專利名稱：檢測或定量測定線粒體dna3243變異的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測和定量線粒體DNA 3243突變的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
線粒體DNA第3243位上A→G突變(mt3243)是一種在1％日本糖尿病患者中存在的突變，并且在由單基因異常引起的糖尿病狀況中發(fā)生頻率最高。線粒體基因異常地特征之一是正常和異常線粒體DNAs以各種比例共存，這種狀態(tài)稱作異胞質(zhì)基因。mt3243突變異胞質(zhì)基因的比率據(jù)說與病理學(xué)狀況的進展程度有關(guān)，并且認為其可用于測定病理學(xué)狀況的進展程度或治療效果。
如果存在mt3243突變，那么在突變的位置上出現(xiàn)限制性內(nèi)切酶的識別位點。因此，可由通過PCR擴增DNA以便擴增包括突變位置的部分、用限制性內(nèi)切酶消化擴增產(chǎn)物以及通過電泳測定DNA是否已經(jīng)被消化的方法(PCR-RFLP)檢測突變(例如，參考The JapaneseJournal of Clinical Pathology，vol.44，8，pp.778-782，1996)。
由于PCR將幾個分子的模板擴增幾十億次，因此甚至痕量的污染物都可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。在PCR-RFLP中，需要收集擴增產(chǎn)物并將其在PCR后用限制性內(nèi)切酶進行處理，因而擴增產(chǎn)物可能污染隨后的反應(yīng)體系。相應(yīng)地，可能獲得假陽性或假陰性結(jié)果。
此外，將DNA用限制性內(nèi)切酶處理，然后在PCR完成后進行電泳。因此，檢測所需的時間變得非常長。另外，因為該過程復(fù)雜，所以很難自動化。此外，因為在PCR期間重復(fù)進行變性和退火，所以正常型序列和突變型序列可能錯誤地相互結(jié)合。這種產(chǎn)物不被限制性內(nèi)切酶識別，因此其不被消化(只有當雙鏈都是突變型時，DNA才被限制性內(nèi)切酶消化)。因此，在異胞質(zhì)基因比率的定量中，突變型的比例變得比實際值更低。
與此同時，作為一種等位基因特異性擴增方法，一種稱作MASA(突變等位基因特異性擴增)法的方法是已知的(例如，參考SekiyaT.等編，“PCR Front Line-From Basic Techniques ToApplications”，Kyoritsu Shuppan，pp.140-142，1997)。在這種方法中，使用一個引物的3’端設(shè)計成為是突變的核苷酸的引物對，通過進行PCR反應(yīng)特異性擴增突變等位基因。
此外，通過使用熒光變化取決于擴增產(chǎn)物量的系統(tǒng)；通過測量熒光實時定量PCR擴增產(chǎn)物；以及基于所述結(jié)果，定量樣本中的核酸(實時定量PCR)的方法也是已知的。根據(jù)該方法，通過進行MASA法，可定量由MASA方法獲得的擴增產(chǎn)物。
此外，通過PCR擴增含有突變的區(qū)域，然后通過使用熒光染料標記的核酸探針進行解鏈曲線分析，以及根據(jù)解鏈曲線分析的結(jié)果分析突變的方法也是普遍已知的(Clinical Chemistry，vol.46，5，pp.631-635，2000；日本專利申請公開(Kokai)No.2002-119291)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供檢測和定量mt3243突變的方法及其試劑盒。此外，本發(fā)明的另一個目的是鑒定有效檢測mt3243突變的淬滅探針并因此提供檢測mt3243突變的方法及其試劑盒。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過以線粒體DNA中含有mt3243突變的特異性區(qū)域為基礎(chǔ)設(shè)計引物對，可由MASA方法檢測mt3243突變。
關(guān)于探針的設(shè)計，關(guān)于上述使用探針方法的文獻僅教導(dǎo)，探針應(yīng)當設(shè)計成當一端用熒光染料標記的淬滅探針與靶核酸雜交時，兩個或更多探針-核酸雜交體的核苷酸對應(yīng)當在末端部分形成至少一對G和C。對于mt3243突變，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計了滿足上述條件的淬滅探針并且嘗試用于檢測。然而，能用于檢測的淬滅探針不是很容易獲得的。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過基于含有mt3243突變的特異性區(qū)域設(shè)計淬滅探針，可使用淬滅探針通過解鏈曲線分析檢測mt3243突變。
本發(fā)明是在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成的并且提供下列各項。
(1)一種檢測具有線粒體DNA 3243突變的DNA的方法，其包括使用從樣品中獲得的DNA作為模板進行PCR以及檢測擴增產(chǎn)物，其中用于PCR的引物包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
(2)根據(jù)(1)的方法，其中用于PCR的引物包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(3)一種定量具有線粒體DNA 3243突變的DNA的方法，其包括使用從樣品中獲得的DNA作為模板進行定量PCR以及定量擴增產(chǎn)物，其中定量PCR是一種使用熒光變化取決于擴增產(chǎn)物量的系統(tǒng)，通過測量熒光實時定量PCR中的擴增產(chǎn)物，并且在測量結(jié)果的基礎(chǔ)上定量樣品中DNA的方法，且用于定量PCR的引物包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
(4)根據(jù)(3)的方法，其中用于定量PCR的引物包括具有SEQID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(5)一種測定樣品中所含線粒體DNA 3243突變的異胞質(zhì)基因比率的方法，其包括
(a)通過如在(3)或(4)中所定義的方法定量具有線粒體DNA 3243突變的DNA，
