專利名稱：提純硫醚抗生素的方法
背景技術(shù)：
細(xì)菌對(duì)治療人類疾病常規(guī)抗生素的抗藥性已經(jīng)增長(zhǎng)到了國(guó)際性臨界水平。一個(gè)重要因素是治療非致命感染抗生素的廣泛使用。近年來，人們更加關(guān)注一類被稱為硫醚抗生素的具有前景的新型細(xì)菌素。當(dāng)前，硫醚抗生素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。硫醚抗生素具有顯著的商業(yè)價(jià)值并且應(yīng)用廣泛，其可實(shí)施的制備方法具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
細(xì)菌素是由細(xì)菌產(chǎn)生的、對(duì)一定范圍相關(guān)細(xì)菌表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制活性的抗微生物蛋白。硫醚抗生素是由某些細(xì)菌產(chǎn)生的多肽抗微生物劑，由于其多肽特性與生物活性硫醚抗生素與其它抗生素相區(qū)別。例如作為某些食品防腐劑的乳酸鏈球菌肽具有非常規(guī)的氨基酸殘基，羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。乳酸鏈球菌肽，一種富含賴氨酸的硫醚抗生素，對(duì)人類與牲畜無毒，耐高溫在很低濃度下具有抑菌性。不幸的是，盡管硫醚抗生素用途廣泛并且具有獨(dú)特而優(yōu)選的特性，由于缺乏經(jīng)濟(jì)可行的高純度離析方法，其應(yīng)用受到了限制。
對(duì)在乳品加工業(yè)使用乳酸鏈球菌肽的可能性進(jìn)行分析，說明了缺乏經(jīng)濟(jì)可行提純方法的影響。近來，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到乳酸鏈球菌肽對(duì)乳品工業(yè)的潛在價(jià)值，特別是此價(jià)值與乳酸鏈球菌肽具有的幫助抵抗奶牛乳腺炎感染的能力有關(guān)。乳酸鏈球菌肽提供的益處大部分源于其減弱或者消除“抑制周期”規(guī)律的潛力?！耙种浦芷凇笔墙⒌囊粋€(gè)時(shí)間段，即在奶牛乳腺炎感染的治療過程中，感染奶牛生產(chǎn)的牛奶必須廢棄。因此，與傳統(tǒng)抗生素治療相比，使用乳酸鏈球菌肽治療乳腺炎感染奶牛的牛奶可以更快地恢復(fù)使用。
不幸的是，采用現(xiàn)有制備與提純方法商業(yè)制備的乳酸鏈球菌肽認(rèn)定為食品級(jí)質(zhì)量，達(dá)不到藥物應(yīng)用的有效純度。當(dāng)向奶牛給藥時(shí)，上述乳酸鏈球菌肽含有造成免疫響應(yīng)的肽雜質(zhì)。由于缺少可以選擇性去除上述雜質(zhì)的有效提純方法，由乳酸鏈球菌肽治療乳腺炎所獲得的價(jià)值不足以彌補(bǔ)現(xiàn)有方法的實(shí)施。因此，人們?nèi)耘f需要一種提高硫醚抗生素純度并且在商業(yè)規(guī)模應(yīng)用可行的方法。
為了商業(yè)可行，提純方案必須具備相對(duì)高的產(chǎn)率，相對(duì)低的成本。關(guān)于硫醚抗生素的制備，相對(duì)簡(jiǎn)單廉價(jià)的線路是培養(yǎng)可以自然表達(dá)或者人工設(shè)計(jì)表達(dá)所需細(xì)菌素的有機(jī)體。然而，不可避免的是，硫醚抗生素必須從有機(jī)體共同表達(dá)的、在初始制品中作為污染雜質(zhì)的無數(shù)蛋白質(zhì)中分離出來。由于硫醚抗生素是多肽，具有與其它蛋白質(zhì)相同的生化特征，因此，設(shè)計(jì)能夠識(shí)別硫醚抗生素與其它蛋白質(zhì)或者肽雜質(zhì)的實(shí)施方案，仍舊是一個(gè)挑戰(zhàn)。
