專利名稱：重組人psp94蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用大腸桿菌分泌表達(dá)有生物活性的人PSP94蛋白的方法。
背景技術(shù)：
前列腺癌是老年男性代表性疾病。1996年起美國前列腺癌的發(fā)病率已居男性惡性腫瘤的第一位，而死亡率僅次于肺癌位居癌癥死亡第二位。因?yàn)椋傲邢傥恢秒[蔽，癌多發(fā)生在遠(yuǎn)離尿道的周邊區(qū)，現(xiàn)代檢測技術(shù)血清PSA檢測難以滿足早期診斷的需要，使很多患者失去治療的機(jī)會。
迄今，我國臨床前列腺癌仍是晚期才能診斷。1999年起，本課題組所在的“前列腺疾病防治研究中心”在中日政府間專項(xiàng)技術(shù)合作項(xiàng)目的援助下，應(yīng)用血清PSA對長春市16500余名50歲以上男性進(jìn)行了前列腺癌集團(tuán)普查，前列腺癌的發(fā)現(xiàn)率超過1.7％。其中，中晚期病例占42％，伴有骨轉(zhuǎn)移者占18.8％。我們認(rèn)為PSA＞10.0ng/ml的可疑人群中PSA對前列腺癌診斷有明顯的特異性。譬如，PSA含量＞40.0ng/ml的可疑人群中前列腺癌診斷率超過95％，而PSA＞20.0ng/ml的人群中診斷率超過75％。然而，在PSA含量≥4.0ng/ml-10.0ng/ml，所謂“灰色區(qū)”的可疑人群經(jīng)超聲引導(dǎo)下活檢，前列腺癌的診斷率僅15％上下。因此，為提高PSA灰色區(qū)域的前列腺癌診斷效率，急需探索新的腫瘤標(biāo)志物。
近年國內(nèi)外的研究結(jié)果表明，前列腺上皮細(xì)胞合成分泌的一種含有94個氨基酸的蛋白，即PSP94，在治療和監(jiān)測前列腺癌進(jìn)展方面具有良好的應(yīng)用前景。因PSP94主要存在于前列腺液中，天然的PSP94很難大量獲得。目前國內(nèi)外對PSP94的表達(dá)多采用重組融合蛋白形式，這種融合表達(dá)雖然具有表達(dá)效率較高、蛋白降解較少等優(yōu)點(diǎn)，但表達(dá)后需酶切或化學(xué)裂解去除融合蛋白，并且產(chǎn)生的蛋白以無活性的包涵體形式存在，需要體外變性再復(fù)性的過程，大大增加了產(chǎn)品下游的工作量。由于PSP94為多半胱氨酸蛋白，體外復(fù)性，難以形成正確的二硫鍵，所得蛋白的幾乎無生物活性。
現(xiàn)有的蛋白分泌表達(dá)技術(shù)，是在載體編碼信號肽序列的DNA下游連接多克隆位點(diǎn)。連入目的基因后，多克隆位點(diǎn)的DNA也翻譯成氨基酸，從而有可能使表達(dá)的分泌蛋白失去生物活性，作為藥物有可能引起人體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生各種副作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的PSP94表達(dá)后處理繁瑣，工作量大，活性產(chǎn)品得率低的不足，本發(fā)明提供一種重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的方法。通過對信號肽的基因突變，將酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)到信號肽內(nèi)部，去除多克隆位點(diǎn)引起的多余氨基酸問題。重組蛋白直接分泌到雜蛋白較少的周質(zhì)空間，不但避免了菌體內(nèi)各種蛋白酶對重組蛋白的降解，增高了表達(dá)水平，易于純化。而且在周質(zhì)空間的氧化型環(huán)境下蛋白可以形成天然情況下的二硫鍵，直接得到具有天然結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了其生物學(xué)活性。采用溫控型表達(dá)，避免了使用誘導(dǎo)劑的成本。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一、PSP94 cDNA的克隆擴(kuò)增提取前列腺組織總RNA，通過RT-PCR方法釣取中國人PSP94cDNA序列，插入克隆載體pUC19中，PCR粗篩后進(jìn)行序列測定；二、重組分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建將雙酶切后的PSP94蛋白編碼基因、信號肽和pBV220質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV-PSP94；
三、重組PSP94蛋白表達(dá)陽性重組質(zhì)粒pBV-PSP94分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，如JM109、HB101、LB21菌株，優(yōu)選JM109表達(dá)效果最好，故PSP94蛋白選取JM109作為宿主菌進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)摸索蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最適溫度為40℃，最佳表達(dá)時間為5小時。
步驟二信號肽采取經(jīng)修飾過的天然白喉毒素信號肽。
步驟二經(jīng)修飾過的天然白喉毒素信號肽為ES1為含EcoR I酶切位點(diǎn)的信號肽有意鏈引物5’-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3’ES25’-GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CAC GAATTCCG-3’我們利用pBV220質(zhì)粒作為表達(dá)載體，其含有受溫度調(diào)控的強(qiáng)啟動子PRPL。引入了改造的白喉毒素信號肽順序。利用氨基酸密碼字的兼并性，即利用基因編碼多個密碼子對應(yīng)一種氨基酸的性質(zhì)，在不改變氨基酸序列的前提下突變白喉毒素的信號肽的基因，將限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SphI引入到信號肽序列內(nèi)，便于PSP94基因的連接。利用RT-PCR技術(shù)從人前列腺組織中克隆人PSP94基因。采用PCR技術(shù)在PSP94蛋白編碼基因的N端引入SphI位點(diǎn)。C端引入連接的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)并設(shè)計(jì)了雙終止密碼子，可保證蛋白翻譯的正確終止。經(jīng)酶切，連入改造后含有白喉毒素信號肽順序的載體。篩選具有插入基因的克隆質(zhì)粒。優(yōu)化表達(dá)的菌株和表達(dá)條件。利用半透膜的截留性質(zhì)，分離純化PSP94。采用SDS-PAGE電泳技術(shù)檢驗(yàn)其純度，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物學(xué)活性。