(b)通過定量線粒體DNAs的方法定量線粒體DNAs，所述方法包括使用從樣品獲得的DNA作為模板進行定量PCR以及定量擴增產(chǎn)物，其中定量PCR使用熒光變化取決于擴增產(chǎn)物量的系統(tǒng)，通過測量熒光實時定量PCR中的擴增產(chǎn)物，以及在測量結(jié)果的基礎(chǔ)上定量樣品中的DNAs，和
(c)從(a)和(b)的結(jié)果中計算線粒體DNA 3243突變的異胞質(zhì)基因比率。
(6)根據(jù)(5)的方法，其中在步驟(b)中使用的引物包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO4核苷酸序列的引物。
(7)根據(jù)(3)到(6)中任何一項的方法，其中該系統(tǒng)包括其5’端用熒光染料標記的核酸探針，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，其中核酸探針具有從SEQ ID NO1核苷酸序列中第212或215位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列或者從SEQ ID NO2核苷酸序列中第222位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列，或者包括其3’端用熒光染料標記的核酸探針，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，并且其具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，以及測量熒光染料的熒光。
(8)用于如在(1)中所定義方法的試劑盒，其包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
(9)根據(jù)(8)的試劑盒，其包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(10)用于如在(3)中所定義方法的試劑盒，其包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
(11)根據(jù)(10)的試劑盒，其包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(12)用于如在(5)中所定義方法的試劑盒，其包括第一引物對，所述第一引物對包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物，以及用于定量線粒體DNAs的第二引物對。
(13)根據(jù)(12)的試劑盒，其中所述第一引物對包括具有SEQID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(14)根據(jù)(12)的試劑盒，其中所述第二引物對包括具有SEQID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO4核苷酸序列的引物。
(15)根據(jù)(10)-(14)中任何一項的試劑盒，其進一步包括其5’端用熒光染料標記的核酸探針，其中雜交后熒光染料的熒光減少，并且其具有從SEQ ID NO1核苷酸序列中第212位或215位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列或者具有從SEQ IDNO2核苷酸序列中第222位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列，或者包括其3’端用熒光染料標記的核酸探針，其中雜交后熒光染料的熒光減少，并且其具有與從SEQ ID NO2核苷酸中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
(16)末端用熒光染料標記的核酸探針，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，其中核酸探針具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且探針的3’端用熒光染料標記。
(17)根據(jù)(16)的核酸探針，其中所述核酸探針具有SEQ ID NO21或22的核苷酸序列。
(18)一種檢測突變的方法，其包括通過使用熒光染料標記的核酸探針對具有單核苷酸多態(tài)性位點的核酸進行解鏈曲線分析和測量熒光染料的熒光，以及在解鏈曲線分析結(jié)果的基礎(chǔ)上檢測突變，其中單核苷酸多態(tài)性是在線粒體DNA中第3243位上的突變，且核酸探針是如在(16)或(17)中所定義的核酸探針。
(19)根據(jù)(18)的方法，其中擴增樣品中所含核酸中含有單核苷酸多態(tài)性位點的區(qū)域以獲得顯示單核苷酸多態(tài)性的核酸。
(20)根據(jù)(19)的方法，其中所述擴增是通過使用DNA聚合酶的方法進行的。
(21)根據(jù)(20)的方法，其中所述擴增是在存在核酸探針時進行的。
(22)用于如在(18)中所定義方法的試劑盒，其包括其末端用熒光染料標記的核酸探針，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，其中核酸探針具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且探針的3’端用熒光染料標記。
(23)根據(jù)(22)的試劑盒，其中所述核酸探針具有SEQ ID NO21或22的核苷酸序列。
(24)根據(jù)(22)或(23)的試劑盒，其進一步包括通過使用DNA聚合酶的方法用于擴增線粒體DNA中含有第3243位突變的區(qū)域的引物。
在本發(fā)明的說明書中，與目標核苷酸序列互補的核苷酸序列意思是與全長目標核苷酸序列的目標核苷酸序列互補的核苷酸序列。
附圖簡述


圖1顯示通過實施例1的方法(使用引物F-24和R-19)獲得的總序列的定量結(jié)果。
圖2顯示通過實施例1的方法(使用引物F-24和R-mt-16)獲得的突變型序列的定量結(jié)果。
圖3顯示通過實施例1的方法(使用引物F-24和R-mt-16)獲得的含有不同比例突變基因的樣品的定量結(jié)果。
圖4顯示不能鑒定突變的淬滅探針的位置。
圖5顯示能鑒定突變的淬滅探針的位置。
圖6顯示通過實施例2的方法獲得的含有不同比例突變基因的樣品的定量結(jié)果。在圖中，“野生的”表示野生型，“突變的”表示突變型。
