專利名稱：具表面活性劑耐性的新型纖維素酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型的纖維素酶，該纖維素酶具有親本纖維素酶的一部分氨基酸序列被置換了的氨基酸序列，其中所述親本纖維素酶含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
背景技術：
纖維素酶可以利用其特性，應用在各種工業(yè)領域里。具體的應用領域之一是纖維加工領域，特別是為使含纖維素的纖維具有所需特性而進行的處理。也就是說，為了改善含纖維素的纖維的手感和/或外觀，以及為進行“生物洗”而使用纖維素酶，其中所述“生物洗”可對著色的含纖維素的纖維提供色彩局部變化的“石洗”樣外觀。另外，近年來，將來自木材漿的纖維素溶解于有機溶劑進行紡絲而得到再生纖維素系纖維纖維素短纖維(Lyocell)，因其強度、吸水性等性質以及不會引起環(huán)境污染的制造方法而受到人們的關注，在除去其制造工序中產(chǎn)生的織物表面的毛羽的加工中需要采用纖維素酶。
一直以來，人們認識到纖維素酶具有通過多種酶的共同作用來分解纖維素的作用。近年來，由于蛋白質分離技術、基因技術的進步，人們嘗試從作為復合酶的纖維素酶中分離并制備適合上述纖維加工的酶成分。尤其是對來自絲狀菌的木霉菌屬(Trichoderma)或腐殖霉屬(Humicola)纖維素酶的研究得到進展，在腐殖霉屬中分離出CBH I、EG V、NCE4和NCE2等，在木霉菌屬中分離出CBH I、CBH II、EG II和EG III等成分，通過基因操作制備出過量表達的酶、單成分酶等，由此制備出大量含有適合各用途的特定纖維素酶成分的纖維素酶制備物。
在使粗斜棉布對含纖維素的纖維染色成具有石洗外觀、或改善手感方面，已知內切葡聚糖酶NCE5在該處理工序中作為部分靛藍染料再附著或逆染色程度低、即白底染色程度低的纖維素酶有用(參照專利文獻1)。
另一方面，在纖維素酶應用于衣物洗滌劑用途時，人們希望不僅對所需纖維素酶成分進行量的改善，還要進行質的改善。也就是說，衣物洗滌劑中混合有各種表面活性劑，將它們溶解于水時顯示堿性(pH10-11)，因此作為混合在衣物洗滌劑中的纖維素酶的性質，人們需求對各種表面活性劑具有耐性，以及在堿性條件下顯示更強的活性。
(專利文獻1)國際公開第WO 01/90375號(第2-3頁以及序列表的SEQ ID NO.1所示序列)發(fā)明內容本發(fā)明的課題在于提供對表面活性劑具有耐性和/或在堿性條件下具有高活性的新型纖維素酶。
本發(fā)明人為解決上述課題進行了深入的研究，結果在含有SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的纖維素酶(NCE5)中，通過將該氨基酸序列中第162位和/或第166位的氨基酸殘基置換為其它的氨基酸殘基，成功地獲得了對表面活性劑具有耐性和/或在堿性條件下具有高活性的新型纖維素酶。即本發(fā)明如下。
纖維素酶，該纖維素酶具有(1)含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的纖維素酶的第162位和/或第166位的氨基酸殘基被與上述纖維素酶的氨基酸不同的氨基酸置換的氨基酸序列，或者(2)在上述氨基酸序列(1)的N末端附加或缺失1個或多個氨基酸的氨基酸序列。
上述[1]的纖維素酶，該纖維素酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
上述[1]的纖維素酶，其中第166位氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸置換。
上述[3]的纖維素酶，該纖維素酶具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
纖維素酶，該纖維素酶具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
多聚核苷酸，該多聚核苷酸編碼上述[1]-[5]的纖維素酶。
表達載體，該表達載體含有上述[6]的多聚核苷酸。
宿主細胞，該宿主細胞由上述[7]的表達載體轉化。
上述[1]-[5]的纖維素酶的制備方法，該制備方法包括培養(yǎng)上述[8]的宿主細胞，由該宿主和/或培養(yǎng)物收集纖維素酶的步驟。
纖維素酶制備物，該纖維素酶制備物含有上述[1]-[5]的纖維素酶。
洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物含有上述[1]-[5]的纖維素酶或上述[10]的纖維素制備物。
含纖維素的纖維的處理方法，該方法包括使含纖維素的纖維與上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物或上述[11]的洗滌劑組合物接觸的步驟。
降低含纖維素的纖維開始起毛的速度或降低含纖維素的纖維的起毛程度的方法，該方法包括使含纖維素的纖維與上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物或上述[11]的洗滌劑組合物接觸的步驟。
以改善含纖維素的纖維的手感和外觀為目的的減量加工方法，該方法包括使含纖維素的纖維與上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物或上述[11]的洗滌劑組合物接觸的步驟。
使著色的含纖維素的纖維的色彩澄清的方法，該方法包括使著色的含纖維素的纖維與上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物或上述[11]的洗滌劑組合物接觸的步驟。
對著色的含纖維素的纖維提供色彩局部變化的方法，該方法包括使著色的含纖維素的纖維與上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物或上述[11]的洗滌劑組合物接觸的步驟。
降低含纖維素的纖維開始僵硬的速度或降低含纖維素的纖維僵硬程度的方法，該方法包括使含纖維素的纖維與上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物或上述[11]的洗滌劑組合物接觸的步驟。
