專利名稱：多元基因探針檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，更詳細(xì)的是一種非PCR擴(kuò)增的多元基因探針檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法及其裝置。
背景技術(shù)：
目前，基因檢測(cè)的方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析；熒光能量傳遞技術(shù)(Taqman探針技術(shù)，LightCycler探針技術(shù)，Amplisensor探針技術(shù)，復(fù)合探針技術(shù))；分子燈塔技術(shù)；基因探針技術(shù)等。但是，這些技術(shù)都存在各自的不足有假陽(yáng)性，靈敏度低，放射性元素，檢測(cè)時(shí)有熒光背景，操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種檢測(cè)靈敏度高、安全、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的非PCR擴(kuò)增的多元基因探針檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因物種、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因糧食和轉(zhuǎn)基因食品，待測(cè)樣品可以在儀器中進(jìn)行探針雜交反應(yīng)，然后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
本發(fā)明的目的還在于提供實(shí)現(xiàn)所述方法使用的非PCR擴(kuò)增的多元基因探針檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的裝置。
本發(fā)明非PCR擴(kuò)增的多元基因探針檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法包括以下步驟(1)提取待測(cè)樣品DNA；(2)用FOK I和BsrD I兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)樣品DNA進(jìn)行酶切；(3)用DNA凝膠回收試劑盒將酶切片純化回收169bp的DNA片段；
(4)用一條標(biāo)記有生物素和三條標(biāo)記有三連吡啶釕的寡核苷酸探針與純化DNA片段進(jìn)行雜交；非轉(zhuǎn)基因樣品DNA里面不含有169bp特異性序列，不能與探針雜交。
(5)雜交反應(yīng)后的樣品用鏈霉親和素包被的磁珠在緩沖液中進(jìn)行連接、清洗、收集并轉(zhuǎn)入檢測(cè)樣品池中；(6)在檢測(cè)樣品池中加入三丙胺，給定電壓，三連吡啶釕復(fù)合物與三丙胺發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；(7)通過(guò)光纖接收檢測(cè)樣品池中發(fā)出的光信號(hào)，通過(guò)單光子計(jì)數(shù)模塊放大并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)計(jì)數(shù)卡進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并導(dǎo)入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理；(8)計(jì)算機(jī)根據(jù)采集的數(shù)據(jù)對(duì)待測(cè)序列進(jìn)行定量分析。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)所述方法使用的非PCR擴(kuò)增的多元基因探針檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的裝置包括雜交樣品池、定時(shí)器、檢測(cè)樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)構(gòu)成，其中檢測(cè)樣品池內(nèi)安裝有進(jìn)樣管、工作電極、對(duì)電極、參比電極、出樣管；雜交樣品池、檢測(cè)樣品池、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)依次相連；定時(shí)器與雜交樣品池相連；檢測(cè)樣品池與恒電位儀相連。
檢測(cè)樣品池可以用清洗液反復(fù)清洗。所述的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件，如微軟公司的Excel軟件。所述的光電倍增管，如PerkinElmer公司研制的光電倍增管系列，所述的計(jì)數(shù)卡，如臺(tái)灣研華公司(Advantech)的PCL-836計(jì)數(shù)卡。