基于待提純的蛋白質(zhì)通常敏感于此類處理的事實(shí)，在蛋白質(zhì)提純方案中，少有例外地避免使用蛋白酶或者具有與蛋白酶相似活性的酶。例如，由于胰蛋白酶識(shí)別此類殘基，可以在殘基位置上斷裂含有此類殘基的蛋白質(zhì)或者多肽，因此，在含有內(nèi)部賴氨酸或者精氨酸殘基的肽提純方法中，不能使用胰蛋白酶。此外，采用蛋白酶基提純方案，蛋白質(zhì)的純度與回收率逆向相關(guān)。這意味著，在增加重要蛋白質(zhì)回收率的條件下，雜質(zhì)趨于得不到充分的消化。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了從含有硫醚抗生素的天然或者部分提純的溶液提純硫醚抗生素的方法。盡管硫醚抗生素的共同結(jié)構(gòu)特征說明，本發(fā)明公開的提純方法對(duì)于硫醚抗生素類的其它成員具有有效性，但是在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中硫醚抗生素是乳酸鏈球菌肽。本發(fā)明方法包括下列步驟生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培養(yǎng)混合物；在使酶的選擇蛋白水解活性最佳化的條件下培養(yǎng)上述混合物；從而在保證硫醚抗生素完全未經(jīng)消化同時(shí)，消化含有硫醚抗生素溶液中的非硫醚抗生素蛋白質(zhì)、多肽和肽成份。
發(fā)明詳述硫醚抗生素是一組含有非常規(guī)的氨基酸、核醣體合成的、翻譯后修飾的肽。此類氨基酸包括硫醚氨基酸羊毛硫氨酸(Lan)和/或甲基羊毛硫氨酸(Dhb)，外加許多修飾的殘基，例如2，3-二脫氫丙氨酸(Dha)和2，3-二脫氫α-氨基丁酸(Dhb)。這些殘基在結(jié)構(gòu)中的出現(xiàn)及其對(duì)硫醚抗生素活性的影響已經(jīng)成為顯著的研究課題。
經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如，絲氨酸(對(duì)應(yīng)Dha)和蘇氨酸(對(duì)應(yīng)Dhb)特定序列脫氫生成了帶有可以與鄰近親核基團(tuán)反應(yīng)的親電子中心的修飾氨基酸。當(dāng)鄰近半胱氨酸殘基的硫醇基團(tuán)(-SH)攻擊Dha的雙鍵時(shí)，生成了硫醚羊毛硫氨酸。作為這些分子內(nèi)部鍵橋出現(xiàn)的結(jié)果，硫醚抗生素成為含有許多羊毛硫氨酸環(huán)的多環(huán)結(jié)構(gòu)。人們認(rèn)定，這些羊毛硫氨酸環(huán)的存在對(duì)于硫醚抗生素的許多重要特性至關(guān)重要，其中包括，例如肽穩(wěn)定的持續(xù)性與熱滅活的耐受性。
本發(fā)明是基于申請(qǐng)人令人意想不到的發(fā)現(xiàn)在未造成硫醚抗生素可測(cè)蛋白水解并產(chǎn)生針對(duì)蛋白質(zhì)與多肽雜質(zhì)的選擇蛋白水解活性的條件下，天然或者部分提純硫醚抗生素制品可以經(jīng)受蛋白酶處理。此條件的應(yīng)用提供了提純硫醚抗生素的有效方法。
有關(guān)硫醚抗生素對(duì)蛋白酶消化敏感的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)匯集于此。此類的一些報(bào)道特別涉及充分研究的硫醚抗生素，乳酸鏈球菌肽。例如，Gross等人(J Am Chem Soc93(18)(1971)4634-4635)報(bào)道，乳酸鏈球菌肽具有胰蛋白酶敏感性。隨后，Wilimowska-Pelc發(fā)表了批駁性報(bào)道(Acta Microbiol Pol A8(1)(1976)71-77)。最近，Chan等人(Int Food Microbiol 390(2001)267-281)報(bào)道，乳酸鏈球菌肽可以經(jīng)受胰蛋白酶消化，只是消化速率遞減。總之，熟悉現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員不能預(yù)測(cè)出鑒別處理?xiàng)l件的任何確定性；在此條件下，基本上未降解溶液中硫醚抗生素的同時(shí)，通過蛋白水解酶反應(yīng)，選擇性降解出現(xiàn)在天然或者部分提純硫醚抗生素溶液中非硫醚抗生素蛋白質(zhì)、多肽和肽雜質(zhì)。此發(fā)現(xiàn)對(duì)于改進(jìn)的、成本可行的高純硫醚抗生素提純方法的長(zhǎng)期需求特別重要，此提純方法可以生成適合藥用的硫醚抗生素制劑。