上述[12]-[17]的方法，其中纖維的處理通過對該纖維進行浸漬、洗滌或漂洗進行。
廢舊紙脫墨的方法，其特征在于在將廢舊紙用脫墨化學試劑處理，進行脫墨的步驟中，使用上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物。
紙漿打漿度的改善方法，該方法包括將紙漿用上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物進行處理的步驟。
改善動物飼料消化率的方法，該方法包括將含纖維素的纖維用上述[1]-[5]的纖維素酶、上述[10]的纖維素酶制備物進行處理的步驟。
本說明書中的術語“多聚核苷酸”包括DNA和RNA。
實施發(fā)明的最佳方案以下詳細說明本發(fā)明。
親本纖維素酶本發(fā)明中，親本纖維素酶是含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的纖維素酶。根據(jù)生產(chǎn)該親本纖維素酶的宿主的種類不同，分泌信號序列的加工也不同，結果，像N末端附加或缺失1-多個氨基酸這樣的同源物也包括在親本纖維素酶中。
本發(fā)明的新型纖維素酶當親本纖維素酶含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列時，本發(fā)明的新型纖維素酶的具體例子有選自該氨基酸序列中第162和166位氨基酸的1個或2個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基置換的纖維素酶。分離自天然菌株等得到的纖維素酶如果也是SEQ ID NO.1所示氨基酸中的第162和166位氨基酸、或與其相當?shù)陌被岜恢脫Q的纖維素酶，則也包含在本發(fā)明的纖維素酶中。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，優(yōu)選的有SEQ ID NO.1記載的氨基酸序列第162位氨基酸被脯氨酸、第166位氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸置換的纖維素酶。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案，更優(yōu)選的有具有SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的纖維素酶。這些纖維素酶具有對表面活性劑具有耐性和/或在堿性條件下保持高活性的優(yōu)良性質。
當親本纖維素酶為SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的同源物時，本發(fā)明的新型纖維素酶的具體的例子有選自相當于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第162和166位氨基酸的位置的氨基酸的1個或2個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基置換的纖維素酶。這里，通過公知的算法進行氨基酸序列比對，可以容易地選擇含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的親本纖維素酶的同源物中要置換的氨基酸殘基的位置。
本發(fā)明的新型纖維素酶的制備本發(fā)明的新型纖維素酶可以通過重組DNA技術、多肽合成技術等制備，除此之外，也可以由從天然物中分離的菌株獲得。
采用重組DNA技術時，可如下制備獲得編碼親本纖維素酶的DNA，在該DNA內使專一性位點發(fā)生突變，置換所編碼的氨基酸，然后用含有實施了誘變處理的DNA的表達載體轉化宿主細胞，通過培養(yǎng)轉化細胞，可制備新型的纖維素酶。編碼親本纖維素酶的DNA的獲得，可以考察所用宿主細胞，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列進行適當?shù)目偤铣桑瑑?yōu)選含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA，這可以通過基因工程領域常用的方法，由孤獨腐殖霉(Humicola insolens)的cDNA文庫獲得。
本領域技術人員所公知的向基因的特定位點引入突變的幾種方法有缺口雙鏈法[Methods in Enzymology，154，350(1987)]、定位誘變(Kunkel)法[Methods in Enzymology，154，367(1987)]等。這些方法可用于在編碼親本纖維素酶的DNA內、在專一性位點產(chǎn)生突變。誘變處理后的DNA核苷酸序列可以通過Maxam-Gilbert的化學修飾法[Methods in Enzymology，65，499(1980)]或雙脫氧核苷酸鏈終止法[Gene，19，269(1982)]等確認，本發(fā)明的纖維素酶的氨基酸序列可由被確認的核苷酸序列解讀。
本發(fā)明的新型纖維素酶的生產(chǎn)本發(fā)明的纖維素酶可如下生產(chǎn)以在可在宿主細胞內復制且該基因可表達的狀態(tài)下含有編碼所述本發(fā)明纖維素酶的DNA片段的DNA分子、特別是表達載體的形式轉化宿主細胞，在該宿主細胞中產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明提供表達載體，該表達載體在可在宿主微生物內復制且編碼上述本發(fā)明的纖維素酶的DNA片段所編碼的蛋白質可以表達的狀態(tài)下含有上述DNA片段。該表達載體是自主復制載體，即作為染色體外的獨立體存在，其復制不依賴于染色體的復制，例如可以以質粒為基礎構建。該表達載體導入宿主微生物時，也可以整合到該宿主微生物的基因組中，與被整合的染色體一起復制。本發(fā)明的載體的構建順序和方法可以采用基因工程領域中常用的方法。
