專利名稱：具有修飾c端的反饋抗性高絲氨酸轉琥珀酰酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有反饋抗性的高絲氨酸轉琥珀酰酶，含有這些酶的微生物菌株及其用于制備L-甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的用途。
甲硫氨酸是人類和許多動物的必需氨基酸。特別是，其被制備用于飼料市場及作為消旋物被添加到動物飼料中。它由丙烯醛和甲硫醇經過3-(甲硫基)丙醛化學合成，該3-(甲硫基)丙醛用氰化氫、氨和二氧化碳經過乙內酰脲轉變成D，L-甲硫氨酸。消旋物可用酶解析。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是代謝中最重要的甲基供體，在醫(yī)藥領域，用于治療抑郁、肝病和關節(jié)炎。已經被描述用于制備SAM的方法，特別包括在前體L-甲硫氨酸存在的情況下培養(yǎng)酵母(Schlenk F.和DePalma R.E.，J.Bilo.Chem.1037-1050(1957)，Shiozaki S.等人，Agric.Biol.Chem.53，3269-3274(1989))及在自溶后層析純化。
甲硫氨酸的微生物合成，在大腸桿菌中研究得尤其深入(Greene，R.C.，在Neidhardt F.C.，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中甲硫氨酸的生物合成，細胞與分子生物學，第二版，ASM出版社，華盛頓市(1996)542-560頁及其中所含的文獻)。甲硫氨酸的微生物合成由許多酶催化的反應組成并被嚴格控制。合成的第一步，從天冬氨酸到高絲氨酸，與合成蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸同時進行。合成的第一步對甲硫氨酸的合成是特異性的，它是從琥珀?；?CoA和高絲氨酸生成O-琥珀?；呓z氨酸，并除去輔酶A。該反應由高絲氨酸琥珀?；D移酶(高絲氨酸O-轉琥珀酰酶，MetA，EC 2.3.1.46)所催化。SAM用L-甲硫氨酸和ATP一步合成。
高絲氨酸轉琥珀酰酶的活性在L-甲硫氨酸和/或SAM存在的情況下被抑制(Lee L.-W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966))。該終產物抑制一方面防止細菌中過度耗能合成甲硫氨酸和SAM，另一方面還同時阻礙以工業(yè)規(guī)模用微生物生產這兩種物質。編碼高絲氨酸轉琥珀酰酶的基因由930個堿基對組成(包括終止密碼子)，而由該基因編碼的蛋白質由309個氨基酸組成。高絲氨酸轉琥珀酰酶的結構迄今還未被闡明，因此也還不能鑒定參與終產物抑制的氨基酸。
增加代謝終產物合成的已知方法是使用其活性不再被其代謝途徑的終產物所抑制的經修飾的酶(反饋抗性突變體)。因此，例如3-去氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶反饋抗性突變體已經被制備用于增加L-色氨酸和L-苯丙氨酸的合成(EP0745671A2)，及分枝酸變位酶/預苯酸脫水酶的反饋抗性突變體已經被制成用于增加苯丙氨酸的產生(US5120837)。
大腸桿菌高絲氨酸轉琥珀酰酶最近通過突變編碼它的DNA序列被修飾，使得生成蛋白質的活性在L-甲硫氨酸或SAM存在的情況下較不易被抑制(JP2000139471A；DE10247437(相同申請人的申請))。涉及的突變是點突變，在每種情況下一個氨基酸被另一個氨基酸置換(JP2000139471A第27位的精氨酸用半胱氨酸置換，第296位的異亮氨酸用絲氨酸置換及第298位的脯氨酸用亮氨酸置換；DE10247437第101位的天冬氨酸或第294位的酪氨酸用另一個天然氨基酸置換)。與野生型酶相比，改變的高絲氨酸轉琥珀酰酶在抑制劑L-甲硫氨酸和/或SAM存在的情況下顯示出改良的活性。含有這些被改變的蛋白質的細菌菌株顯示增加了L-甲硫氨酸的生產。
期望獲得盡可能多的高絲氨酸轉琥珀酰酶變異體，它們在活性程度上及可被L-甲硫氨酸和/或SAM抑制的程度上不同，因為L-甲硫氨酸和SAM的微生物生物合成在過程和調節(jié)上非常復雜，而且還以多種不同的方式把細胞中多種其他代謝途徑連結起來。因此不可能事先預測可以獲得怎樣的能影響微生物菌株生長、平衡其生命代謝過程及L-甲硫氨酸和SAM生產的變異體。