本發(fā)明的有益效果是，通過分子生物學(xué)技術(shù)，突變分泌表達(dá)載體的信號肽，在信號肽上引入酶切位點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)分泌表達(dá)載體在表達(dá)的蛋白前添加多余氨基酸的問題，獲得了一級結(jié)構(gòu)與人PSP94天然蛋白完全相同的產(chǎn)物，使表達(dá)的PSP94在人體內(nèi)沒有免疫排斥反應(yīng)，有可能成為新的抗前列腺癌的藥物。重組得到的PSP94分泌型表達(dá)質(zhì)?？墒贡磉_(dá)的重組蛋白分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中，避免了菌體內(nèi)蛋白酶的降解作用，周質(zhì)空間內(nèi)含量極微的菌體本身蛋白又使得重組蛋白的分離純化更加容易，并且周質(zhì)空間中的氧化型環(huán)境還可以模擬真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成天然PSP94蛋白中的二硫鍵，使蛋白空間結(jié)構(gòu)更加接近天然狀態(tài)。這種表達(dá)方式避免了傳統(tǒng)的包涵體技術(shù)在菌體內(nèi)表達(dá)蛋白后復(fù)雜的復(fù)性純化過程，重組蛋白也具有更高的生物學(xué)活性。在得到分泌型重組蛋白的基礎(chǔ)上，又通過活性驗(yàn)證證明，重組蛋白具有非常明顯的抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡并使癌細(xì)胞良性轉(zhuǎn)化的活性


圖1、所示為RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在480bp左右處可見到一條明顯的條帶，圖2、重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證結(jié)果圖，在280bp左右處有一條明顯DNA帶，與PSP94蛋白編碼基因長度一致。
圖3、重組質(zhì)粒DNA測序圖，下劃線部分為PSP94 cDNA序列，與預(yù)期結(jié)果完全相同。
圖4、構(gòu)建重組分泌型表達(dá)質(zhì)粒pBV-PSP94流程圖。
圖5、重組質(zhì)粒pBV-PSP220的PCR粗篩后電泳結(jié)果圖。
圖6、重組質(zhì)粒pBV-PSP94的測序結(jié)果圖。
圖7、重組分泌型PSP94蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析。
圖8、不同劑量PSP94處理48h后PC-3細(xì)胞的抑制率。
圖9、PSP94處理不同時間對于PC-3細(xì)胞的抑制率。
圖10、a，b部分，重組PSP94蛋白處理48h后PC-3細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
圖11、PSP94處理后PC-3細(xì)胞DNA含量變化直方圖。
圖12、PBV220的物理圖譜。
具體實(shí)施例方式
材料、菌株、細(xì)胞株和試劑所用人正常前列腺組織前列腺癌組織均由吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科提供。
各種工具酶包括逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶、TaqDNA聚合酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。
DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司，蛋白定量試劑盒為Bio-Rad公司產(chǎn)品。
菌株E.coli JM109和質(zhì)粒pUC19、pBV220由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。E.coli JM109和質(zhì)粒pUC19是可購買到的商品，關(guān)于pBV220本實(shí)施例中提供全序列和物理圖譜。
PC-3細(xì)胞株由原北京醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所提供，已經(jīng)可以購買到。
各種引物自行設(shè)計(jì)后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，分別包括RT-PCR擴(kuò)增PSP94 cDNA的引物CP1和CP2；成熟PSP94蛋白基因引物EP1和EP2和信號肽序列ES1和ES2。
其它常規(guī)化學(xué)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
實(shí)施例一、PSP94 cDNA的克隆擴(kuò)增利用異硫氰酸胍一步法提取人正常前列腺組織總RNA，在引物Oligo(dT)15引導(dǎo)下，經(jīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA，再以CP1、CP2為引物PCR擴(kuò)增PSP94 cDNA。
CP1(5’TTACTGATAGGCATGGCTAC-3’)