實現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式
<1>本發(fā)明的第一種檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的第一種檢測方法是檢測具有線粒體DNA 3243突變的DNA的方法，包括使用從樣品獲得的DNA作為模板進行PCR并檢測擴增產(chǎn)物，其特征是用于PCR的引物包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
樣品不作特別限制，只要它含有線粒體。其實例包括血液、口腔拭子、組織等。在可制備線粒體DNAs的條件下以普通方式從這些樣品中獲得DNAs。
在本發(fā)明的第一種檢測方法中可通過普通的PCR方法進行PCR，只是除了將從樣品中獲得的DNA用作模板，并且使用特異性引物。
在本發(fā)明中使用的引物包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。也就是說，在PCR中使用的引物之一是具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
該引物的3’端是mt3243突變的位點。因此，只有當該引物退火時才發(fā)生通過DNA聚合酶的延伸反應(yīng)，因此特異性擴增具有突變型序列的DNA。因此，可通過檢測擴增產(chǎn)物來檢測具有mt3243突變的DNA。
可以以與設(shè)計常規(guī)PCR引物對的方法相同的方式設(shè)計用于PCR的引物，只是除了將它們在能進行PCR的區(qū)域中設(shè)計并且包括其3’端應(yīng)當設(shè)計成是上述mt3243突變位點的引物。引物的長度和Tm通常是12到40聚體以及40到70℃，優(yōu)選地分別是16到30聚體和55到60℃。引物對的引物可能不等長。然而，優(yōu)選引物的Tm值基本上相等(相差通常在2℃內(nèi))。Tm值是通過最相鄰方法計算得到的值。引物對的實例包括具有SEQ ID NO3和5核苷酸序列的引物。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，考慮到PCR條件，可設(shè)計在特異性區(qū)域中的上述引物對?？赏ㄟ^使用設(shè)計引物的計算機程序設(shè)計引物對。
可根據(jù)常規(guī)PCR方法選擇PCR條件。用于本發(fā)明第一種檢測方法的PCR反應(yīng)混合物組成的一般實例如下。
表1
此外，用于本發(fā)明第一種檢測方法的溫度循環(huán)的一般實例如下，且這種溫度循環(huán)通常重復(fù)25到40次。
(1)在90到98℃變性1到60秒
(2)在60到70℃退火10到60秒
(3)在60到75℃延伸10到180秒
當在一個步驟中進行退火和延伸時，例如，可使用60到70℃持續(xù)10到180秒的條件。
在本發(fā)明的第一種檢測方法中，可根據(jù)檢測擴增產(chǎn)物的常規(guī)方法檢測擴增產(chǎn)物。例如，可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，或者在存在當結(jié)合擴增產(chǎn)物時其熒光發(fā)生改變的底物時測量熒光(例如，結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料，由于結(jié)合等原因其熒光強度發(fā)生改變)。
<2>本發(fā)明的定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的定量方法是一種定量具有線粒體DNA 3243突變的DNA的方法，包括使用從樣品中獲得的DNA作為模板進行定量PCR和定量擴增產(chǎn)物，其特征在于定量PCR是一種使用其中熒光改變?nèi)Q于擴增產(chǎn)物量的系統(tǒng)，通過測量熒光實時定量PCR中的擴增產(chǎn)物以及在測量結(jié)果的基礎(chǔ)上定量樣品中DNA的方法，用于定量PCR的引物包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
樣品DNA和引物的制備為如上述關(guān)于本發(fā)明檢測方法中那樣解釋的。
可根據(jù)已知的方法進行定量PCR，其中通過使用熒光變化取決于擴增產(chǎn)物量的系統(tǒng)并且測量熒光來實時定量PCR的擴增產(chǎn)物，以及在結(jié)果的基礎(chǔ)上定量樣品中的DNA。這種方法的實例包括使用與擴增產(chǎn)物雜交的熒光-標記探針的方法、使用特異性結(jié)合雙鏈DNA的試劑的方法等。
熒光-標記探針的實例包括在5’端與熒光染料結(jié)合并且在3’端與吸收熒光染料所發(fā)射能量的淬滅底物結(jié)合的探針(例如，TaqMan探針)、其末端用雜交后熒光減少的熒光染料標記的核酸探針(例如，見日本專利申請公開No.2002-119291)等。
作為實例，下面通過參考其末端用雜交后熒光減少的熒光染料標記的核酸探針(淬滅探針)，將解釋可在本發(fā)明中使用的探針。在這個實施方案中，淬滅探針設(shè)計成，當探針與靶核酸雜交時，包括兩個或更多核苷酸對的探針-核酸雜交體應(yīng)當在末端部分中形成至少一對G和C。根據(jù)上述設(shè)計的并且其5’端用熒光染料標記的探針的實例包括具有從SEQ ID NO1核苷酸序列中第212或215位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列或者從SEQ ID NO2核苷酸序列中第222位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列的那些探針。此外，3’端用熒光染料標記的探針的實例包括具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的那些探針。
在本發(fā)明中所使用的淬滅探針可能與在日本專利申請公開No.2002-119291中所描述的淬滅探針相同，只是除了其應(yīng)當具有上述這類核苷酸序列外。在本發(fā)明中所使用的淬滅探針的核苷酸序列的實例包括SEQ ID NOS6到10的序列。作為熒光染料，可使用在日本專利申請公開No.2002-119291中所描述的那些熒光染料，且其具體實例包括FAM(商標)、TAMRA(商標)、BODIPY(商標)FL等?？筛鶕?jù)常規(guī)方法將熒光染料結(jié)合到寡核苷酸上，例如，通過在日本專利申請公開No.2002-119291中所描述的方法。