本發(fā)明的目的是提供廣泛的高絲氨酸轉琥珀酰酶(MetA蛋白質)的新的變異體，在與野生型(WT)酶比較下顯示出對L-甲硫氨酸和SAM的反饋抗性被提高。
本發(fā)明的目的通過高絲氨酸轉琥珀酰酶實現，與高絲氨酸轉琥珀酰酶野生型酶相比顯示出對L-甲硫氨酸和SAM的敏感性降低，而野生型酶有一段氨基酸序列，包括成分序列TyrGlnXaaThrPro，這個成分序列的Thr位于氨基酸序列的第285位至310位間，且第1位為起始甲硫氨酸，其特征在于與野生型酶相比，所述高絲氨酸轉琥珀酰酶顯示至少2個氨基酸的改變，而這個改變位于該成分序列中的Thr或其C-端。
大腸桿菌MetA蛋白中，保守的Thr在成分序列TyrGlnXaaThrPro中是第297位(見SEQ ID NO2)。Xaa表示任何任意的天然氨基酸。
所述改變優(yōu)選改變至少5個氨基酸，特別優(yōu)選改變至少10個氨基酸。改變可以是缺失或插入。
因此目前僅揭示了具有反饋抗性的高絲氨酸轉琥珀酰酶，其中與野生型相比，改變基于單一氨基酸的取代(JP2000139471A)。因為蛋白質的折疊是非常復雜的過程，并且酶活性直接依賴于蛋白質的空間結構，所以蛋白質的相對大的改變在許多情況中都造成活性喪失。然而，令人驚奇的發(fā)現是與本發(fā)明一致的在MetA羧基端部分的多重改變導致L-甲硫氨酸和SAM發(fā)揮反饋抑制能力的降低。
本發(fā)明的高絲氨酸轉琥珀酰酶對抑制劑SAM和/或L-甲硫氨酸呈現抗性，其優(yōu)于野生型酶。優(yōu)選呈現對甲硫氨酸和/或SAM的高絲氨酸轉琥珀酰酶抗性至少是野生型酶的2倍。特別優(yōu)選本發(fā)明的高絲氨酸轉琥珀酰酶對甲硫氨酸和/或SAM的抗性是野生型酶的10倍，特別優(yōu)選抗性被增加50倍。
特別優(yōu)選地，本發(fā)明高絲氨酸轉琥珀酰酶的蛋白質序列含有表1所列突變之一。
本發(fā)明的高絲氨酸轉琥珀酰酶可例如通過表達編碼本發(fā)明的高絲氨酸轉琥珀酰酶DNA序列而獲得。
本發(fā)明因此還涉及編碼本發(fā)明的高絲氨酸轉琥珀酰酶的DNA序列。
這樣的DNA序列可以通過突變MetA基因的一或多個密碼子的至少一個堿基而獲得，其特征是改變的堿基位于成分序列TyrGlnXaaThrPro中以蘇氨酸Thr密碼子起始的3’區(qū)，而在此序列中Thr位于第285位和310位之間。在大腸桿菌MetA蛋白質中，成分序列的Thr位于第297位(見SEQ ID NO2)。
本發(fā)明的DNA序列以下稱為具有反饋抗性的MetA等位基因。在本發(fā)明說明書中，在使用BESTFIT算法(GCG Wisconsin Package，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)的分析中，那些與大腸桿菌WT metA基因有超過50％的序列相同性的基因也被理解成是metA等位基因。以完全相同的方式，與大腸桿菌野生型高絲氨酸轉琥珀酰酶有超過50％的序列相同性(BESTFIT算法，GCGWisconsin Package，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)并擁有高絲氨酸轉琥珀酰酶活性的蛋白質也被稱為高絲氨酸轉琥珀酰酶。
本發(fā)明的MetA等位基因的DNA序列優(yōu)選含有表1所列的突變之一。
本發(fā)明的metA等位基因例如可以用下述的原料通過非特異性誘變或定向誘變來制備。上述DNA區(qū)城內的非特異性突變可以通過例如化學試劑(例如1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍，甲磺酸乙酯及類似物)和/或通過物理方法和/或通過在規(guī)定條件下進行的聚合酶鏈式反應和/或通過在突變株(例如XL1red)中擴增DNA制得。在DNA片段內的特定位置導入突變的方法是已知的。另一種生成具有反饋抗性的metA等位基因的可能性在于組合不同的反饋抗性誘導突變以得到具有新特性的多重突變體。
優(yōu)選用野生型metA基因的DNA作為誘變原料。要被突變的metA基因可以被染色體編碼或在染色體外被編碼。上述的誘變方法用以修飾DNA序列的一個或多個核苷酸，使得由其所編碼的蛋白質擁有本發(fā)明的多重突變。
已經被描述的技術可用以在任意metA基因中的所述DNA區(qū)域導入一個或多個突變。這些突變導致所編碼的高絲氨酸轉琥珀酰酶擁有了導致對SAM和/或L-甲硫氨酸具反饋抗性的氨基酸序列。
