專利名稱：一種仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)修飾涂層的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用仿細(xì)胞膜外層結(jié)構(gòu)共聚物制備仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層的方法，屬
于高分子化學(xué)與物理及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，血管支架、傳感器、心臟輔助設(shè)備等各種微創(chuàng)介入醫(yī)療 裝置已廣泛應(yīng)用到各種醫(yī)療技術(shù)中，極大地豐富了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診療手段。然而在臨床應(yīng)用中， 現(xiàn)有的裝置依然不同程度地存在感染、凝血、術(shù)后組織增生以及其它的免疫副反應(yīng)，給患者 帶來極大的痛苦，同時增加了醫(yī)療費(fèi)用，有時還需要再次手術(shù)。目前用于改善植入材料血液 相容性的主要方法有血管內(nèi)皮化、白蛋白鈍化和磷酰膽堿化三種。磷酰膽堿是組成細(xì)胞外 層膜基本單元(如卵磷脂、鞘磷脂分子)的親水端基。細(xì)胞生物學(xué)研究表明，細(xì)胞外層膜帶
有等量正、負(fù)電荷的卵磷脂，不會激活內(nèi)源性凝血途徑。因而，人們用各種方法將含磷酰膽 堿基團(tuán)的分子構(gòu)建在材料表面，來改善材料的血液相容性。表面接枝方法雖可獲得牢固結(jié) 合的磷酰膽堿表面，但因接枝過程復(fù)雜，接枝密度不高而難以應(yīng)用；相對而言，涂覆方法工 藝簡單、實(shí)用性強(qiáng)。然而，這種以物理吸附結(jié)合的聚合物涂層，在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中可能發(fā)生 溶解、降解等作用而流失；另外，兩親性(親水、親油)聚合物涂層表面通常形成與細(xì)胞外層 膜結(jié)構(gòu)相反的結(jié)構(gòu)，加之表面結(jié)構(gòu)性能隨自組裝過程的條件及組裝后的保存環(huán)境等因素而 衰退，均會影響此類材料表面性能及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。這些不穩(wěn)定因素使得仿細(xì)胞 膜表面改性方法目前還存在安全隱患。 考慮涂層的血液相容性以及與基底材料結(jié)合的穩(wěn)定性，本發(fā)明使用含磷酰膽堿基 團(tuán)的可聚合單體與有機(jī)硅丙烯酸酯可交聯(lián)單體通過自由基溶液聚合，合成可交聯(lián)的仿細(xì)胞 膜二元共聚物。以此聚合物對金屬氧化物及含活性氫的基材表面進(jìn)行涂覆，與片基反應(yīng)后 形成共價結(jié)合、高表面密度的磷酰膽堿基團(tuán)表面。這種新型仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的表面改性 方法及技術(shù)，制備工藝簡單，涂層的生物相容性良好，對發(fā)展我國的生物醫(yī)用材料產(chǎn)業(yè)將會 起到高技術(shù)支撐作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層的制備方法，以解決通常的兩親 性聚合物涂層不穩(wěn)定以及形成反細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的問題，得到親水性更強(qiáng)、交聯(lián)更穩(wěn)定的 仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)表面。 利用可交聯(lián)基團(tuán)的水解、縮合反應(yīng)，將含磷酰膽堿基團(tuán)和烷氧基硅基團(tuán)的二元共 聚物在含水條件下交聯(lián)處理，形成仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)表面，獲得穩(wěn)定的親水性表面，達(dá)到對 材料進(jìn)行生物相容性表面改性的目的。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程如下 —種仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層的制備方法，包括如下步驟 (1)將結(jié)構(gòu)通式(I)表示的二元共聚物溶于無水極性有機(jī)溶劑，得到濃度為1 H3CT I CH3 CH3 其中，m和n對應(yīng)單元的摩爾百分?jǐn)?shù)分別為50 95%和5 50% ;&、 R2為H或 CH"R3為甲氧基或乙氧基； (2)用噴涂或浸涂的方法使聚合物在被修飾基材表面形成均勻的涂層； (3)涂層真空干燥之后，在重量百分濃度為0. 5 5. 0%的氨水或揮發(fā)性有機(jī)胺水
溶液的飽和蒸汽中處理1 72小時，處理溫度為20 12(TC，得到交聯(lián)固定的仿細(xì)胞外層