CP2(5’-TGCTTATCACAATGAATGTTCTCCTGGGG-3’)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠回收后與經(jīng)SmaI酶切的pUC19質(zhì)粒連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pUC-PSP94。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)且E.coli JM109細(xì)菌，鋪于含氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜后，選擇白色菌落接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，以EP1和EP2為引物擴(kuò)增PSP94蛋白基因片段對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行粗篩，之后將選出的重組質(zhì)粒送上海生工牛物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。
EP1(5’-GCGCATGCATCATGCTATTTCATACCTAAT-3’)EP2(5’-CGGGATCCTTATCAGATTATCCATTCACT-3’)將測序證明為正確重組的pUC-PSP94質(zhì)粒以EP1和EP2為引物擴(kuò)增PSP94蛋白基因，經(jīng)BamHI/SphI雙酶切后，凝膠回收備用。
圖1所示為RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在480bp左右處可見到一條明顯的條帶，與PSP94 cDNA序列長度一致。
重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證結(jié)果見圖2，在280bp左右處有一條明顯DNA帶，與PSP94蛋白編碼基因長度一致。重組質(zhì)粒DNA測序結(jié)果見圖3，下劃線部分為PSP94 cDNA序列，與預(yù)期結(jié)果完全相同。說明我們克隆獲得了正確的PSP94 cDNA序列。
二、重組分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建a.)信號肽序列的設(shè)計(jì)天然白喉毒素信號肽含25個氨基酸，DNA編碼序列為GTG AGC AGA AAA CTG TTT GCG TCA ATC TTA ATA GGG GCGCTA CTG GGG ATA GGG GCC CCA CCT TCA 天然白喉毒素信號肽氨基酸序列的-1、-2和-3位，即氨基酸序列Ala-His-Ala構(gòu)成信號肽酶的識別位點(diǎn)(編碼堿基序列為GCCCATGCA，如方框內(nèi)所示)，白喉毒素分泌到胞外后，信號肽酶將從此位點(diǎn)切去信號肽序列，只留下成熟蛋白質(zhì)。
根據(jù)白喉毒素的天然序列，設(shè)計(jì)了以下分泌PSP94重組蛋白的信號肽序列ES1和ES2。
ES15’-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3’ES25’GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CACGAATTCCG-3’上述信號肽引物中，ES1為含EcoR I酶切位點(diǎn)的信號肽有意鏈引物，ES2中下劃線部分為白喉毒素信號肽全序列，與天然堿基序列惟一不同之處是在不影響編碼氨基酸(丙氨酸)的前提下，將信號肽-3位氨基酸的密碼子由GCC變?yōu)镚CG。同時，這種改變還引入了Sph I酶切位點(diǎn)(GCATGC)，就將信號肽與PSP94編碼基因連接的位點(diǎn)設(shè)計(jì)到信號肽序列內(nèi)部，使得蛋白分泌到周質(zhì)空間后信號肽完全被切除，避免了構(gòu)建重組蛋白時接頭處引起的多余氨基酸問題。
ES1和ES2在Klenow DNA聚合酶作用下，以dNTP為材料，室溫延伸，產(chǎn)物經(jīng)EcoRI/SphI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收備用。
b.)重組人PSP94分泌型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pBV220經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切后，與上述雙酶切的PSP94蛋白基因產(chǎn)物及信號肽，在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，構(gòu)建重組分泌型表達(dá)質(zhì)粒pBV-PSP94。構(gòu)建流程如圖4所示。pBV220質(zhì)粒序列全長(3666bp)1aattcccggg gatccgtcga cctgcagcca agcttctgtt ttggcggatg agagaagatt61 ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct121 cccggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt181 agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ccaactgcca ggcatcaaat241 aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa
301 cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc361 cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc421 catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tgtttatttt tctaaataca481 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa541 aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt601 ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca661 gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag721 ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc781 ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca841 gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt901 aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct961 gacaacgatc gggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg1021 taactcgcct tgatcgttgg gaaccggatc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg1081 acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac1141 ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac1201 cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg1261 agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg1321 tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg1381 agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac1441 tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg1501 ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg1561 tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc1621 aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc1681 tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt1741 agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc1801 taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact1861 caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac1921 agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagcattgag1981 aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg2041 gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg2101 tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga2161 gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt2221 ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct2281 ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg2341 aggaagcgga agagcgccct tatctttccc tttatttttg ctgcggtaag tcgcataaaa2401 accattcttc ataattcaat ccatttacta tgttatgttc tgaggggagt gaaaattccc2461 ctaattcgat gaagattctt gctcaattgt tatcagctat gcgccgacca gaacaccttg2521 ccgatcagcc aaacgtctct tcaggccact gactagcgat aactttcccc acaacggaac2581 aactctcatt gcatgggatc attgggtact gtgggtttag tggttgtaaa aacacctgac2641 cgctatccct gatcagtttc ttgaaggtaa actcatcacc cccaagtctg gctatgcaga2701 aatcacctgg ctcaacagcc tgctcagggt caacgagaat taacattccg tcaggaaagc2761 ttggcttgga gcctgttggt gcggtcatgg aattaccttc aacctcaagc cagaatgcag2821 aatcactggc ttttttggtt gtgcttaccc atctctccgc atcacctttg gtaaaggttc2881 taagcttagg tgagaacatc cctgcctgaa catgagaaaa aacagggtac tcatactcac2941 ttctaagtga cggctgcata ctaaccgctt catacatctc gtagatttct ctggcgattg