在如所述地進行誘變后，擁有期望表型的突變體被選擇，例如通過測定突變的高絲氨酸轉琥珀酰酶對L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性程度而進行選擇。
本發(fā)明還涉及含有反饋抗性的metA等位基因的微生物。這些微生物菌株的特征在于它們具有至少由具有反饋抗性的metA等位基因去調節(jié)(deregulated)的L-甲硫氨酸代謝或SAM代謝。因為此代謝在所有微生物中由相同的途徑(其本身是已知的)進行，并且用于產生本發(fā)明的菌株的技術為本領域技術人員所熟知，例如，從標準教科書得知，并可用于所有的微生物，因此本發(fā)明的菌株可用任意的微生物制備。優(yōu)選及合適的是用細菌生產本發(fā)明的菌株。革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌，特別適合。
本發(fā)明還進一步涉及通過培養(yǎng)本發(fā)明的微生物制備的L-甲硫氨酸或SAM，還涉及本發(fā)明的微生物用于制備含有甲硫氨酸(如含甲硫氨酸多肽)或在微生物代謝中衍生自L-甲硫氨酸或SAM(如多胺類、硫辛酸、生物素或醌類)的產物。此外，較野生型產生更大量SAM的本發(fā)明的微生物可用于制備通過從SAM轉移甲基形成的產物。
為表達經修飾的高絲氨酸轉琥珀酰酶，具有反饋抗性的metA等位基因經常規(guī)方法轉化到宿主菌株中。
在L-甲硫氨酸或SAM存在的情況下能使酶活性被測定的任何方法，都可用于測定高絲氨酸轉琥珀酰酶對L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性。例如，高絲氨酸轉琥珀酰酶活性可由以下Kredich和Tomkins所述用于測定絲氨酸乙?；D移酶活性的方法測定(Kredich N.M.和Tomlins G.M.，J.Biol.Chem.241，4955-4965(1966))。在含有高絲氨酸和琥珀?；?CoA的分析樣品中測量酶活性。反應由加入酶開始并用分光光度計根據由琥珀酰基-輔酶A中硫酯鍵的裂解所致的在232nm處消光的降低來監(jiān)測。上述試驗適合高絲氨酸轉琥珀酰酶對甲硫氨酸的敏感性的測定。高絲氨酸轉琥珀酰酶活性的抑制在不同濃度的L-甲硫氨酸存在的情況下，在反應混合液中檢測。不同高絲氨酸轉琥珀酰酶的催化活性在有或無L-甲硫氨酸的情況下測定，而這些數據被用以計算抑制常數Ki，它描述了活性僅為在無抑制劑的情況下可測定活性的50％的抑制劑濃度。
為測定不同高絲氨酸轉琥珀酰酶活性對SAM的敏感性，有可能例如，進行如Lee L.W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966)所述的活性試驗。在該方法中，酶萃取物與高絲氨酸和琥珀酰基-CoA一起培養(yǎng)。在不同的時間，一部份試驗分析樣品通過將其加入到乙醇、水和5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)的混合液中被終止。吸收在412nm處用分光光度計測定。上述試驗，適合例如用于測定高絲氨酸轉琥珀酰酶對SAM敏感性。高絲氨酸轉琥珀酰酶活性的抑制在不同濃度的SAM存在的情況下在反應混合液中測試。不同的高絲氨酸轉琥珀酰酶的催化活性在有或無SAM的情況下測定，抑制常數Ki則用這些數據計算。
優(yōu)選的是通常對L-甲硫氨酸和/或SAM具有降低敏感性又擁有未改變的催化活性的高絲氨酸轉琥珀酰酶。為其它目的，L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性和催化活性同時被降低也是我們所期望的。
具有反饋抗性的metA等位基因可在位于metA基因上游的自身啟動子的控制下表達，或使用本領域技術人員所熟知的其它合適的啟動子系統。因此，對應的基因可在這樣的啟動子的控制下以一個或多個拷貝存在于宿主生物的染色體上或載體上，優(yōu)選質粒。本發(fā)明因此還涉及質粒，其特征是其中含有本發(fā)明的具有反饋抗性的metA等位基因及啟動子。