為了使本發(fā)明的表達載體實際導入宿主微生物，并使具有所需活性的蛋白質表達，除上述本發(fā)明的DNA片段之外，本發(fā)明的表達載體最好還包含用于控制其表達的DNA序列或選擇轉化體的基因標志等?？刂票磉_的DNA序列包括啟動子、終止子和編碼信號肽的DNA序列等。啟動子只要在宿主微生物中顯示轉錄活性即可，沒有特別限定，可以是控制編碼與宿主微生物同種或不同種的任意蛋白質的基因的表達的DNA序列。信號肽只要在宿主微生物中作用于蛋白質的分泌即可，并沒有特別限定，可以由從編碼與宿主微生物同種或不同種的任意蛋白質的基因衍生的DNA序列中獲得。本發(fā)明的基因標志可以根據(jù)轉化體的選擇方法適當選擇，例如可以利用編碼化學試劑耐性的基因、與營養(yǎng)缺陷性型互補的基因。
本發(fā)明進一步提供由該表達載體轉化的微生物。該宿主-載體系并沒有特別限定，例如可以采用使用大腸桿菌、放線菌、酵母或絲狀菌等的系統(tǒng)、以及除此以外的蛋白質融合的蛋白質表達系等。另外，由該表達載體進行的微生物的轉化也可以按照本領域常用的方法實施。
還可以用適當?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)該轉化體，由其培養(yǎng)物中分離并獲得上述本發(fā)明的蛋白質。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，還提供上述本發(fā)明的新型蛋白質的制備方法。轉化體的培養(yǎng)及其條件可以與所用微生物的培養(yǎng)及條件實質上相同。培養(yǎng)轉化體后回收目標蛋白質的方法可以采用本領域常用的方法。
本發(fā)明的新型纖維素酶的用途/纖維素酶制備物本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的纖維素酶的纖維素酶制備物。
通常，纖維素酶制備物是指除纖維素酶之外，例如可以含有賦型劑(例如乳糖、氯化鈉或山梨糖醇等)、防腐劑、和/或非離子系表面活性劑等。纖維素酶制備物的形態(tài)可以是固態(tài)也可以是液態(tài)。具體來說，有粉劑、粒劑、顆粒劑、無粉塵顆?；蛞后w制劑。本發(fā)明的纖維素酶制備物中除本發(fā)明的纖維素酶之外，還可以含有其它纖維素酶，例如纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶以及本發(fā)明之外的內切葡聚糖酶。
纖維素酶制備物之一的無粉塵顆粒(優(yōu)選沒有飛散性的顆粒狀)，可以采用通常的干式制粒法制備。即，將粉末狀態(tài)的本發(fā)明纖維素酶與選自中性且不影響內切葡聚糖酶活性的無機鹽(例如硫酸鈉或氯化鈉)、不影響內切葡聚糖酶活性的礦物質(例如皂土或蒙脫石)、以及中性有機物(例如淀粉或顆粒狀纖維素等)等的一種或多種混合，然后加入1種或多種非離子表面活性劑的粉末或細微懸浮的懸浮液，充分混合或混煉。根據(jù)情況，適當添加使固態(tài)物質粘結的合成高分子(例如聚乙二醇等)或天然高分子(例如淀粉等)，進一步混煉后，進行圓盤制丸等的擠壓成型制粒，將成型物通過滾圓機成型為球狀，通過干燥，制成無粉塵顆粒。對1種或多種非離子表面活性劑的添加量沒有特別限定，相對于本發(fā)明的纖維素酶制備物總量，優(yōu)選0.1-50％重量，更優(yōu)選0.1-30％重量，進一步優(yōu)選1-10％重量。將顆粒表面用聚合物等包衣，則可以控制透氧或透水。
另一方面，纖維素酶制備物之一的液體制劑(優(yōu)選穩(wěn)定的液體狀)的制備可以是向含有本發(fā)明的纖維素酶的溶液中混合內切葡聚糖酶的穩(wěn)定劑(例如合成高分子或天然高分子等)，根據(jù)需要添加無機鹽類和/或合成防腐劑。此時，也可以混合1種或多種非離子表面活性劑。對1種或多種非離子表面活性劑的添加量沒有特別限定，相對于本發(fā)明的纖維素酶制備物總量，優(yōu)選0.1-50％重量，更優(yōu)選0.1-30％重量，進一步優(yōu)選1-10％重量。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的纖維素酶或本發(fā)明的纖維素酶制備物的洗滌劑組合物。上述洗滌劑組合物也可以含有表面活性劑(可以是陰離子性、非離子性、陽離子性、兩性或偶極離子或者它們的混合物)。上述洗滌劑組合物也可以含有本領域已知的其它洗滌劑成分，例如助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、抗腐蝕劑、金屬離子封閉劑、污物分解聚合物、香料、其它酶(蛋白酶、脂酶、淀粉酶等)、酶穩(wěn)定劑、制劑輔助劑、熒光增白劑和/或發(fā)泡促進劑等。代表性的陰離子型表面活性劑有直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)、烷基硫酸鹽(AS)、α-烯烴磺酸鹽(AOS)、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽(AES)、α-硫代脂肪酸酯鹽(α-SFMe)以及天然脂肪酸的堿金屬鹽等。非離子型表面活性劑的例子有聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基苯酚聚乙二醇醚、脂肪酸甲酯乙醇鹽、蔗糖和葡萄糖的脂肪酸酯、以及烷基葡糖苷、聚乙氧基化烷基葡糖苷的酯等。
本發(fā)明的含纖維素的纖維的處理方法是通過將本發(fā)明的纖維素酶、本發(fā)明的纖維素酶制備物、或本發(fā)明洗滌劑組合物與含纖維素的纖維接觸而進行。
可通過本發(fā)明的纖維處理方法改善的含纖維素的纖維的性質包括以下。
(1)除去毛羽(降低開始起毛的速度或降低起毛程度)(2)通過減量改善纖維的手感和外觀(3)使著色的含纖維素的纖維的色彩澄清(4)使著色的含纖維素的纖維的色彩發(fā)生局部變化，即，使著色的含纖維素的纖維、典型的是使牛仔布具有石洗外觀和風格(5)柔軟化(降低開始僵硬的速度或降低僵硬程度)
本發(fā)明的纖維處理方法具體來說，是向浸漬或可浸漬纖維的水中添加本發(fā)明的纖維素酶、本發(fā)明的纖維素酶制備物、或本發(fā)明洗滌劑組合物來進行，例如可以通過纖維的浸漬步驟、洗滌步驟、或漂洗步驟進行。