除了通過使用特異性引物對擴增線粒體DNA中含有mt3243突變的區(qū)域外，可根據(jù)基于測量熒光染料熒光的實時PCR方法進行本發(fā)明的定量方法。在本發(fā)明的定量方法中，在存在上述探針時進行擴增，且本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所使用的探針可以很容易地調(diào)整擴增反應(yīng)的條件等。
用于本發(fā)明定量方法的PCR反應(yīng)混合物組成的一般實例如下。
表2
此外，溫度循環(huán)的一般實例如下，且這種溫度循環(huán)通常重復(fù)25到40次。
(1)在90到98℃變性1到60秒
(2)在60到70℃退火10到60秒
(3)在60到75℃延伸10到180秒
當在一個步驟中進行退火和延伸時，例如，可能提及60到70℃，持續(xù)10到180秒的條件。
在本發(fā)明的定量方法中，在進行PCR時進行檢測。因此，反應(yīng)完成后不必處理擴增產(chǎn)物。因此，沒有被擴增產(chǎn)物污染的風(fēng)險。此外，在進行PCR時進行檢測，可顯著減少檢測所需時間。此外，因為用與擴增所需的相同裝置進行檢測，所以不必移動容器。因此，方法的自動化也很容易。此外，因為不使用限制性內(nèi)切酶，所以該方法顯示高定量性(quantitativity)。
本方法也高度靈敏，并且甚至能用于檢測1％或更低的異胞質(zhì)基因比率。因此，通過用上述定量方法定量具有mt3243突變的DNA并且定量總線粒體DNAs，可在那些定量結(jié)果的基礎(chǔ)上獲得mt3243突變的異胞質(zhì)基因比率。也就是說，本發(fā)明提供一種測定mt3243突變異胞質(zhì)基因比率的方法。本發(fā)明測定方法的特征是包括(a)通過本發(fā)明的定量方法定量具有線粒體DNA 3243突變的DNA，(b)通過定量線粒體DNAs的方法定量線粒體DNAs，所述方法包括使用從樣品獲得的DNA作為模板進行定量PCR和定量擴增產(chǎn)物，其中定量PCR使用熒光變化取決于擴增產(chǎn)物量的系統(tǒng)，通過測量熒光實時定量PCR擴增產(chǎn)物，和根據(jù)測量的結(jié)果定量樣品中的DNAs，以及(c)從(a)和(b)的結(jié)果中計算線粒體DNA 3243突變的異胞質(zhì)基因比率。
除了將引物設(shè)計成不管存在或不存在mt3243突變都能擴增線粒體DNAs外，可以以與步驟(a)中相同的方式進行步驟(b)。
可以以與設(shè)計常規(guī)PCR引物對的方法相同的方式設(shè)計用于步驟(b)中PCR所使用的引物對。引物的長度和Tm通常是12到40聚體和40到70℃，優(yōu)選分別是16到30聚體和55到60℃。引物對的引物可能不等長。然而，優(yōu)選引物的Tm值基本上相等(相差通常在2℃內(nèi))。Tm值是通過最相鄰方法計算得到的值。在步驟(b)中使用的引物對優(yōu)選絕大部分與在步驟(a)中所使用的引物對重疊。通過設(shè)計上述引物對，可減少引物對之間的差異對擴增效率的影響，并且可獲得正確的異胞質(zhì)基因比率。引物對的實例包括具有SEQ ID NOS3和4核苷酸序列的引物對。
因為可在步驟(a)中獲得突變型線粒體DNAs的定量值，以及可在步驟(b)中獲得總線粒體DNAs的定量值，所以可通過將(a)的定量值除以(b)的定量值獲得異胞質(zhì)基因比率。因為在步驟(c)中使用步驟(a)和(b)的定量結(jié)果，所以可同時進行步驟(a)和(b)，或者可首先進行它們之中的任何一個步驟。
<3>本發(fā)明的檢測試劑盒
本發(fā)明的檢測試劑盒是一種用于本發(fā)明第一種檢測方法的試劑盒。該試劑盒的特征是包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
引物是如在上述關(guān)于本發(fā)明檢測方法中所解釋的。
在本發(fā)明的試劑盒中，引物可作為混合物提供或者分開地包括在其中。
本發(fā)明的檢測試劑盒除了引物外可進一步包括PCR和/或檢測擴增產(chǎn)物必需的試劑。
<4>本發(fā)明的定量試劑盒
本發(fā)明的定量試劑盒是一種用于本發(fā)明定量方法的試劑盒。該試劑盒的特征是包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
本發(fā)明的定量試劑盒優(yōu)選地包括其5’端用熒光染料標記的核酸探針(淬滅探針)，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，其中核酸探針具有從SEQ ID NO1核苷酸序列中第212位或215位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列，或者具有從SEQ ID NO2核苷酸序列中第222位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列。
引物和淬滅探針是如上述關(guān)于本發(fā)明定量方法中所解釋的。
本發(fā)明的定量試劑盒除了淬滅探針外可進一步包括本發(fā)明定量方法中PCR所必需的試劑。當使用本發(fā)明的定量試劑盒測量異胞質(zhì)基因比率時，在步驟(b)中所使用的本發(fā)明定量試劑盒中的引物對優(yōu)選絕大部分與在步驟(a)中所使用的引物對重疊。
在本發(fā)明的定量試劑盒中，可分別包括淬滅探針、引物和其它試劑，或者可作為混合物提供其一部分。
<5>本發(fā)明的探針和本發(fā)明的第二種檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的探針是其末端用熒光染料標記的核酸探針，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，其中探針具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且探針的3’端用熒光染料標記。
本發(fā)明的探針可類似于在日本專利申請公開No.2002-119291中所描述的淬滅探針，只是除了其具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列(在mt 3243突變中具有突變型核苷酸的序列)中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在本發(fā)明中所使用的淬滅探針的核苷酸序列的實例包括SEQ ID NOS21和22的核苷酸序列。作為熒光染料，可使用在日本專利申請公開No.2002-119291中所描述的那些熒光染料，其具體實例包括FAM(商標)、TAMRA(商標)、BODIPY(商標)FL等。可以以普通方式將熒光染料結(jié)合到寡核苷酸上，例如，通過在日本專利申請公開No.2002-119291中所描述的方法。
