫度180-260°C、出風(fēng)溫度60-90°C的條件下干燥，得到水溶性灰樹花β -葡聚糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于所述的保護(hù)劑為玉米淀粉、糊精、可溶性玉米淀粉中的一種或幾種混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于所述的蛋白酶為中性蛋白酶或堿性蛋白酶或其混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于所述的碳源物質(zhì)為葡萄糖或蔗糖或淀粉中的一種或幾種的混合物；所述的氮源物質(zhì)蛋白胨或酵母浸粉或酵母粉或玉米漿中的一種或幾種的混合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一株高產(chǎn)漆酶的灰樹花菌株及利用該菌株進(jìn)行液體發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)β-葡聚糖和漆酶的方法。本發(fā)明所涉及的生產(chǎn)菌株為灰樹花(Grifolafrondosa)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No.1709。利用該菌株通過液體發(fā)酵、固液分離、超濾濃縮、干燥等步驟生產(chǎn)漆酶，同時(shí)，以發(fā)酵菌絲體為原料經(jīng)熱水提取、冷堿提取、熱堿提取、中和、離心、超濾脫鹽濃縮、干燥等過程生產(chǎn)β-葡聚糖。該菌株發(fā)酵周期短，漆酶酶活水平高，且菌絲體中β-葡聚糖含量高，達(dá)到漆酶與灰樹花水溶性β-葡聚糖聯(lián)產(chǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C08B37/02GK102972213SQ20121058658
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者欒波, 徐澤平, 高洪奎, 劉辛, 王麗霞 申請(qǐng)人:黃河三角洲京博化工研究院有限公司