接觸溫度，或者上述纖維素酶、上述纖維素酶制備物、或上述洗滌劑組合物的添加量等條件可以考慮其它各種條件適當確定，例如用于降低含纖維素的纖維開始起毛的速度或降低含纖維素的纖維起毛程度時，優(yōu)選在10-60℃左右的溫度下使用0.01-20mg/L蛋白質濃度的上述纖維素酶、上述纖維素酶制備物、或上述洗滌劑組合物。
進行以改善含纖維素的纖維的手感和外觀為目的的減量加工時，優(yōu)選在10-60℃左右的溫度下使用0.1-50mg/L蛋白質濃度的上述纖維素酶、上述纖維素酶制備物、或上述洗滌劑組合物。
目的在于使著色的含纖維素的纖維的色彩澄清時，優(yōu)選在10-60℃左右的溫度下使用0.01-20mg/L蛋白質濃度的上述纖維素酶、上述纖維素酶制備物、或上述洗滌劑組合物。
為了對著色的含纖維素的纖維的色彩提供局部變化而使用時，優(yōu)選在20-60℃左右的溫度下使用0.1-100mg/L蛋白質濃度的上述纖維素酶、上述纖維素酶制備物、或上述洗滌劑組合物。
上述方法用于降低含纖維素的纖維開始僵硬的速度或降低含纖維素的纖維僵硬程度時，優(yōu)選在10-60℃左右的溫度下使用0.01-20mg/L蛋白質濃度的上述纖維素酶、上述纖維素酶制備物、或上述洗滌劑組合物。
本發(fā)明還涉及廢舊紙的脫墨方法，其特征在于在將廢舊紙用脫墨化學試劑處理，進行脫墨的步驟中，使用本發(fā)明的纖維素酶或本發(fā)明的纖維素酶制備物。
本發(fā)明的纖維素酶或纖維素酶制備物作用于廢舊紙，可以使脫墨的效率提高，因此在由廢舊紙制造再生紙的過程中有用。根據(jù)上述脫墨的方法，殘留有墨的纖維大幅減少，因此可以提高廢舊紙的白度。
上述脫墨化學試劑只要是通常廢舊紙脫墨所使用的化學試劑即可，并沒有特別限定，例如有堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉等)、硅酸鈉、過氧化氫、磷酸鹽、陰離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑、或吸收材料(例如油酸等)等，助劑有pH穩(wěn)定劑、螯合劑或分散劑等。
可適用于上述脫墨方法的廢舊紙只要是通常被稱為廢舊紙的物品即可，并沒有特別限定，例如機械漿和化學漿混合的廢舊報紙、廢舊雜志、低級-中級廢舊印刷紙、含有化學漿的高級廢舊紙、或它們的覆膜紙等印刷廢舊紙。除被稱為廢舊紙的物品以外，只要是附著有墨的紙，都可適用上述脫墨的方法。
本發(fā)明還涉及紙漿打漿度的改善方法，該方法包括將紙漿用本發(fā)明的纖維素酶或本發(fā)明的纖維素酶制備物進行處理的步驟。
根據(jù)上述方法，紙漿的強度不會顯著降低，同時可以顯著改善紙漿的打漿度?？蛇m用上述方法的漿并沒有特別限定，例如有廢舊紙漿、可回收箱紙漿、牛皮紙漿、亞硫酸紙漿或加工熱處理等的高收率紙漿等。
本發(fā)明還涉及改善動物飼料消化率的方法，該方法包括將動物飼料用本發(fā)明的纖維素酶或本發(fā)明的纖維素酶制備物進行處理的步驟。
根據(jù)上述方法，動物飼料中的葡聚糖被適度降解為低分子量，因而可以改善動物飼料的消化率。
通過將本發(fā)明的纖維素酶在動物飼料中使用，可以改善飼料中的葡聚糖的消化率。因此，本發(fā)明還提供改善動物飼料的消化率的方法，該方法包括用本發(fā)明的纖維素酶或纖維素酶制備物處理動物飼料的步驟。
以上，對本發(fā)明的纖維素酶和洗滌劑組合物以及本發(fā)明中使用它們的方法進行了說明。其實，本發(fā)明纖維素酶的親本纖維素酶——纖維素酶NCE5可以作為纖維素制備物或洗滌劑組合物的有效成分使用，通過使用這些纖維素酶NCE5或者含有纖維素酶NCE5的纖維素酶制備物或洗滌劑組合物，例如可以改善含纖維素的纖維的各種性質[例如除去毛羽(降低開始起毛的速度或降低起毛程度)、通過減量改善纖維手感和外觀、使著色的含纖維素的纖維的色彩澄清、使著色的含纖維素的纖維的色彩發(fā)生局部變化、柔軟化(降低開始僵硬的速度或降低僵硬程度)等]、可以進行廢舊紙的脫墨、可以改善紙漿的打漿度、或者可以改善動物飼料的癥可率，這些都在國際公開第WO 01/90375號中有公開。本發(fā)明的纖維素酶與親本纖維素酶NCE5比較，顯示優(yōu)異的表面活性劑耐性和耐堿性，因此作為纖維素酶制備物或洗滌劑組合物的有效成分，或者在使用纖維素酶NCE5實施的上述各種方法中，通過使用本發(fā)明的纖維素酶取代纖維素酶NCE5，有望獲得更優(yōu)異的效果。
微生物保藏用含有編碼本發(fā)明的親本纖維素酶的DNA的質粒pNCE5Bam轉化的大腸桿菌JM109菌株于2000年4月18日，以FERM BP-7138的保藏號保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物保藏中心[(原)工業(yè)技術院生命工業(yè)技術研究所(地址305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)]。
實施例2(2)中使用的孤獨腐殖霉FERM BP-5977菌株于1996年7月15日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物保藏中心，為國內保藏(FERM P-15736)，于1997年6月13日轉為國際保藏。
實施例以下給出本發(fā)明的實施例，這只是舉例，并不限定本發(fā)明，這里未例舉的很多變化的方法或修飾方法全部包括在本發(fā)明中。
實施例1編碼纖維素酶的基因的制備含有SEQ ID NO.1記載的氨基酸序列的親本纖維素酶中第162位氨基酸被脯氨酸置換得到的纖維素酶(以下稱為A162P。SEQ IDNO.3)、第166位氨基酸被谷氨酸置換得到的纖維素酶(以下稱為K166E。SEQ ID NO.4)、第162位和第166位氨基酸分別被脯氨酸和谷氨酸置換得到的纖維素酶(以下稱為APKE。SEQ ID NO.5)，編碼上述纖維素酶的DNA如下制備。