本發(fā)明的第二種檢測方法是一種檢測突變的方法，其通過使用用熒光染料標記的核酸探針對具有單核苷酸多態(tài)性位點的核酸進行解鏈曲線分析和測量熒光染料的熒光，以及在解鏈曲線分析結(jié)果的基礎(chǔ)上檢測突變來實現(xiàn)，且其特征是單核苷酸多態(tài)性是3243突變，且核酸探針是本發(fā)明的探針。
除了擴增含有mt3243突變的區(qū)域和使用本發(fā)明的探針外，可根據(jù)核酸擴增和解鏈曲線分析(Tm分析)的常規(guī)方法進行本發(fā)明的第二種檢測方法。
作為核酸擴增的方法，優(yōu)選使用聚合酶的方法，其實例包括PCR、ICAN、LAMP等。當通過使用聚合酶的方法進行擴增時，優(yōu)選在存在本發(fā)明的探針時進行擴增。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所使用的探針很容易地調(diào)整擴增的反應(yīng)條件和其它條件。在這種方法中，核酸擴增后只分析探針的Tm，因而反應(yīng)完成后不必處理擴增產(chǎn)物。因此，沒有被擴增產(chǎn)物污染的風(fēng)險。此外，因為用與擴增所需的相同裝置進行檢測，所以甚至不必移動容器。因此，方法的自動化也很容易。
作為例子，下面通過參考使用PCR的情況，將進一步解釋該方法。可以以與設(shè)計常規(guī)PCR中引物對方法相同的方式設(shè)計用于PCR的引物對，只是除了將其設(shè)計成應(yīng)當擴增出能與本發(fā)明探針雜交的區(qū)域。引物的長度和Tm通常是12到40聚體和40到70℃，優(yōu)選分別是16到30聚體和55到60℃。引物對的引物可能不等長。然而，優(yōu)選引物的Tm值基本上相等(相差通常在2℃內(nèi))。Tm值是通過最相鄰方法計算得到的值。引物對的實例包括具有SEQ ID NO2和3核苷酸序列的引物的引物對。
優(yōu)選在存在本發(fā)明探針時進行PCR。這使得不用在擴增反應(yīng)完成后進行任何處理擴增產(chǎn)物的操作就能夠進行Tm分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所使用的探針很容易地調(diào)整引物的Tm值和PCR的反應(yīng)條件。
PCR反應(yīng)混合物組成的一般實例如下。
表3
此外，溫度循環(huán)的一般實例如下，且該溫度循環(huán)通常重復(fù)25到40次。
(1)在90到98℃變性1到60秒
(2)在60到70℃退火10到60秒
(3)在60到75℃延伸10到180秒
當在一個步驟中進行退火和延伸時，例如，可提及60到70℃，持續(xù)10到180秒的條件。
除了測量結(jié)合本發(fā)明探針的熒光染料的熒光外，可以以常規(guī)方式進行Tm分析?？赏ㄟ^使用具有適于熒光染料的波長的激發(fā)光并且測量發(fā)射波長的光強度來測量熒光。在Tm分析中溫度增加速率通常是每秒鐘0.1到1℃。用于Tm分析的反應(yīng)混合物的組成沒有特別限制，只要具有與探針核苷酸序列互補序列的探針和核酸可相互雜交即可。然而，單價陽離子濃度通常是1.5到5mM，且pH通常是7到9。因為使用DNA聚合酶的擴增方法如PCR的反應(yīng)混合物通常滿足這些條件，所以擴增后反應(yīng)混合物可用于Tm分析。
可在Tm分析結(jié)果的基礎(chǔ)上以普通方式檢測mt3243突變。在本發(fā)明的第二種檢測方法中的檢測不僅包括檢測存在或不存在突變，而且包括定量突變型DNA和測定野生型DNA和突變型DNA的比率。
<6>本發(fā)明的試劑盒
本發(fā)明的試劑盒是一種用于本發(fā)明第二種檢測方法的試劑盒。該試劑盒的特征是包括其末端用熒光染料標記并且雜交后熒光染料的熒光減少的核酸探針(淬滅探針)，其中探針具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且探針的3’端用熒光染料標記。
淬滅探針是如上述關(guān)于本發(fā)明的探針所解釋的。
本發(fā)明的試劑盒除了淬滅探針外，可包括在本發(fā)明第二種檢測方法中核酸擴增所必需的試劑，特別是，用于使用DNA聚合酶擴增的引物。
在本發(fā)明的試劑盒中，可分別包括淬滅探針、引物和其它試劑，或者可作為混合物提供其一部分。
實施例
通過參考下列實施例將更具體地解釋本發(fā)明。
實施例1
根據(jù)含有人線粒體3243 A→G突變(mt3243突變)位點的核苷酸序列(SEQ ID NO2，第243位核苷酸對應(yīng)于線粒體基因中的第3243位置)，設(shè)計表4中所示的引物，以便能擴增含有mt3243突變的區(qū)域。在表4中，SEQ ID NO2的核苷酸序列中用核苷酸數(shù)字標出了位置。
表4
引物
然后，設(shè)計表5中所示末端具有C的探針。在表5中，在SEQ IDNO1或2的核苷酸序列中用核苷酸數(shù)字標出了位置。此外，核苷酸序列中的大寫字母代表mt3243突變的位置，且3’端的(P)意思是磷酸化的。用BODIPY(商標)FL以常規(guī)方式標記探針。
表5
探針
通過使用整合了mt3243突變周圍區(qū)域的質(zhì)粒作為樣品和iCycler(Bio-Rad)，在下面所示的條件下進行實時PCR。在實時分析中激發(fā)波長和檢測波長分別是490nm和530nm。
表6
反應(yīng)混合物的組成
1.用于定量正常序列和突變型序列的系統(tǒng)(用于定量總線粒體DNA數(shù)目的系統(tǒng))
2.定量突變型序列的系統(tǒng)(定量具有突變的線粒體DNAs數(shù)目的系統(tǒng))
表7
制備含有具有各種拷貝數(shù)的正常型序列的質(zhì)粒的樣品作為樣品，并在上述系統(tǒng)1中通過使用探針5FL-3-30作為探針進行定量。結(jié)果顯示于圖1中。正如從圖中所示結(jié)果看到的，其進一步證實定量是可行的。
制備含有具有各種拷貝數(shù)的突變型序列的質(zhì)粒的樣品作為樣品，并在上述系統(tǒng)2中通過使用探針5FL-3-30作為探針進行定量。結(jié)果顯示于圖2中。正如從圖中所示結(jié)果看到的，其進一步證實定量是可行的。