本發(fā)明有效的蛋白酶消化條件是以選擇性為特征。也就是，為含有攙雜硫醚抗生素和蛋白水解酶培養(yǎng)物確定的條件是，在此條件下蛋白水解酶選擇性地降解非硫醚抗生素雜質(zhì)。用于調(diào)節(jié)這些選擇性條件可改變的參數(shù)包括改變的PH范圍、減少的蛋白酶與硫醚抗生素比率、降低的溫度等。用于使蛋白水解酶選擇性操作最優(yōu)化的可改變參數(shù)的上述列舉并不全面，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)改變可以影響所需目標(biāo)的其它參數(shù)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定對(duì)于特殊蛋白水解酶的最佳條件。如果商業(yè)生產(chǎn)，生產(chǎn)者通常會(huì)在與酶共同運(yùn)輸?shù)陌b材料上提供上述信息。此外，憑經(jīng)驗(yàn)確定此條件只是一件涉及常規(guī)實(shí)驗(yàn)的事情。
然而，最佳的條件不是需要的選擇性條件。對(duì)于所給蛋白水解酶的最佳培養(yǎng)條件下，硫醚抗生素以及蛋白質(zhì)或者肽雜質(zhì)都會(huì)被降解。總的來說，選擇性條件是由經(jīng)驗(yàn)確定的。此確定的起點(diǎn)是生產(chǎn)者提供的最佳條件。如果在此條件下，硫醚抗生素與雜質(zhì)都被降解，此條件可以“向下調(diào)節(jié)”，達(dá)到選擇性條件。例如，如下文所述，據(jù)報(bào)道，胰蛋白酶的最佳pH大約是8.0。然而，在培養(yǎng)的其它條件都相同的情況下，說明書中記載的最佳選擇性條件包括pH范圍大約在5.50-6.25。
在下文的實(shí)施例部分中，使用了廣泛研究的硫醚抗生素乳酸鏈球菌肽。然而，如上所述，硫醚抗生素類成員具有許多相同的結(jié)構(gòu)特征，經(jīng)鑒別，其中一些結(jié)構(gòu)特征是相對(duì)耐受蛋白水解的原因。例如，在這方面還特別提到了羊毛硫氨酸環(huán)。因此，盡管實(shí)施例部分主要集中在硫醚抗生素乳酸鏈球菌肽，但是可以認(rèn)定，由于存在定義的結(jié)構(gòu)特征，本文建立的原則適用于所有的硫醚抗生素。其它硫醚抗生素包括，例如枯草菌素、表皮素、gallidermin、誘變素、pep5、epicidin、epilancin、溶細(xì)胞素、乳鏈球菌素、葡萄球菌素、salvaricin、乳桿菌素、鏈球菌素、sublancin、carnocin、variacin、cypemycin、connamycin、耐久酶素、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽、mersacidin、actagurdine。
本發(fā)明方法非常特別地適合存在于天然或者部分提純發(fā)酵液中硫醚抗生素的蛋白水解提純。例如，在乳酸鏈球菌肽發(fā)酵中，采用GC/MS/MS肽分析，已經(jīng)鑒別出與乳酸鏈球菌肽共同提純的40多種肽。下文的實(shí)施例部分清晰地展示了胰蛋白酶降解共同提純雜質(zhì)的有效性。
據(jù)報(bào)道，對(duì)于胰蛋白酶的蛋白水解活性，最佳pH值是在大約8.0。在培養(yǎng)的其它條件都相同的情況下，說明書中記載的最佳選擇性條件包括pH值范圍在大約5.50-6.25。相似的條件屬于其它蛋白酶的選擇性范圍，其中包括，例如肽鏈內(nèi)切酶Arg-C、嗜熱菌蛋白酶、V8蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、梭菌蛋白酶、賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶、肽鏈內(nèi)切酶Asp-N、腸肽酶、或者凝血因子Xa。優(yōu)選的是，由其它蛋白酶選擇性消化乳酸鏈球菌肽雜質(zhì)的條件包括pH值范圍在大約5.50-6.25。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，pH值是5.80。對(duì)于胃蛋白酶，pH值3.5在選擇性界限以內(nèi)。