對于克隆，可使用已含有遺傳元件(例如組成型或調節(jié)型啟動子、終止子)的載體，這些元件使編碼高絲氨酸轉琥珀酰酶的基因能以可連續(xù)表達或以受控制的可誘導的方式表達。此外，在表達載體上還有其它調節(jié)元件如核糖體結合位點和終止序列，以及編碼選擇標記和/或報道基因的序列。這些選擇標記的表達促進轉化體的鑒定。合適的選擇標記為例如編碼對氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素和其它抗生素的抗性的基因。若本發(fā)明的metA等位基因要在染色體外復制時，則質粒載體優(yōu)選含有復制起點。尤其優(yōu)選質粒載體如大腸桿菌載體pACYC184、pUC18，pBR322和pSC101及其衍生物。合適的可誘導的啟動子的實例為lac、tac、trc、lambda PL、ara和tet啟動子或自其衍生的序列。優(yōu)選GAPDH啟動子的組成型表達。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，編碼高絲氨酸轉琥珀酰酶的基因在衍生自pACYC184的質粒中的GAPDH啟動子的控制下。將基因整合入染色體的策略是現有技術。
合適宿主菌株用含有編碼對L-甲硫氨酸不敏感和/或對SAM不敏感的高絲氨酸轉琥珀酰酶的轉錄單元的載體轉化。含有對L-甲硫氨酸敏感和/或對SAM敏感的蛋白質的菌株，例如細菌，被用作宿主菌株。
優(yōu)選使用的宿主菌株為大腸桿菌野生型菌株或其中內源metA基因失活的菌株，如大腸桿菌菌株DL41，CGSC菌株收藏號7177。這些菌株用本發(fā)明的metA基因互補。附加的措施可用以增加本發(fā)明的菌株生產L-甲硫氨酸或SAM的能力。例如，為此目的，可使用其中不再表達編碼甲硫氨酸代謝基因抑制子的metJ基因的菌株(JP2000139471A)。再者，可通過組合本發(fā)明的突變株和其它突變而生成改良的和更加優(yōu)越的高絲氨酸轉琥珀酰酶，所述的其它突變例如為DE10247437或JP2000139471A中所述的氨基酸取代。
優(yōu)選通過培養(yǎng)本發(fā)明的微生物菌株來產生L-甲硫氨酸或SAM。為此目的，微生物菌株，例如，在發(fā)酵罐中在合適的碳源和合適的能源以及其它添加劑的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)為佳。
在發(fā)酵期間形成的物質，如L-甲硫氨酸或SAM，之后可被純化。
以下實施例用以進一步說明本發(fā)明。所有采用的分子生物學方法，如聚合酶鏈反應，DNA的分離和純化，用限制酶、Klenow片段和連接酶修飾DNA，轉化等是采用本領域技術人員所熟知的方式，文獻中的所描述的方式或以各廠商所建議的方式實施。
實施例1通過改變metA結構基因的羧基端部分生成具反饋抗性的高絲氨酸轉琥珀酰酶質粒pKP413GAP含有在GAPDH啟動子控制下的大腸桿菌野生型metA基因及以編號DSM15221保藏于不倫瑞克的德國微生物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，作為起始質粒。采用pKP413GAP作為底物，進行反向聚合酶鏈反應，與本領域技術人員已知的法則一致地使用Vent聚合酶(新英格蘭生物實驗室)。具有序列5’-CTATTTGTTAGTGAATAATAGTACTGAGCTCTGG-3’(SEQ IDNo.3)的5’-磷酸化寡核苷酸metAdel1和具有序列5’-CTGGTGGATATATGAGATCTGGTAGACGTAATAG-3’(SEQ IDNo.4)的metAdel2作為引物。約4.3kb大小的產物依照廠商說明書內容電泳分離和純化，使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)。其后，使用T4DNA連接酶依照廠商的說明書內容進行分子內連接。大腸桿菌DH5α的細胞使用CaCl2法以本領域技術人員已知的方式轉化。轉化混合物涂布在LB-四環(huán)素瓊脂板上(10克蛋白胨/升，5克酵母提取物/升，10克NaCl/升，15克瓊脂/升，15毫克四環(huán)素/升)，然后在37℃下培養(yǎng)過夜。在使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen)進行了質粒分離后，通過限制分析鑒定想要的轉化體。Esp3I至ScaI裂解部位間的區(qū)域被測序和分離，并插入已以相同酶處理的pKP413GAP質粒中。生成的質粒pBaBmetAdel含有大腸桿菌metA結構基因，在GAPDH啟動子控制下及與野生型比較擁有在3’端的改變，參閱表1。由此基因所編碼蛋白質的經改變的氨基酸序列同樣示于表1。