制備含有各種比率的具有突變型序列的質(zhì)粒和具有正常型序列的質(zhì)粒的樣品混合物作為樣品，并在上述系統(tǒng)2中通過使用探針5FL-3-30作為探針進行定量。結(jié)果顯示于圖3中。當通過使用上述系統(tǒng)1定量相同的樣品時，計算突變型序列的比率，獲得與制備樣品時的比率一致的結(jié)果。
當探針5FL-1-24、5FL-1-26、5FL-1-28和5FL-mut-5-23用作探針時，也獲得類似的結(jié)果。
在圖1到3中，垂直軸代表與反應(yīng)開始時強度有關(guān)的熒光強度，其被認為是100％，且水平軸代表PCR循環(huán)數(shù)。
實施例2
在含有人線粒體3243A→G突變(mt3243突變)位點的核苷酸序列(SEQ ID NO2，第243位核苷酸對應(yīng)于線粒體基因中第3243位)的基礎(chǔ)上設(shè)計表8中所示的引物，以便可擴增含有mt3243突變的區(qū)域。在表8中，在SEQ ID NO1的核苷酸序列中用核苷酸數(shù)字標出了位置。
表8
引物
然后，設(shè)計表9中所示末端具有C的探針。在表9中，在SEQ IDNO1的核苷酸序列中用核苷酸數(shù)字標出位置。此外，核苷酸序列中的大寫字母代表mt 3243突變的位置，且3’端的(P)意思是磷酸化的。用BODIPY(商標)FL或TAMRA(商標)以常規(guī)方式標記探針。
表9
探針
通過使用整合了mt3243突變周圍區(qū)域的質(zhì)粒作為樣品和Smart循環(huán)儀系統(tǒng)(Cephied)，在下面所示條件下進行PCR和Tm分析。在Tm分析中激發(fā)波長和檢測波長分別是450到495nm和505到537nm(BODIPY FL)以及527到555nm和565到605nm(TAMRA)。
表10
反應(yīng)混合物的組成
表11
通過使用每種探針進行PCR和Tm分析。作為結(jié)果，僅當使用探針3T-mt-R2-18、3T-mt-R2-17、3FL-mt-R2-18和3FL-mt-R2-17時，在Tm分析中觀察到可分析的熒光強度的變化。在圖4和5中顯示相對于含有mt 3243突變的核苷酸序列的探針的位置。在圖中所顯示的野生型序列和突變型序列分別對應(yīng)于SEQ ID NOS1和2核苷酸序列中的第214到263位核苷酸。此外，在圖中，F(xiàn)表示熒光染料?；趫D4和5中所示的位置，認為探針是否可用于Tm分析取決于與熒光染料結(jié)合的C的位置，而探針的長度不是那么重要，只要包括多態(tài)性位點即可。
制備各種比率的含有具有突變型序列的質(zhì)粒和含有具有正常型序列的質(zhì)粒的樣品混合物作為樣品，且通過使用探針3FL-mt-R2-17進行定量。結(jié)果顯示于圖6中。無論突變型序列的比率如何，都可區(qū)別性地檢測出突變型序列(突變的)和正常型序列(野生的)。
當使用探針3T-mt-R2-18、3T-mt-R2-17和3FL-mt-R2-18時，也獲得相似的結(jié)果。
在圖6中，垂直軸代表具有反符號(inverted sign)的熒光強度的一次導(dǎo)數(shù)值(-dF/dt)，而水平軸代表溫度(℃)。
工業(yè)應(yīng)用性
根據(jù)本發(fā)明，提供了檢測和定量線粒體DNA 3243突變的方法及其試劑盒。
此外，根據(jù)本發(fā)明，提供了有效檢測mt 3243突變的淬滅探針，并且進一步提供了通過使用所述探針檢測mt 3243突變的方法及其試劑盒。因為在幾十秒內(nèi)完成Tm分析，所以可顯著降低檢測所需時間。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，其中聯(lián)合存在探針時的核酸擴增和Tm分析，在核酸擴增后只分析探針的Tm，因此反應(yīng)完成后不必處理擴增產(chǎn)物。因此，沒有被擴增產(chǎn)物污染的風(fēng)險。此外，因為可用與擴增所需相同的裝置進行檢測，所以甚至不必移動容器。因此，方法的自動化也很容易。
序列表
<110>Arkray，Inc.
<120>檢測或定量測定線粒體DNA 3243變異的方法及其試劑盒
<130>G873-OPC4052
<150>JP 2003-111173
<151>2003-04-16
<150>JP 2003-114382
<151>2003-04-18
<160>22
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>等位基因
<222>243
<400>1
ggacatcccg atggtgcagc cgctattaaa ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac 60
gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct atctaccttc aaattcctcc120
ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc ccgtaaatga180
tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggtttg ttaagatggc240
agagcccggt aatcgcataa aacttaaaac tttacagtca gaggttcaat tcctcttctt300
aacaacatac ccatggccaa cctcctactc ctcattgtac ccattctaat cgcaatggca360
ttcctaatgc ttaccgaacg aaaaattcta ggctatatac aactacgcaa aggccccaac420
gtggtaggcc cctacgggct actacaaccc ttcgctgacg ccataaaact cttcaccaaa480
gagcccctaa aacccgccac500
<210>2
<211>500
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>等位基因
<222>243
<400>2
ggacatcccg atggtgcagc cgctattaaa ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac 60
gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct atctaccttc aaattcctcc120
ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc ccgtaaatga180
tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggtttg ttaagatggc240
agggcccggt aatcgcataa aacttaaaac tttacagtca gaggttcaat tcctcttctt300
aacaacatac ccatggccaa cctcctactc ctcattgtac ccattctaat cgcaatggca360
ttcctaatgc ttaccgaacg aaaaattcta ggctatatac aactacgcaa aggccccaac420
gtggtaggcc cctacgggct actacaaccc ttcgctgacg ccataaaact cttcaccaaa480
gagcccctaa aacccgccac500
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
ctcaacttag tattataccc acac24
<210>4
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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ttttatgcga ttaccgggc 19
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
atgcgattac cgggcc 16
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>6
cagggtttgt taagatggca ggg 23
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>7
ccaagaacag ggtttgttaa gatg24
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>8
ccaagaacag ggtttgttaa gatggc 26
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>探針
<400>9
ccaagaacag ggtttgttaa gatggcag28
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
catctcaact tagtattata cccacac 27
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
agaggaattg aacctctgac tg 22
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>13
tttgttaaga tggcagggcc 20
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>14
tttgttaaga tggcagggcc c 21
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>15
gcgattaccg ggccctgcca tc 22
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>16
ccgggccctg ccatcttaac 20
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>17
ttaagatggc agggccc17
<210>18
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>18
ttaagatggc agggcc 16
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>19
gattaccggg ccctgccatc 20
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>20
gcagggcccg gtaatc 16
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>21
gggccctgcc atcttaac 18
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>22
ggccctgcca tcttaac1權(quán)利要求
1.一種檢測具有線粒體DNA 3243突變的DNA的方法，其包括使用從樣品中獲得的DNA作為模板進行PCR以及檢測擴增產(chǎn)物，其中用于PCR的引物包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用于PCR的引物包括具有SEQ IDNO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
3.一種定量具有線粒體DNA 3243突變的DNA的方法，其包括使用從樣品中獲得的DNA作為模板進行定量PCR以及定量擴增產(chǎn)物，其中定量PCR是一種使用熒光變化取決于擴增產(chǎn)物量的系統(tǒng)，通過測量熒光實時定量PCR中的擴增產(chǎn)物，并且在測量結(jié)果的基礎(chǔ)上定量樣品中DNA的方法，且用于定量PCR的引物包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中用于定量PCR的引物包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
5.一種測定樣品中所含線粒體DNA3243突變的異胞質(zhì)基因比率的方法，其包括
(a)通過如在權(quán)利要求3或4中所定義的方法定量具有線粒體DNA3243突變的DNA，
(b)通過定量線粒體DNAs的方法定量線粒體DNAs，所述方法包括使用從樣品獲得的DNA作為模板進行定量PCR以及定量擴增產(chǎn)物，其中定量PCR使用熒光變化取決于擴增產(chǎn)物量的系統(tǒng)，通過測量熒光實時定量PCR中的擴增產(chǎn)物，以及在測量結(jié)果的基礎(chǔ)上定量樣品中的DNAs，和