如選擇性消化非硫醚抗生素雜質(zhì)所述，可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)選擇性蛋白酶消化條件。這些條件可以包括，例如低蛋白酶與硫醚抗生素的比率、降低的溫度、改變的pH值等?？梢詥为?dú)或者組合改變多種相關(guān)參數(shù)。
在完成蛋白水解消化后，需要去除蛋白酶。消化后促使去除蛋白酶特別常規(guī)的方法是，提供附著在固體載體的蛋白酶(例如瓊脂糖或者磁性珠)。采用此種形式，消化后固體載體容易從培養(yǎng)混合物中分離。此外，可以采用簡(jiǎn)單的分篩柱步驟，實(shí)現(xiàn)蛋白酶的去除。蛋白水解消化后去除蛋白酶的其它技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，其中包括層析法技術(shù)，例如親和性層析法、離子交換層析法、疏水性層析法。
應(yīng)當(dāng)注意，盡管消化雜質(zhì)后需要去除蛋白酶，但是在所有的實(shí)際應(yīng)用中都不需要這樣做。例如，如果提純的硫醚抗生素趨于被食物產(chǎn)品消耗，就不必為了滿足相關(guān)規(guī)定去除蛋白酶。例如，對(duì)于某些食品應(yīng)用，胰蛋白酶已經(jīng)被授予了公認(rèn)的安全資格(GRAS)。
實(shí)施例在中性到弱堿pH值與胰蛋白酶與乳酸鏈球菌肽高比率的條件下乳酸鏈球菌肽敏感于胰蛋白酶的蛋白水解乳酸鏈球菌肽含有2個(gè)蛋白水解酶胰蛋白酶潛在目標(biāo)的內(nèi)部賴氨酸殘基。為了確定乳酸鏈球菌肽是否可以被胰蛋白酶消化，從來自發(fā)酵罐的乳酸鏈球菌肽制品、或者部分提純的乳酸鏈球菌肽制備消化反應(yīng)混合物，然后，在使胰蛋白酶活性最佳化的條件下，將反應(yīng)混合物暴露于胰蛋白酶。上述條件包括反應(yīng)的pH值為7.0，并且乳酸鏈球菌肽與胰蛋白酶的比率為10∶1(重量比)。將樣品在30℃下培養(yǎng)，從零時(shí)間起每隔24小時(shí)取出等份試樣用于分析。SDS-PAGE的考馬斯藍(lán)色染色表明，在使用的條件下乳酸鏈球菌肽被胰蛋白酶降解。此外，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)乳酸鏈球菌肽的定量HPLC分析顯示，暴露于胰蛋白酶后24小時(shí)，乳酸鏈球菌肽的回收率開始降低。經(jīng)過96小時(shí)處理，超過90％的乳酸鏈球菌肽被降解。
在低pH值與胰蛋白酶與乳酸鏈球菌肽低比率的條件下乳酸鏈球菌肽耐受于胰蛋白酶的消化肽分析已經(jīng)鑒別出與乳酸鏈球菌肽共同提純的40多種肽。經(jīng)鑒別，這些肽都可作為乳球菌發(fā)酵的產(chǎn)物。由于已經(jīng)認(rèn)定，在中性到弱堿pH值與胰蛋白酶與乳酸鏈球菌肽高比率的條件下乳酸鏈球菌肽經(jīng)受了胰蛋白酶的蛋白水解，所以改變條件試圖鑒別出胰蛋白酶不降解乳酸鏈球菌肽而降解乳酸鏈球菌肽樣品中肽雜質(zhì)的條件。在室溫下將含有濃度為11mg/ml乳酸鏈球菌肽制品與濃度為27.5ug/ml USP級(jí)胰蛋白酶的反應(yīng)混合物過夜培養(yǎng)(重量比為400∶1)?；旌衔锏腜H值范圍在5.25-6.5。盡管乳酸鏈球菌肽與雜質(zhì)的最低水解率出現(xiàn)在小于PH值5.50，但是定量的HPLC分析顯示，乳酸鏈球菌肽的最佳回收率出現(xiàn)在小于或者等于PH值6.25。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，涉及稀釋的胰蛋白酶與范圍在5.50-6.25PH值的條件是，對(duì)于胰蛋白酶消化乳酸鏈球菌肽損失最小化、并且從乳酸鏈球菌肽制品去除肽雜質(zhì)的最佳條件。