通過類似于上述的方法，使用具有序列5’-TGGTGGATATATGAGATCTGGTAGACGTAATAG-3’(SEQ IDNo.5)的寡核苷酸metAext1和具有序列5’-CTATTTGTTAGTGAATAATAGTACTGAGCTCTGG-3’(SEQ IDNo.3)的metAdel1的聚合酶鏈反應用以生成質粒pBaBmetAext。
使用具有序列5’-TGGTGGATATATGAGATCTGGTAGACGTAATAG-3’(SEQ IDNo.5)的寡核苷酸metAext1和具有序列5’-GTATTTGTTAGTGAATAATAGTACTGAGCTCTGG-3’(SEQ IDNo.6)的metAext2的聚合酶鏈反應用以生成質粒pBaBmetAex2。
MetA結構基因與野生型比較下的改變見表1。
表1起始質粒(AP)以及含有具經改變羧基端的metA變異物的質粒
實施例2高絲氨酸轉琥珀酰酶突變體的活性及對L-甲硫氨酸的反饋抗性不同高絲氨酸轉琥珀酰酶的活性及L-甲硫氨酸對活性的影響通過酶試驗測定，使用已產生個別蛋白質的細胞提取物。為此目的，編碼改變的高絲氨酸轉琥珀酰酶的相應質粒使用本領域技術人員已知的方法通過轉化導入大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27325)中。轉化混合物涂布在LB-四環(huán)素瓊脂板上(10克蛋白胨/升，5克酵母提取物/升，5克NaCl/升，15克瓊脂/升及15毫克四環(huán)素/升)及在37℃下培養(yǎng)過夜。生成的轉化體在SM1培養(yǎng)基上生長(1升培養(yǎng)基CaCl2×2H2O，0.0147克，MgSO4×7H2O，0.3克，Na2MOO4×2H2O，0.15毫克，H3BO3，2.5毫克，CoCl2×6H2O，0.7毫克，CuSO4×5H2O，0.25毫克，MnCl2×4H2O，1.6毫克，ZnSO4×7H2O，0.3毫克，KH2PO4，3.0克，K2HPO4，12.0克，(NH4)2SO4，5克，NaCl，0.6克，FeSO4×7H2O，0.002克，Na3-檸檬酸×2H2O，1克，葡萄糖，5克，蛋白胨，1克，酵母提取物，0.5克)，在600nm下約0.8的吸收值時離心，在50mMTris pH7.5中清洗及再離心。細胞重懸于50mM Tris/Cl，pH7.5，2mM二硫蘇糖醇，0.5mM苯甲基磺酰氯中及在法式壓濾器(French press)中破裂。用進一步離心的上清液作為試驗的酶提取物。酶活性在含有50mM Tris/Cl，pH7.6，1mM高絲氨酸和0.1mM琥珀?；?COA的混合液中用光度計測定，由反應中形成的輔酶A在232nm的消光降低定量，依循由Kredich和Tomkins所述測定絲氨酸乙?；D移酶的方法(Kredich N.M.和Tomkins G.M.，J.Biol.Chem.241，4955-4965(1966))。測定加入的L-甲硫氨酸對活性的影響，并定量可抑制性為Ki值。測定的Ki為L-甲硫氨酸的濃度，在此濃度下高絲氨酸轉琥珀酰酶的活性僅為在無L-甲硫氨酸的情況下活性的50％。
所有高絲氨酸轉琥珀酰酶突變體，與野生型比較下，展現對L-甲硫氨酸反饋抗性的升高。表2簡要列出結果。
表2野生型酶和高絲氨酸轉琥珀酰酶突變體的活性及對L-甲硫氨酸的反饋抗性
*在無L-甲硫氨酸存在的情況下活性相當100％。
實施例3高絲氨酸轉琥珀酰酶對SAM的反饋抗性SAM對不同高絲氨酸轉琥珀酰酶活性的影響以在不同濃度的SAM(Cl鹽，Sigma)存在下定量活性的方式測定。細胞提取物的生長及制備依實施例2所述?；钚栽囼炄鏛ee L.W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966)中所述的方法進行，以酶提取物與50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.5，3mM絲氨酸和0.3mM琥珀?；?CoA培養(yǎng)。許多次后，100微升體積的試驗混合物在各種情況由加400微升乙醇，400微升水和100微升10mM 5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)而終止。生成混合物在室溫下孵育5分鐘后，在412nm以分光光度計測定吸收。在蛋白質濃度測定后，酶活性用消光系數計算。Ki為SAM抑制活性能力的測定值。
表3高絲氨酸轉琥珀酰酶突變體的活性及對SAM的反饋抗性