3001 aagggctaaa ttcttcaacg ctaactttga gaatttttgc aagcaatgcg gcgttataag3061 catttaatgc attgatgcca ttaaataaag caccaacgcc tgactgcccc atccccatct3121 tgtctgcgac agattcctgg gataagccaa gttcattttt ctttttttca taaattgctt3181 taaggcgacg tgcgtcctca agctgctctt gtgttaatgg tttctttttt gtgctcatac3241 gttaaatcta tcaccgcaag ggataaatat ctaacaccgt gcgtgttgac tattttacct3301 ctggcggtga taatggttgc atgtactaag gaggttgtat ggaacaacgc ataaccctga3361 aagattatgc aatgcgcttt gggcaaacca agacagctaa aagatctctc acctaccaaa3421 caatgccccc ctgcaaaaaa taaattcata taaaaaacat acagataacc atctgcggtg3481 ataaattatc tctggcggtg ttgacataaa taccactggc ggtgatactg agcacatcag3541 caggacgcac tgaccaccat gaaggtgacg ctcttaaaaa ttaagccctg aagaagggca3601 gcattcaaag cagaaggctt tggggtgtgt gatacgaaac gaagcattgg ttaaaaatta3661 aggagg插入的信號肽及PSP94序列(在第5和第10位之間，相當(dāng)于去掉4個堿基，再插入363個堿基，插入信號肽及PSP94 cDNA之后的重組質(zhì)粒長為4025bp)aattcGTG AGC AGA AAA CTG TTT GCG TCA ATC TTA ATA GGG GCG CTA CTGGGGATA GGG GCC CCA CCT TCA GCG CAT GCA TCATGCTATT TCATACCTAATGAGGGAGTT CCAGGAGATT CAACCAGGAA ATGCATGGAT CTCAAAGGAA ACAAACACCCAATAAACTCG GAGTGGCAGA CTGACAACTG TGAGACATGC ACTTGCTACG AAACAGAAATTTCATGTTGC ACCCTTGTTT CTACACCTGT GGGTTATGAC AAAGACAACT GCCAAAGAATCTTCAAGAAG GAGGACTGCA AGTATATCGT GGTGGAGAAG AAGGACCCAA AAAAGACCTGTTCTGTCAGT GAATGGATAA TCTGATAAggatcc連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109細(xì)菌，鋪于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，31℃倒置過夜培養(yǎng)后，選取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，31℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日以堿裂解法小量提取質(zhì)粒，以BamHI/EcoRI雙酶切粗篩陽性重組體，電泳結(jié)果見圖5，在380bp左右處有一條明顯DNA帶，大小與PSP94蛋白編碼基因和信號肽序列的長度之和一致。粗篩物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果見圖6，可見信號肽序列的-3位編碼子為GCG，同時信號肽序列與PSP94蛋白編碼序列之間無任何多余堿基，信號肽酶切去信號肽序列后，在PSP94蛋白N端不會存留任何多余氨基酸，PSP94蛋白序列之后的雙終止密碼子可以保證蛋白質(zhì)翻譯的有效終止，連接方式與我們設(shè)計(jì)方案一致。
三、重組PSP94蛋白表達(dá)a.)表達(dá)含陽性重組質(zhì)粒pBV-PSP94及空的pBV220質(zhì)粒的JM109菌種分別接種于100ml含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，31℃振蕩培養(yǎng)，待菌液OD600達(dá)到0.6時，將溫度調(diào)至40℃，繼續(xù)培養(yǎng)5h。
b.)純化及鑒定上述菌液在12000rpm、4℃離心10分鐘收集菌體，棄去上清，沉淀懸于新配制的溶菌酶溶液中，冰浴10分鐘，10,000rpm、4℃離心10分鐘收集上清，即為周質(zhì)空間部分，周質(zhì)空間液依次通過透析(分子量為7000)和半透膜離心法(截留分子量為30KD)進(jìn)行純化，蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖7，含pBV-PSP94的菌株周質(zhì)空間液在11kD左右處有一明顯蛋白條帶，與PSP94蛋白分子量一致，純化后在電泳圖上幾乎表現(xiàn)為單一條帶，密度分析表明純化后的該條帶可占純化后總蛋白的93％，而含pBV220空質(zhì)粒的細(xì)菌周質(zhì)空間產(chǎn)物純化后在11kD處幾乎看不到條帶，Western blotting結(jié)果表明所得蛋白為PSP94，重組蛋白表達(dá)量可達(dá)100mg/L。
實(shí)驗(yàn)例 本發(fā)明重組PSP94蛋白活性分析采用Bio-Rad Protein Assay對純化后的重組蛋白進(jìn)行定量，用RPMI-1640培養(yǎng)液將PSP94調(diào)成濃度分別為(1000，500，100，50，10，5，0)×10-4M，過濾除菌。
(1)MTT法測定將前列腺癌PC-3細(xì)胞濃度調(diào)至2×105/mL，接種于96孔平底培養(yǎng)板，每孔100μl。培養(yǎng)24小時后棄上清，各孔分別加入含不同濃度PSP94的培養(yǎng)液200μl，每組設(shè)3復(fù)孔，陰性對照為同期培養(yǎng)的相同濃度的僅含質(zhì)粒pBV220的細(xì)菌周質(zhì)空間上清純化物。細(xì)胞培養(yǎng)44小時后，各孔分別加入新鮮配制的5μg/mLMTT，37℃溫箱孵育4小時，棄去上清，分別加入100μl的DMSO，在37℃繼續(xù)孵育4小時，在酶聯(lián)檢測儀上檢測波長570nm處的吸光度(A)值。各組抑制率計(jì)算公式為抑制率(％)＝(對照組A平均值-實(shí)驗(yàn)組A平均值)/對照組A平均值×100％。