為了進(jìn)一步優(yōu)化從胰蛋白酶消化的乳酸鏈球菌肽制品去除肽雜質(zhì)的條件，制備2升濃度為4.55mg/ml部分提純的乳酸鏈球菌肽，然后，加入含有25mg USP級(jí)胰蛋白酶的10mM檸檬酸，在30℃下保持PH值5.80培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。HPLC分析顯示，乳酸鏈球菌肽的總回收率大約為95％。此外，采用分子量隔斷膜連續(xù)去除胰蛋白酶，產(chǎn)生了87.5％乳酸鏈球菌肽回收率和0.38％胰蛋白酶回收率。
為了確定在消化雜質(zhì)過程中不溶解的胰蛋白酶處理乳酸鏈球菌肽制品是否有效，而不僅是乳酸鏈球菌肽本身，使用1.6ml與珠狀瓊脂糖結(jié)合的TPCK處理的不溶性胰蛋白酶，處理制備成濃度為9.55mg/ml的1.6升部分提純的乳酸鏈球菌肽。在30℃下培養(yǎng)6小時(shí)后，采用離心方式去除不溶解的胰蛋白酶，乳酸鏈球菌肽的總回收率是大約90％。
胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽保留了抗微生物活性采用逆向HPLC柱測(cè)定其可動(dòng)性，采用SDS-PAGE測(cè)定其遷移性，可以判斷得出，在上述條件下，使用胰蛋白酶處理乳酸鏈球菌肽制品，沒有影響乳酸鏈球菌肽的物理結(jié)構(gòu)。為了證實(shí)乳酸鏈球菌肽的生物活性也未經(jīng)改變，采用生命體外滅菌活性分析法。采用96孔平板分析法，測(cè)定胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽針對(duì)乳腺炎離析物無乳鏈球菌(菌株#20)的抗微生物活性，并且細(xì)菌生長(zhǎng)作為ELISA讀出器上的吸光率讀數(shù)進(jìn)行讀取。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽的抗微生物活性與未經(jīng)胰蛋白酶處理對(duì)照的活性沒有顯著區(qū)別。
胰蛋白酶處理減少了存在于攙雜乳酸鏈球菌肽的炎性因子向牛乳房?jī)?nèi)注入攙雜的乳酸鏈球菌肽，作為部分炎性反應(yīng)在牛奶中刺激產(chǎn)生了高含量的體細(xì)胞。如表1所示，注入30mg部分提純?nèi)樗徭溓蚓牡姆侨橄傺啄膛＞哂写蠓鲩L(zhǎng)的體細(xì)胞數(shù)量。相反，采用注入胰蛋白酶提純的乳酸鏈球菌肽處理乳區(qū)的奶牛，由此奶牛獲得牛奶的體細(xì)胞數(shù)量要少很多，與只用緩沖液處理乳區(qū)的奶牛的體細(xì)胞數(shù)量相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有區(qū)別。
其它蛋白酶表現(xiàn)出針對(duì)乳酸鏈球菌肽以外雜質(zhì)的選擇活性在上述最佳條件下，乳酸鏈球菌肽比較耐受于胰蛋白酶的蛋白水解。為了測(cè)定在相似條件下乳酸鏈球菌肽是否也耐受其它蛋白水解酶，在保持PH值5.8下部分提純的乳酸鏈球菌肽分別暴露于胃蛋白酶、凝血酶、V8蛋白酶(Endo Gluc)、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、或者梭菌蛋白酶。也在PH值3.5的條件下實(shí)施暴露于胃蛋白酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳酸鏈球菌肽耐受于上述酶的蛋白水解消化。PH值5.8下的胃蛋白酶和凝血酶對(duì)于雜質(zhì)也都表現(xiàn)出效率低下。PH值3.50條件下胃蛋白酶有效地消化了乳酸鏈球菌肽的雜質(zhì)，而未能消化乳酸鏈球菌肽。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在低PH值與如胰蛋白酶處理所述的乳酸鏈球菌肽與蛋白酶比率的條件下，其它蛋白酶也表現(xiàn)出針對(duì)乳酸鏈球菌肽以外雜質(zhì)的選擇活性。