*在無SAM存在的情況下活性相當100％。
序列表<110>電化學工業(yè)有限公司(國際)<120>具有修飾C端的反饋抗性高絲氨酸轉琥珀酰酶<130>Co10221<140>
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<400>1atg ccg att cgt gtg ccg gac gag cta ccc gcc gtc aat ttc ttg cgt48Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg1 5 10 15gaa gaa aac gtc ttt gtg atg aca act tct cgt gcg tct ggt cag gaa96Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu
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100 105 110Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu115 120 125Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala130 135 140Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg145 150 155 160Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His165 170 175Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser180 185 190Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu195 200 205
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權利要求
1.一種高絲氨酸轉琥珀酰酶，其與高絲氨酸轉琥珀酰酶野生型酶相比，呈現出對L-甲硫氨酸或SAM的降低的敏感性，而野生型酶擁有包括成分序列TyrGlnXaaThrPro的一段氨基酸序列，該成分序列的Thr位于氨基酸序列的第285位和310位之間，且第1位為起始甲硫氨酸，其特征在于與野生型酶相比呈現至少2個氨基酸的改變，而且此改變位于該成分序列的Thr或其C-端。
2.如權利要求1的高絲氨酸轉琥珀酰酶，其特征在于其呈現至少5個氨基酸、優(yōu)選至少10個氨基酸的改變。
3.如權利要求1或2的高絲氨酸轉琥珀酰酶，其特征在于與野生型酶相比，其呈現出對抑制劑SAM和/或L-甲硫氨酸的抗性增加至少2倍(增加的Ki)。
4.如權利要求1-3任一項的高絲氨酸轉琥珀酰酶，其特征在于其含有表1所列突變之一。
5.一種metA等位基因，其編碼如權利要求1-4中任一項的高絲氨酸轉琥珀酰酶。
6.一種質粒，其特征在于含有與啟動子一起的如權利要求5的metA等位基因。
7.一種微生物菌株，其特征在于其含有如權利要求5的具有反饋抗性的metA等位基因。
8.如權利要求7的微生物菌株，其特征在于其是革蘭氏陰性菌株，優(yōu)選為大腸桿菌。
9.一種通過培養(yǎng)如權利要求7或8的微生物菌株來制備L-甲硫氨酸或SAM的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高絲氨酸轉琥珀酰酶，其與野生型高絲氨酸轉琥珀酰酶相比有對L－甲硫氨酸或SAM的降低的敏感性，后者包含一段含有TyrGlnXaaThrPro亞序列的氨基酸序列，所述亞序列的Thr位于所述氨基酸序列的第285位和第310位之間，且第1位對應于起始甲硫氨酸。本發(fā)明的高絲氨酸轉琥珀酰酶的特征在于與野生型酶相比，至少修飾了2個氨基酸，所述修飾發(fā)生在所述亞序列的Thr或C端。
文檔編號C12N9/10GK1705751SQ200380101894
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月16日 優(yōu)先權日2002年10月24日
發(fā)明者蘇珊·萊昂哈特斯貝格爾, 克斯廷·普法伊費爾, 克里斯托夫·溫特哈爾特, 布麗吉特·鮑爾 申請人:電化學工業(yè)有限公司(國際)