膜結(jié)構(gòu)親水表面，所述的揮發(fā)性有機(jī)胺選自三乙胺、三甲胺、乙二胺。 含氨(胺)水溶液的飽和氣氛不僅提供了涂層中烷氧基硅基團(tuán)之間發(fā)生水解反應(yīng) 必須的水分，氣氛中的氨(胺)類堿性分子對水解后的硅羥基之間的縮合交聯(lián)反應(yīng)有顯著 促進(jìn)作用。相比只在水汽中處理，在含氨(胺)水溶液的飽和氣氛中處理得到交聯(lián)更徹底 的仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)表面。含氨(胺)水溶液濃度過高時，飽和氣氛凝結(jié)在聚合物涂層表 面產(chǎn)生較強(qiáng)堿性，在加熱條件下聚合物易分解，可能失去仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。因而，氨(胺)水 溶液濃度最好保持在0. 5 5. 0% 。 本發(fā)明制備工藝簡單、方便，成本低，涂層的血液相容性和穩(wěn)定性都良好。在氨水 或揮發(fā)性有機(jī)胺水溶液飽和的蒸汽中處理后得到親水性更強(qiáng)、交聯(lián)穩(wěn)定的仿細(xì)胞外層膜結(jié) 構(gòu)表面。


圖1為本發(fā)明的聚合物P(MPC-co-TSMA)涂層濕熱處理之后，表面血小板黏附結(jié)果 的掃描電鏡圖，圖la為蓋玻片，圖lb為P(MPC-co-TSMA)涂層； 圖2為本發(fā)明的聚合物P(MPC-co-TSMA)涂層濕熱處理之后，表面牛血清白蛋白 (BSA)和牛血清纖維蛋白原(Fg)的吸附結(jié)果。
具體實(shí)施例方式(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿按照文獻(xiàn)[Ishihara K， Ueda T， Nakabayashi N. Polym. J. ， 1990， 22， 355]的方法合成及純化，丙烯酰氧丙基烷氧基硅及偶氮二異丁腈 (AIBN)從國內(nèi)試劑公司或Sigma公司購得，AIBN使用前用乙醇重結(jié)晶。共聚物改性后材料
10mg/mL的溶液，所述無水極性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇或其混合溶劑;
■2
2
仆
n
(I)
-O一
H c
Hc
4表面的親、疏水性能使用DCAT 21型表面界面張力儀測定接觸角來衡量。
實(shí)施例1 : 按照一定比例取單體2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿(MPC)和Y -甲基丙烯 酰氧丙基三甲氧基硅(TSMA)，用異丙醇溶解，稱取單體總質(zhì)量1X的引發(fā)劑偶氮二異丁 腈(AIBN)，用少量THF溶解，并與單體溶液混勻，裝入滴液漏斗中。在N2保護(hù)、8(TC恒溫 攪拌下，滴加單體及引發(fā)劑的混合液，在3h內(nèi)滴完。滴加完畢，密封體系反應(yīng)，反應(yīng)進(jìn)行 10h后補(bǔ)加單體總質(zhì)量0. 02%的AIBN的THF溶液，反應(yīng)進(jìn)行24h后停止加熱攪拌。反應(yīng) 液在N2保護(hù)下過濾，濾液旋蒸濃縮后用冷無水乙醚沉淀，沉淀用甲醇溶解、乙醚再次沉淀， 所得沉淀真空干燥，通過^核磁共振測定聚合物P(MPC-co-TSMA)各組分含量。^ NMR， S (CDC13 : CD30D =1:1 (v/v) ， ppm) :0. 7線Si) ， 0. 9 (C迅)，1. 3 (SiCH2, ， 1. 9 (C迅)， 3. 3 (N+線)3) ， 3. 6 (Si (0迅)3) ， 3. 7 (聰2) ， 4. 0-4. 4 (0迅)。由3. 3卯m和0. 7卯m處兩個峰 對MPC組分和TSMA組分分別計(jì)量。當(dāng)MPC和TSMA的投料比分別為9 : 1、8 : 2、7 : 3 和6 : 4(mol%)時，聚合物中兩種組分的物質(zhì)的量比分別為95 : 5、80 : 20、77 : 23、 67 : 33。 實(shí)施例2 : 取實(shí)施例1合成的MPC和TSMA配比為80 : 20的可交聯(lián)聚合物，配成lmg/mL的乙 腈溶液。將溶液噴涂或浸涂到干燥、潔凈的蓋玻片表面，真空干燥后在9(TC下2^三乙胺水 溶液的飽和氣氛中處理lh，得到不溶于水的交聯(lián)涂層。以純水為潤濕介質(zhì)，測試溫度20°C ， 前進(jìn)角和后退角的測試速率皆為0. 05mm/s，表面張力測定閾值5. OOmg，浸入深度10. OOmm， 測試取點(diǎn)頻率5.00Hz，測得前進(jìn)角為45±2° ，后退角為5士r 。 對比試驗(yàn)是真空干燥后，在9(TC純水的飽和氣氛中處理lh，涂層仍然有溶解， 說明交聯(lián)不完全。再于12(TC處理lh，涂層不再溶解，測得前進(jìn)角為52士2。，后退角為 6±2° 。 實(shí)施例3 : 取實(shí)施例1合成的MPC和TSMA配比為90 : 10的可交聯(lián)聚合物，配成2mg/mL的 異丙醇溶液。將溶液浸涂到干燥、潔凈的蓋玻片表面，真空干燥后5(TC在0.8^三甲胺水溶 液的飽和氣氛中處理10h，得到交聯(lián)的仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層。以純水為潤濕介質(zhì)，測試溫 度2(TC，前進(jìn)角和后退角的測試速率皆為0. 05mm/s，表面張力測定閾值5. OOmg，浸入深度 10. 00mm，測試取點(diǎn)頻率5. OOHz，測得前進(jìn)角為41±2° ，后退角為4±2° 。