本發(fā)明的基本原理為根據(jù)絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物種都采用了CaMV35S啟動(dòng)子，針對(duì)其設(shè)計(jì)四條寡核苷酸探針進(jìn)行檢測(cè)(其中一條標(biāo)記生物素，其余三條標(biāo)記三連吡啶釕)。提取轉(zhuǎn)基因物種基因組DNA，經(jīng)過(guò)Fok I和BsrD I兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切并回收169bp目的片斷，加入四種探針與目的片斷雜交，生物素可以與包被有鏈霉親和素的磁珠結(jié)合，進(jìn)一步被磁極選擇性吸附，從而起到篩選目標(biāo)序列的作用。最終使只有同時(shí)雜交上三連吡啶釕和生物素的目標(biāo)序列才能被收集到檢測(cè)樣品池中并檢測(cè)到發(fā)光信號(hào)。在電場(chǎng)的作用下，三連吡啶釕復(fù)合物與三丙胺在陽(yáng)極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并放出一個(gè)光子。經(jīng)過(guò)光纖收集到光電倍增管中，然后將其轉(zhuǎn)化電信號(hào)，經(jīng)過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器，電信號(hào)被轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，被計(jì)算機(jī)采集處理。通過(guò)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)區(qū)別目標(biāo)序列進(jìn)行定量。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)電化學(xué)發(fā)光探針雜交儀可以對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。
(2)三條連有三連吡啶釕的探針與待測(cè)樣品進(jìn)行雜交，不僅可以提高檢測(cè)的靈敏度，而且可以提高檢測(cè)的特異性。
(3)電化學(xué)發(fā)光探針雜交儀檢測(cè)靈敏度很高，并且可以有效的去除PCR中假陽(yáng)性結(jié)果對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。
(4)非PCR檢測(cè)待測(cè)樣品，可以排除PCR操作的復(fù)雜性。
(5)電化學(xué)發(fā)光探針雜交儀操作方便，安全，沒(méi)有同位素等有害物質(zhì)的使用。
(6)電化學(xué)發(fā)光探針雜交技術(shù)發(fā)光原理為電致發(fā)光，可以避免熒光PCR技術(shù)中熒光背景對(duì)結(jié)果的影響。


圖1是本發(fā)明裝置結(jié)構(gòu)框圖；圖2是圖1的裝置的靈敏度測(cè)試圖；圖3是實(shí)施例1用本發(fā)明裝置檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中CaMV35S啟動(dòng)子發(fā)光信號(hào)對(duì)比圖；(樣品1為TE緩沖液+三丙胺(本底)，樣品2為非轉(zhuǎn)基因煙草(花葉青)，樣品3為轉(zhuǎn)基因煙草(K306-2)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
圖1給出了本發(fā)明基因檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光PCR儀的具體結(jié)構(gòu)示意圖。由圖一可知本裝置包括雜交樣品池、定時(shí)器、檢測(cè)樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)構(gòu)成，其中檢測(cè)樣品池內(nèi)安裝有進(jìn)樣管、工作電極、對(duì)電極、參比電極、出樣管。雜交樣品池、檢測(cè)樣品池、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)依次相連；定時(shí)器與雜交樣品池相連；檢測(cè)樣品池與恒電位儀相連。選用各構(gòu)件組成本裝置，其中所述的光電倍增管，如PerkinElmer公司研制的光電倍增管系列。所述的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集軟件，如National Instruments公司開發(fā)的LabVIEW軟件。
如圖2所示，本發(fā)明裝置可以檢測(cè)到0.1pmol的標(biāo)記樣品，并在樣品含量0.1pmol至256pmol之間有很好的線性度。說(shuō)明該儀器具有很高的靈敏度，而且可以進(jìn)行定量的檢測(cè)。
實(shí)施例1將上述裝置應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因煙草的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中都含有CaMV35S啟動(dòng)子。
(1)提取非轉(zhuǎn)基因煙草(花葉青)，轉(zhuǎn)基因煙草DNA(K306-2)，轉(zhuǎn)基因煙草(K306-13)，轉(zhuǎn)基因煙草(G28-1)。
(2)在雜交樣品池中加入煙草DNA，F(xiàn)ok I酶切反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)。
(3)用-20℃的無(wú)水乙醇沉淀DNA。
(4)在DNA中再加入BsrD I酶切反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)。
(5)使用DNA凝膠回收試劑盒，回收169bp片斷大小的DNA。
(6)在回收的DNA樣品中加入三條分別標(biāo)記有三連吡啶釕和一條標(biāo)記有生物素的寡核苷酸探針，控制溫度95℃，5分鐘，然后降溫至55℃，30分鐘，使樣品和探針進(jìn)行雜交反應(yīng)；(7)雜交反應(yīng)后的樣品用鏈霉親和素包被的磁珠在緩沖液中進(jìn)行連接、清洗、收集并轉(zhuǎn)入檢測(cè)樣品池中；(8)在檢測(cè)樣品池中加入三丙胺，給定電壓1.25V，使三連吡啶釕復(fù)合物與三丙胺發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；(9)通過(guò)光纖接收檢測(cè)樣品池中發(fā)出的光信號(hào)，通過(guò)單光子計(jì)數(shù)模塊放大并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)計(jì)數(shù)卡進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并導(dǎo)入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理；(10)使用計(jì)算機(jī)根據(jù)采集的數(shù)據(jù)對(duì)待測(cè)序列進(jìn)行定量分析。