以國際公開第WO 01/90375號中記載的質粒pNCE5Bam為模板DNA，使用LA PCR體外誘變處理試劑盒(LA PCR in vitro Mutagenesiskit)(寶酒造株式會社)，向編碼親本纖維素酶的DNA引入位點專一性突變。方法按照試劑盒所附說明書。引入突變的引物使用以下所示三種引物。
NCE5-A162P5’-GGGGAAGGGGTCGCACTCGTGGCGTTG-3’(SEQ IDNO.6)NCE5-K166E5’-CTTGAGCTCCTCGGGGAAGGCGTCGCA-3’(SEQ IDNO.7)NCE5-APKE5’-GAGCTCCTCGGGGAAGGGGTCGCACTCGTG-3’(SEQ IDNO.8)引物NCE5-A162P是用于制備編碼纖維素酶A162P的DNA的引物，引物NCE5-K166E是用于制備編碼纖維素酶K166E的DNA的引物，引物NCE5-APKE是用于制備編碼纖維素酶APKE的DNA的引物。
將使用上述三種引物得到的引入了突變的PCR產(chǎn)物用限制酶EcoRI和PstI消化，然后用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，進行乙醇沉淀。將它們與預先用限制酶EcoR I和PstI消化的質粒pUC118連接，得到質粒pNCE5AP-118(A162P)、pNCE5KE-118(K166E)和pNCE5APKE-118(APKE)。用熒光DNA測序儀ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer(パ-キン·エルマ-公司制)確定這3種質粒的插入片段的全核苷酸序列，結果表明各DNA片段只引入了目標突變。
實施例2各纖維素酶基因在孤獨腐殖霉中的表達(1)纖維素酶基因表達質粒的構建將實施例1中得到的含有各纖維素酶基因的質粒pNCE5AP-118、pNCE5KE-118和pNCE5APKE-118用限制酶BamH I消化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，回收約0.7kbp的DNA片段。將它們預先用限制酶BamHI消化，與用來自大腸桿菌的堿性磷酸酶(寶酒造)進行DNA末端去磷酸的孤獨腐殖霉FERM BP-5977表達載體pJD-c5(記載于國際公開第WO01/90375號中)連接，得到用于表達各纖維素酶基因的質粒pNCE5AP(A162P)、pNCE5KE(K166E)和pNCE5APKE(APKE)。
(2)孤獨腐殖霉FERM BP-5977的轉化將孤獨腐殖霉FERM BP-5977在(S)培養(yǎng)基中、在37℃培養(yǎng)，24小時后，以3000rpm離心10分鐘，收集細胞。(S)培養(yǎng)基的組成為在(N)培養(yǎng)基(5.0％微晶纖維素、2.0％酵母提取物、0.1％蛋白胨、0.03％氯化鈣、0.03％氯化鎂、pH 6.8)中加入葡萄糖(3.0％)，然后除去微晶纖維素。所得細胞用0.5mol/L蔗糖洗滌，懸浮于用0.45μm濾器過濾的10mL原生質體化酶溶液(3mg/mL-葡糖醛酸糖苷酶、1mg/mL殼多糖酶、1mg/mL消解酶、0.5mol/L蔗糖)中。在30℃振蕩60-90分鐘，使菌絲原生質體化。過濾該懸浮液，然后以2500rpm離心10分鐘，回收原生質體，用SUTC緩沖液
洗滌。
將以上制備的原生質體懸浮于1mL SUTC緩沖液中，每100μL中加入10μg的DNA(TE)溶液(10μL)，在冰中靜置5分鐘。接著，加入400μL PEG溶液[60％PEG4000、10mmol/L氯化鈣、10mmol/LTris鹽酸(pH 7.5)]，在冰中靜置20分鐘，然后加入10mL SUTC緩沖液，以2500rpm離心10分鐘。將收集的原生質體懸浮于1mL SUTC緩沖液中，然后以4000rpm離心5分鐘，最終懸浮于100μL SUTC緩沖液中。
在添加了潮霉素(200μg/mL)的YMG培養(yǎng)基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取物、0.2％麥芽提取物、1％瓊脂(pH 6.8))上，將進行了以上處理的原生質體與YMG軟瓊脂一起鋪板，在37℃培養(yǎng)5天，將形成的集落作為轉化體。
(3)通過SDS-PAGE評價轉化體如上所述，將使用質粒pNCE5AP、pNCE5KE和pNCE5APKE得到的孤獨腐殖霉轉化體在(N)培養(yǎng)基(5.0％微晶纖維素、2.0％酵母提取物、0.1％蛋白胨、0.03％氯化鈣、0.03％氯化鎂、pH 6.8)中、在37℃培養(yǎng)5小時，通過SDS-PAGE對所得培養(yǎng)上清進行分析。
SDS-PAGE采用テフコ公司的系統(tǒng)進行。即，使用電泳槽(No.03-101)、電源(型號3540)、凝膠12％(01-005)以及SDS-PAGE緩沖液試劑盒(06-0301)。電泳條件為18mA/90分鐘。電泳后的凝膠染色使用考馬斯亮藍-R250染色液(0.1％考馬斯亮藍-R250、40％甲醇、10％乙酸)進行，之后用脫色液(10％甲醇、7.5％乙酸)脫色，檢測蛋白質。分子量標志采用アマシヤムバイオサイエンス公司的LMW標志試劑盒(LMW Marker Kit)(17-0446-01)。
SDS-PAGE分析的結果，發(fā)現(xiàn)了25Kda蛋白質得到增強的轉化體，并確認這些轉化體生產(chǎn)目標纖維素酶。從這些轉化體中分別選擇了K215-40菌株、K215-42菌株和K229-72菌株作為生產(chǎn)纖維素酶A162P、K166E和APKE的轉化體，并用于以后的分析。另外以國際公開第WO 01/90375號中記載的NCE5(親本纖維素酶)作為分析對照使用。
實施例3對由各轉化體得到的纖維素酶的評價將孤獨腐殖霉轉化體K215-40菌株、K215-42菌株和K229-72菌株在(N)培養(yǎng)基、37℃培養(yǎng)5天，使用所得培養(yǎng)上清在(1)pH 6.0、(2)pH 6.0且添加200ppm直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)、(3)pH 10.0三個試驗區(qū)進行EGU活性測定。