對比試驗(yàn)是真空干燥后，在5(TC純水的飽和氣氛中處理10h，涂層仍然有溶解， 說明交聯(lián)不完全。再于10(TC處理2h，涂層不再溶解，測得前進(jìn)角為45士2。，后退角為 5±2° 。 實(shí)施例4 : 取實(shí)施例1合成的MPC和TSMA配比為60 : 40的可交聯(lián)聚合物，配成4mg/mL的 甲醇溶液。將溶液浸涂到干燥、潔凈的蓋玻片表面，真空干燥后在含4%氨水溶液的飽和 氣氛中于2(TC處理70h，得到交聯(lián)的仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層。以純水為潤濕介質(zhì)，測試溫 度2(TC，前進(jìn)角和后退角的測試速率皆為0. 05mm/s，表面張力測定閾值5. OOmg，浸入深度 10. OOmm，測試取點(diǎn)頻率5. OOHz，測得前進(jìn)角為52±2° ，后退角為8±2° 。
對比試驗(yàn)是真空干燥后，在2(TC純水的飽和氣氛中處理70h，涂層仍然有溶解，說明交聯(lián)不完全。
實(shí)施例5 : 取實(shí)施例2所制備的仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層，測試靜態(tài)條件下的血小板黏附。涂層在PBS緩沖溶液(稱取NaCl 8. 0g， KC1 0. 2g， Na2HP04 12H202. Og， KH2P04 0. 2g，加蒸餾水溶解，定容到lOOOmL，搖勻，調(diào)節(jié)pH = 7. 4)中浸泡2h，滴加20 y L新制富血小板血漿到涂層中央，37t:下孵育2h，用PBS緩慢淋洗掉黏附不牢固的血小板，然后浸入2. 5%的戊二醛溶液中固定lh，蒸餾水淋洗4 5次，自然晾干，噴金，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察涂層表面黏附血小板黏附的數(shù)量和形態(tài)。如圖l所示，蓋玻片表面大量黏附血小板，且血小板被激活和凝聚；涂覆實(shí)施例2所述仿生涂層的蓋玻片表面未見到血小板黏附。
實(shí)施例6: 取實(shí)施例2所制備的仿生涂層，測試涂層表面的蛋白質(zhì)吸附狀況。測試不同磷酰膽堿基團(tuán)密度的涂層表面分別對牛血清白蛋白(BSA)和牛血清纖維蛋白原(Fg)的吸附狀況，用微量BCA法[Smith P K， Krohn R I， Hermanson G T， et al. Anal. Biochem. ，1985，150,76]進(jìn)行測試。如圖2所示，蓋玻片表面對兩種蛋白的吸附量都很大，涂覆仿生涂層的表面能夠大大抑制兩種蛋白質(zhì)的吸附，涂層表面磷酰膽堿基團(tuán)的密度越大，抑制程度越強(qiáng)。蓋玻片表面BSA和Fg的吸附量分別為O. 76ii g/cm，P 1. 11 y g/cm2 ;而MPC和TSMA組分比例為80 : 20 (mol % )的聚合物涂層表面BSA和Fg的吸附量分別為0. 09 y g/cm2和0. 04 y g/cm o
權(quán)利要求
一種仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將結(jié)構(gòu)通式(I)表示的二元共聚物溶于無水極性有機(jī)溶劑，得到濃度為1～10mg/mL的溶液；其中，m和n對應(yīng)單元的摩爾百分?jǐn)?shù)分別為50～95％和5～50％；R1、R2為H或CH3；R3為甲氧基或乙氧基；(2)用噴涂或浸涂的方法使聚合物在被修飾基材表面形成均勻的涂層；(3)涂層真空干燥之后，在重量百分濃度為0.5～5.0％的氨水或揮發(fā)性有機(jī)胺水溶液的飽和蒸汽中處理1～72小時，處理溫度為20～120℃，得到交聯(lián)固定的仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)親水表面。F2009102191430C0000011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層的制備方法，其特征在于所述無水極 性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇或其混合溶劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層的制備方法，其特征在于所述的揮發(fā)性有機(jī)胺選自三乙胺、三甲胺、乙二胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)涂層的制備方法，包括如下步驟(1)將結(jié)構(gòu)通式(I)表示的二元共聚物溶于無水極性有機(jī)溶劑，得到濃度為1～10mg/mL的溶液；(2)用噴涂或浸涂的方法使聚合物在被修飾基材表面形成均勻的涂層；(3)涂層真空干燥之后，在重量百分濃度為0.5～5.0％的氨水或揮發(fā)性有機(jī)胺水溶液的飽和蒸汽中處理1～72小時，處理溫度為20～120℃，得到交聯(lián)固定的仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)親水表面。在氨水或揮發(fā)性有機(jī)胺水溶液飽和的蒸汽中處理后得到親水性更強(qiáng)、交聯(lián)穩(wěn)定的仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)表面。
文檔編號A61L31/08GK101732766SQ20091021914
公開日2010年6月16日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者宮永寬, 宮銘, 張靜, 楊珊, 梁曉進(jìn), 王彥兵 申請人:西北大學(xué)