如圖3所示，是本例中用圖1裝置檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中CaMV35S啟動(dòng)子發(fā)光信號(hào)對(duì)比圖。樣品1為TE緩沖液+三丙胺(本底)，樣品2為非轉(zhuǎn)基因煙草(花葉青)，樣品3為轉(zhuǎn)基因煙草(K306-2)，樣品4為轉(zhuǎn)基因煙草(K306-13)，樣品5為轉(zhuǎn)基因煙草(G28-1)，由圖可知本底與非轉(zhuǎn)基因煙草的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)值低于閾值，而三種轉(zhuǎn)基因煙草電化學(xué)發(fā)光信號(hào)可以達(dá)到500左右。結(jié)果信號(hào)很明顯，信噪比很高，可以準(zhǔn)確的判斷待測(cè)基因是否存在。
權(quán)利要求
1.一種多元基因探針檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于包括以下步驟(1)提取待測(cè)樣品DNA；(2)用FOK I和BsrD I兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)樣品DNA進(jìn)行酶切；(3)用DNA凝膠回收試劑盒將酶切片純化回收169bp的DNA片段；(4)用一條標(biāo)記有生物素和三條標(biāo)記有三連吡啶釕的寡核苷酸探針與純化DNA片段進(jìn)行雜交；(5)雜交反應(yīng)后的樣品用鏈霉親和素包被的磁珠在緩沖液中進(jìn)行連接、清洗、收集并轉(zhuǎn)入檢測(cè)樣品池中；(6)在檢測(cè)樣品池中加入三丙胺，給定電壓，三連吡啶釕復(fù)合物與三丙胺發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；(7)通過(guò)光纖接收檢測(cè)樣品池中發(fā)出的光信號(hào)，通過(guò)單光子計(jì)數(shù)模塊放大并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)計(jì)數(shù)卡進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并導(dǎo)入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理；(8)計(jì)算機(jī)根據(jù)采集的數(shù)據(jù)對(duì)待測(cè)序列進(jìn)行定量分析。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述方法使用的裝置，其特征在于包括雜交樣品池、定時(shí)器、檢測(cè)樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)構(gòu)成，其中檢測(cè)樣品池內(nèi)安裝有進(jìn)樣管、工作電極、對(duì)電極、參比電極、出樣管；雜交樣品池、檢測(cè)樣品池、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)依次相連；定時(shí)器與雜交樣品池相連；檢測(cè)樣品池與恒電位儀相連。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種非PCR擴(kuò)增的多元基因探針檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法及裝置，所述裝置包括雜交樣品池、定時(shí)器、檢測(cè)樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)，檢測(cè)樣品池內(nèi)安裝有進(jìn)樣管、工作電極、對(duì)電極、參比電極、出樣管；雜交樣品池、檢測(cè)樣品池、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)依次相連；定時(shí)器與雜交樣品池相連；檢測(cè)樣品池與恒電位儀相連。所述檢測(cè)方法是待測(cè)樣品可以在儀器中用探針雜交篩選，然后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，判斷待測(cè)樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分。本發(fā)明方法和裝置檢測(cè)靈敏度高、安全、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便。該方法可用于轉(zhuǎn)基因物種、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因糧食和轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1661095SQ20041007751
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者邢達(dá), 劉晉峰, 朱德斌 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)