方法胰蛋白酶消化在由25mM乙酸鈉、6mM三羥甲基氨基甲烷乙酸、5mM CaCl2構(gòu)成的PH值7.0的50ml緩沖液中，實(shí)施對(duì)乳酸鏈球菌肽(50mg)的胰蛋白酶消化。加入1ml USP級(jí)胰蛋白酶(5mg/ml)，然后，在30℃下培養(yǎng)。隨后，在24、48、72和96小時(shí)，加入500ul等分試樣的胰蛋白酶。在實(shí)驗(yàn)過程的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，取出2ml等分試樣用于進(jìn)一步分析，其中100ul試樣立即加入血液瓊脂平板以測(cè)定污染。剩余的1.8ml試樣在-20℃下儲(chǔ)存，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束進(jìn)行SDS-PAGE和HPLC分析。
蛋白酶消化為了用可溶的胰蛋白酶處理乳酸鏈球菌肽，將由發(fā)酵產(chǎn)品獲得的2升部分提純的乳酸鏈球菌肽制備成濃度為4.55mg/ml溶液，并加入10mM檸檬酸緩沖液和5mMCaCl2。在加入25mg的USP級(jí)胰蛋白酶后，在30℃下過夜培養(yǎng)反應(yīng)混合物。乳酸鏈球菌肽與胰蛋白酶的重量比是大約400∶1(重量比)。使用NaOH調(diào)節(jié)消化反應(yīng)的PH值，使其范圍在5.25-6.50。采用SDS-PAGE和HPLC測(cè)定乳酸鏈球菌肽的回收率與純度。通過使用3N HCl使PH值降低至3.0，終止消化反應(yīng)?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，在涉及其它蛋白酶的所有后續(xù)反應(yīng)中選擇并使用PH值5.80。
在如胰蛋白酶所述與PH5.8的條件下基本進(jìn)行消化實(shí)驗(yàn)，使用胃蛋白酶(EC3.4.2 3.1)、凝血酶(EC3.4.21.5)、V8蛋白酶(EC3.4.21.19)、枯草桿菌蛋白酶(EC3.4.21.62)、木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)、嗜熱菌蛋白酶(EC3.4.24.27)、或者梭菌蛋白酶(EC3.4.22.8)。也可以在PH值3.5下進(jìn)行胃蛋白酶消化。為了采用與固體基質(zhì)連接的胰蛋白酶進(jìn)行胰蛋白酶消化，加入10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸，制備成濃度為9.5mg/ml的PH值5.50的1.6升部分提純的乳酸鏈球菌肽溶液。然后，加入1.6ml與珠狀瓊脂糖(SigmaChemical Company)結(jié)合的TPCK處理的胰蛋白酶，在30℃頻繁攪拌的條件下將反應(yīng)混合物培養(yǎng)6小時(shí)。采用大約4000個(gè)重力離心7分鐘，去除不溶性胰蛋白酶。獲得含有乳酸鏈球菌肽的上清液，用于HPLC分析。
乳腺注入在第4、5、6次擠奶后，采用在乳區(qū)注入載體、未經(jīng)處理的乳酸鏈球菌肽、胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽(30mg/10ml)的方式，處理非乳腺炎的奶牛。在擠奶以前、過程中、或過程后記錄牛奶的體細(xì)胞數(shù)量。高體細(xì)胞數(shù)量表明了炎性反應(yīng)。采用帶有不相等平方差的兩側(cè)T-實(shí)驗(yàn)對(duì)照，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
乳酸鏈球菌肽的生物活性采用抗微生物分析法，使用96孔平板分析，測(cè)定針對(duì)乳腺炎離析物無乳鏈球菌(菌株20)、乳酸鏈球菌肽的活性。測(cè)試樣品平行稀釋到M17 10％乳糖介質(zhì)中，然后，與等體積的104cfu/ml混合。室溫下培養(yǎng)66小時(shí)后，在ELISA讀取器450nm處讀取平板數(shù)據(jù)。含有細(xì)胞生長(zhǎng)的孔會(huì)給出高吸光率的讀數(shù)。使用四參數(shù)曲線擬合軟件分析上述數(shù)據(jù)。
表1胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽的炎癥減弱
權(quán)利要求