EGU活性如下測定。將羧甲基纖維素(Hercules)溶解于適當?shù)木彌_液中，使終濃度為3.5％，以此作為底物溶液。即，在pH 6.0下測定時，溶解于0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0)；在pH 10.0下測定時，溶解于0.1mol/L Tris鹽酸緩沖液(pH 10.0)。取5mL底物溶液裝入試管，放進40℃的恒溫槽預熱10分鐘。向其中加入0.15mL樣品溶液，充分攪拌，40℃下開始酶促反應。反應30分鐘后，用設定為40℃的R型粘度儀(東機產(chǎn)業(yè)RE100)測定粘度。在各酶促反應條件下，以使初始粘度降低為1/2的酶量為1單位。以試驗區(qū)(1)中的酶活性為100％，試驗區(qū)(2)和(3)的酶活性以相對值表示，見下表。
表1

由以上結果可知各纖維素酶(A162P、K166E和APKE)與親本纖維素酶相比，具有LAS耐性，且在堿性條件下保持高活性。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明的新型纖維素酶與親本纖維素酶比較，具有表面活性劑耐性，以及在堿性條件下顯示更高的活性，因此與衣物洗滌劑混合使用時有用。
序列表獨立文本SEQ ID NO.3-5所表示的各氨基酸序列是表面活性劑耐性纖維素酶。SEQ ID NO.3-5所表示的各核苷酸序列是用于引入位點專一性突變的引物。
以上按照特定的方案對本發(fā)明進行了說明，對本領域人員來講不言而喻的變形或改良均包含在本發(fā)明的范圍內。
序列表<110>Mei ji Seika Kaisha，Ltd.
<120>新型表面活性劑耐受性纖維素酶<130>MEJ-696<150>JP 2002-318303<151>2002-10-31<160>8<170>Patentln version 3.1<210>1<211>205<212>PRT<213>孤獨腐殖霉<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(205)<223>
<400>1Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro1 5 10 15Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp20 25 30Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly Cys35 40 45Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp Ala50 55 60Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala Gly65 70 75 80
Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr85 90 95Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn Thr100 105 110Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly115 120 125Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro Pro130 135 140Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu Cys145 150 155 160Asp Ala Phe Pro Glu Lys Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp165 170 175Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val Ser180 185 190Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg195 200 205<210>2<211>615<212>DNA<213>孤獨腐殖霉<400>2cagtccggca gcggccgcac cacgcgctac tgggactgct gcaagccgtc gtgcgcgtgg 60cccggcaagg gcccggcgcc cgtgcggacg tgcgaccggt gggacaaccc gctgttcgac 120
ggcggcaaca cgcgcagcgg gtgcgacgcg ggcggcggcg cctacatgtg ctcggaccag 180agcccgtggg cggtcagcga cgacctggcg tacggctggg cggccgtcaa cattgccggc 240tccaacgaga ggcagtggtg ctgcgcctgc tacgagctga ccttcaccag cgggccggtg 300gcgggcaaga ggatgattgt gcaggcgagc aacacgggag gcgatttggg gaacaaccac 360tttgatattg ctatgcccgg cggtggcgtc ggtatcttca acgcctgcac cgaccagtac 420ggcgcgcccc ccaacggctg gggccagcgc tacggcggca tcagccaacg ccacgagtgc 480gacgccttcc ccgagaagct caagcccggc tgctactggc gctttgactg gttcctcaac 540gccgacaacc cgagcgtcaa ctggcggcag gtcagctgcc cggccgagat tgtggccaag 600agcggctgct cgcgt 615<210>3<211>205<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述一種表面活性劑耐受性纖維素酶<400>3Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro1 5 10 15Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp20 25 30Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly Cys35 40 45Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp Ala50 55 60
Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala Gly65 70 75 80Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr85 90 95Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn Thr100 105 110Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly115 120 125Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro Pro130 135 140Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu Cys145 150 155 160Asp Pro Phe Pro Glu Lys Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp165 170 175Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val Ser180 185 190Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg195 200 205<210>4<211>205<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述一種表面活性劑耐受性纖維素酶
<400>4Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro1 5 10 15Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp20 25 30Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly Cys35 40 45Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp Ala50 55 60Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala Gly65 70 75 80Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr85 90 95Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn Thr100 105 110Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly115 120 125Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro Pro130 135 140Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu Cys145 150 155 160
Asp Ala Phe Pro Glu Glu Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp165 170 175Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val Ser180 185 190Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg195 200 205<210>5<211>205<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述一種表面活性劑耐受性纖維素酶<400>5Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro1 5 10 15Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp20 25 30Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly Cys35 40 45Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp Ala50 55 60Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala Gly65 70 75 80Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr85 90 95
Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn Thr100 105 110Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly115 120 125Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro Pro130 135 140Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu Cys145 150 155 160Asp Pro Phe Pro Glu Glu Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp165 170 175Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val Ser180 185 190Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg195 200 205<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述一種位點專一性誘變引物<400>6ggggaagggg tcgcactcgt ggcgttg 27<210>7<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述一種位點專一性誘變引物<400>7cttgagctcc tcggggaagg cgtcgca27<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述一種位點專一性誘變引物<400>8gagctcctcg gggaaggggt cgcactcgtg 30
權利要求
1.纖維素酶，該纖維素酶具有(1)含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的纖維素酶中第162位和/或第166位氨基酸殘基被與上述纖維素酶的氨基酸不同的氨基酸置換的氨基酸序列，或者(2)在上述氨基酸序列(1)的N末端附加或缺失1個或多個氨基酸的氨基酸序列。
2.權利要求1的纖維素酶，該纖維素酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
3.權利要求1的纖維素酶，其中第166位氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸置換。
4.權利要求3的纖維素酶，該纖維素酶具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
5.纖維素酶，該纖維素酶具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
6.多聚核苷酸，該多聚核苷酸編碼權利要求1-5中任一項的纖維素酶。
7.表達載體，該表達載體含有權利要求6的多聚核苷酸。
8.宿主細胞，該宿主細胞由權利要求7的表達載體轉化。
9.權利要求1-5中任一項的纖維素酶的制備方法，該制備方法包括培養(yǎng)權利要求8的宿主細胞，由該宿主和/或培養(yǎng)物收集纖維素酶的步驟。
10.纖維素酶制備物，該纖維素酶制備物含有權利要求1-5中任一項的纖維素酶。
11.洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物含有權利要求1-5中任一項的纖維素酶或權利要求10的纖維素制備物。
12.含纖維素的纖維的處理方法，該方法包括使含纖維素的纖維與權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物或權利要求11的洗滌劑組合物接觸的步驟。
13.降低含纖維素的纖維開始起毛的速度或降低含纖維素的纖維的起毛程度的方法，該方法包括使含纖維素的纖維與權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物或權利要求11的洗滌劑組合物接觸的步驟。
14.以改善含纖維素的纖維的手感和外觀為目的的減量加工方法，該方法包括使含纖維素的纖維與權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物或權利要求11的洗滌劑組合物接觸的步驟。
15.使著色的含纖維素的纖維的色彩澄清的方法，該方法包括使著色的含纖維素的纖維與權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物或權利要求11的洗滌劑組合物接觸的步驟。
16.對著色的含纖維素的纖維提供色彩局部變化的方法，該方法包括使著色的含纖維素的纖維與權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物或權利要求11的洗滌劑組合物接觸的步驟。
17.降低含纖維素的纖維開始僵硬的速度或降低含纖維素的纖維的僵硬程度的方法，該方法包括使含纖維素的纖維與權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物或權利要求11的洗滌劑組合物接觸的步驟。
18.權利要求12-17中任一項的方法，其中纖維的處理通過對該纖維進行浸漬、洗滌或漂洗進行。
19.廢舊紙脫墨的方法，其特征在于在將廢舊紙用脫墨化學試劑處理，進行脫墨的步驟中，使用權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物。
20.紙漿打漿度的改善方法，該方法包括將紙漿用權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物進行處理的步驟。
21.改善動物飼料的消化率的方法，該方法包括將含纖維素的纖維用權利要求1-5中任一項的纖維素酶、權利要求10的纖維素酶制備物進行處理的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了新型纖維素酶，該新型纖維素酶具有以下序列纖維素酶NCE5的第162位和/或第166位的氨基酸殘基被與上述纖維素酶的氨基酸不同的氨基酸置換。還公開了編碼上述新型纖維素酶的多聚核苷酸、含有該多聚核苷酸的表達載體、用上述表達載體轉化的宿主細胞、以及含有上述纖維素酶的纖維素酶制備物和洗滌劑組合物。本發(fā)明的纖維素酶具有表面活性劑耐性，且在堿性條件下保持高活性。
文檔編號C12N1/15GK1708584SQ20038010218
公開日2005年12月14日 申請日期2003年10月31日 優(yōu)先權日2002年10月31日
發(fā)明者岡倉薰, 矢內耕二 申請人:明治制果株式會社