通過體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量和細(xì)胞周期分析表明，重組的分泌型PSP94具有很強(qiáng)的生物活性，能以時間和劑量依賴性的方式對前列腺癌PC-3細(xì)胞產(chǎn)生生長抑制作用，如圖8和圖9所示，重組蛋白濃度1000ug/ml作用24小時，抑制率能達(dá)到50％以上，作用48小時后出現(xiàn)凋亡。相差顯微鏡下，對照組細(xì)胞貼壁生長，狀況良好，多為梭形，大小適中，核仁清晰，可見核分裂相；PSP94作用細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，顆粒增多，細(xì)胞碎片增加(圖10)。以上結(jié)果表明rshPSP94具有抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的活性。
(2)流式細(xì)胞技術(shù)檢測對細(xì)胞周期的影響將PC-3細(xì)胞分成兩組，實(shí)驗(yàn)組加入重細(xì)PSP94蛋白，終濃度為1×10-4M，對照組加入相同濃度的含空質(zhì)粒的細(xì)菌周質(zhì)空間上清產(chǎn)物。細(xì)胞培養(yǎng)24小時和48小時后，分別制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)碘化丙啶染色流式細(xì)胞儀分析，計(jì)算各細(xì)胞周期內(nèi)細(xì)胞所占比例，分析細(xì)胞凋亡情況。
流式細(xì)胞儀分析PSP94對PC-3細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見表1，10ug/ml作用細(xì)胞24小時后，細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為S、G2+M期細(xì)胞數(shù)減少，G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，作用48小時后，G1期細(xì)胞數(shù)增加更為明顯，占總細(xì)胞數(shù)的85％，表明細(xì)胞周期受抑，主要抑制在G1期。DNA含量分布如圖11所示。G1峰前面出現(xiàn)亞2倍體峰，表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡(細(xì)胞凋亡時，DNA斷裂生成小的DNA片段，從細(xì)胞內(nèi)釋放，導(dǎo)致亞2倍體峰出現(xiàn))。
表1重組PSP94對PC-3M細(xì)胞周期的影響

▲▲P＜0.01，▲P＜0.05 vs Control
權(quán)利要求
1.一種重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的方法，包括下列步驟一、PSP94cDNA的克隆擴(kuò)增提取前列腺組織總RNA，通過RT-PCR方法釣取中國人PSP94cDNA序列，插入克隆載體pUC19中，PCR粗篩后進(jìn)行序列測定；二、重組分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建將雙酶切后的PSP94蛋白編碼基因、信號肽和pBV220質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV-PSP94；三、重組PSP94蛋白表達(dá)陽性重組質(zhì)粒pBV-PSP94分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，如JM109、HB101、或LB21菌株，經(jīng)摸索蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最適溫度為40℃，最佳表達(dá)時間為5小時。
2.如權(quán)利要求1所述重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的方法中，步驟二信號肽采取經(jīng)修飾過的天然白喉毒素信號肽。
3.如權(quán)利要求2所述重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的方法中，步驟二經(jīng)修飾過的天然白喉毒素信號肽為ES1為含EcoRI酶切位點(diǎn)的信號肽有意鏈引物5’-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3’ES25’-GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CAC GAATTCCG-3’
4.如權(quán)利要求1所述重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的方法中，步驟三含陽性重組質(zhì)粒pBV-PSP94及空的pBV220質(zhì)粒的JM109菌種分別接種于100ml含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，31℃振蕩培養(yǎng)，待菌液OD600達(dá)到0.6時，將溫度調(diào)至40℃，繼續(xù)培養(yǎng)5h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的方法，屬于采用大腸桿菌分泌表達(dá)有生物活性的人PSP94蛋白的方法。提取前列腺組織總RNA，通過RT－PCR方法釣取中國人PSP94 cDNA序列，插入克隆載體pUC19中，PCR粗篩后進(jìn)行序列測定；將雙酶切后的PSP94蛋白編碼基因、信號肽和pBV220質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV－PSP94；陽性重組質(zhì)粒pBV－PSP94分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最適溫度為40℃，最佳表達(dá)時間為5小時。本發(fā)明的有益效果是，通過分子生物學(xué)技術(shù)，突變分泌表達(dá)載體的信號肽，在信號肽上引入酶切位點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)分泌表達(dá)載體在表達(dá)的蛋白前添加多余氨基酸的問題。
文檔編號C12N15/12GK1673377SQ20051001662
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月15日
發(fā)明者田長生, 高瑞娟, 李揚(yáng), 趙丹, 劉喜春, 趙雪儉 申請人:吉林大學(xué)