1.一種提純硫醚抗生素的方法，其中包括(a)提供含有待提純硫醚抗生素的溶液；(b)提供蛋白水解酶；(c)生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培養(yǎng)混合物，然后，在保證硫醚抗生素基本未經(jīng)消化并使非硫醚抗生素蛋白或者多肽雜質(zhì)選擇性降解最佳化的條件下培養(yǎng)上述混合物。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括在消化后去除或者滅活水解蛋白酶的步驟。
3.權(quán)利要求1的方法，其中(a)步驟提供的溶液是發(fā)酵產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中硫醚抗生素選自乳酸鏈球菌肽、枯草菌素、表皮素、gallidermin、誘變素、pep5、epicidin、epilancin、溶細(xì)胞素、乳鏈球菌素、葡萄球菌素、salvaricin、乳桿菌素、鏈球菌素、sublancin、carnocin、variacin、cypemycin、connamycin、耐久酶素、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽、mersacidin、actagurdine。
5.權(quán)利要求1的方法，其中硫醚抗生素是乳酸鏈球菌肽。
6.權(quán)利要求5的方法，其中蛋白水解酶是胰蛋白酶。
7.權(quán)利要求6的方法，其中使選擇性降解最優(yōu)化的條件包括pH值在5.5-6.25之間。
8.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白水解酶選自胰蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶Arg-C、嗜熱菌蛋白酶、V8蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、梭菌蛋白酶、賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶、木瓜蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶Asp-N、腸肽酶、凝血因子Xa、胰凝乳蛋白酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中使選擇活性最優(yōu)化的條件包括pH值在5.5-6.25之間。
10.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白水解酶是胃蛋白酶。
11.權(quán)利要求10的方法，其中使選擇活性最優(yōu)化的條件包括pH值大于4.5。
12.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白水解酶連接在固體支撐物上。
13.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白水解酶的有效用量是硫醚抗生素/蛋白水解酶的重量比為約400∶1的。
全文摘要
本發(fā)明公開了從含有硫醚抗生素的天然或者部分提純的溶液提純硫醚抗生素的方法。盡管硫醚抗生素的共同結(jié)構(gòu)特征說明，本發(fā)明公開的提純方法對(duì)于硫醚抗生素類的其它成員具有有效性，但是在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中硫醚抗生素是乳酸鏈球菌肽。本發(fā)明方法包括下列步驟生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培養(yǎng)混合物；在使選擇性蛋白水解活性最佳化的條件下培養(yǎng)上述混合物。
文檔編號(hào)C12N9/70GK1703518SQ200380101155
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月9日
發(fā)明者理查德·T.·考格林, 約瑟夫·H.·克雷布 申請(qǐng)人:伊莫西爾有限公司