(c)從(a)和(b)的結(jié)果中計算線粒體DNA 3243突變的異胞質(zhì)基因比率。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中在步驟(b)中使用的引物包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO4核苷酸序列的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3到6中任何一項的方法，其中該系統(tǒng)包括其5’端用熒光染料標記的核酸探針，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，其中核酸探針具有從SEQ ID NO1核苷酸序列中第212或215位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列或者從SEQ ID NO2核苷酸序列中第222位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列，以及測量熒光染料的熒光。
8.用于如在權(quán)利要求1中所定義方法的試劑盒，其包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
10.用于如在權(quán)利要求3中所定義方法的試劑盒，其包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑盒，其包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
12.用于如在權(quán)利要求5中所定義方法的試劑盒，其包括第一引物對，所述第一引物對包括具有與從SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸開始并且長12到30個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物，以及用于定量線粒體DNAs的第二引物對。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述第一引物對包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述第二引物對包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO4核苷酸序列的引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任何一項的試劑盒，其進一步包括其5’端用熒光染料標記的核酸探針，其中雜交后熒光染料的熒光減少，并且其具有從SEQ ID NO1核苷酸序列中第212位或215位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列或者具有從SEQ IDNO2核苷酸序列中第222位核苷酸開始并且長15到40個核苷酸的核苷酸序列。
16.末端用熒光染料標記的核酸探針，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，其中核酸探針具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且探針的3’端用熒光染料標記。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的核酸探針，其中所述核酸探針具有SEQ IDNO21或22的核苷酸序列。
18.一種檢測突變的方法，其包括通過使用熒光染料標記的核酸探針對具有單核苷酸多態(tài)性位點的核酸進行解鏈曲線分析和測量熒光染料的熒光，以及在解鏈曲線分析結(jié)果的基礎(chǔ)上檢測突變，其中單核苷酸多態(tài)性是在線粒體DNA中第3243位上的突變，且核酸探針是如在權(quán)利要求16或17中所定義的核酸探針。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中擴增樣品中所含核酸中含有單核苷酸多態(tài)性位點的區(qū)域以獲得顯示單核苷酸多態(tài)性的核酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述擴增是通過使用DNA聚合酶的方法進行的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述擴增是在存在核酸探針時進行的。
22.用于如在權(quán)利要求18中所定義方法的試劑盒，其包括其末端用熒光染料標記的核酸探針，且其中雜交后熒光染料的熒光減少，其中核酸探針具有與從SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸開始并且長14到40個核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且探針的3’端用熒光染料標記。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的試劑盒，其中所述核酸探針具有SEQ IDNO21或22的核苷酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的試劑盒，其進一步包括通過使用DNA聚合酶的方法用于擴增線粒體DNA中含有第3243位突變的區(qū)域的引物。
全文摘要
一種使用定量測定PCR檢測具有線粒體DNA3243變異的DNA的方法，所述PCR使用具有與從SEQ ID NO1堿基序列中第243位堿基開始并且長12到30個堿基的堿基序列互補的堿基序列的引物。此外，提供了一種檢測具有線粒體DNA 3243變異的DNA的方法，其中使用末端用熒光染料標記的核酸探針，其中雜交后熒光染料的熒光減少，所述核酸探針具有與從SEQ ID NO2堿基序列中第230位堿基開始并且長14到40個堿基的堿基序列互補的堿基序列，且所述核酸探針的3’端用熒光染料標記。
文檔編號C12N15/09GK1806052SQ20048001664
公開日2006年7月19日 申請日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月16日
發(fā)明者平井光春 申請人:愛科來株式會社