一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑，其特征在于：由組分A和組分B組成；所述組分A為側(cè)鏈含有生物素和疏水單元的乙二醇?xì)ぞ厶?glycol chitosan)高分子；所述組分B為接枝有異硫氰酸熒光素FITC的親和素分子。本發(fā)明提供的細(xì)胞膜成像試劑生物相容性好、成像效果優(yōu)良，且能長(zhǎng)時(shí)間保持在細(xì)胞膜上而不被內(nèi)吞，可作為新一類細(xì)胞膜成像試劑。
【專利說明】一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及了一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜熒光成像試劑，還涉及該試劑的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞膜不僅在結(jié)構(gòu)上作為細(xì)胞的邊界，為細(xì)胞提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，同時(shí)對(duì)細(xì)胞與外界環(huán)境之間的物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞過程也起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞膜成像技術(shù)作為一種有力的研究手段，利用熒光染料對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記和示蹤，揭示了包括胞飲、胞吐、細(xì)胞分裂及凋亡在內(nèi)的許多重要的生物學(xué)過程。
[0003]然而，傳統(tǒng)的一些親脂性染料很快會(huì)發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象，成像時(shí)間短，給研究帶來很大的局限。如目前市售的熒光染料Dil、D1及DiD等，有效成像時(shí)間只有10分鐘左右，染料會(huì)逐漸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并將整個(gè)細(xì)胞染色，從而失去了研究細(xì)胞膜的效果。為了延長(zhǎng)有效染色時(shí)間，減少染料內(nèi)吞，已有公司研制出新型染料分子，如CellMask? Orang、DeepRed系列，主要利用帶有負(fù)電荷的親脂性基團(tuán)起錨定作用延長(zhǎng)細(xì)胞膜染色時(shí)間，但染色時(shí)間也只局限在30分鐘至90分鐘。為了更好地對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，開發(fā)一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑就顯得尤為重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種成像時(shí)間長(zhǎng)的細(xì)胞膜成像試劑。
[0005]技術(shù)方案:一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑，其特征在于:由組分A和組分B組成；所述組分A為側(cè)鏈含有生物素(b1tin)和疏水單元的乙二醇?xì)ぞ厶?glycol chitosan);所述組分B為接枝有熒光分子的親和素(avidin)分子。組分A選用乙二醇?xì)ぞ厶亲鳛檫B接生物素和疏水單元的骨架是由于它在任何PH值的水溶液中均有很好的溶解性，并且具有低免疫原性、生物相容性、生物可降解性、生物活性等特點(diǎn)。組分A中的疏水單元可通過疏水相互作用以多位點(diǎn)的方式插入到細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層的疏水尾部區(qū)域，從而將殼聚糖高分子和生物素分子錨定到細(xì)胞膜上。組分B中的親和素通過與生物素特異性結(jié)合，將熒光分子引入到高分子側(cè)鏈，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像。作為優(yōu)選，所述生物素占乙二醇?xì)ぞ厶堑闹貜?fù)單元數(shù)的5-30% ;所述疏水單元占乙二醇?xì)ぞ厶堑闹貜?fù)單元數(shù)的5-30%。
[0006]作為另一種優(yōu)選，所述乙二醇?xì)ぞ厶堑姆肿恿吭?0000以上，優(yōu)選10000-100000。
[0007]作為另一種優(yōu)選，所述生物素包括(+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯(NHS-b1tin，CAS號(hào)35013-72-0);所述生物素通過與氨基反應(yīng)接枝在殼聚糖高分子上，用于與接枝有熒光素分子的親和素分子特異性結(jié)合(即bitoin與avidin的特異性識(shí)別)。
[0008]作為另一種優(yōu)選，所述疏水單元包括膽固醇、磷脂分子、烷烴以及維生素E，用于細(xì)胞膜的錨定；所述疏水單元通過聚乙二醇高分子(PEG)鏈接到乙二醇?xì)ぞ厶堑陌被希栽黾铀苄裕凰銎渲芯垡叶几叻肿?PEG)分子量在500以上。
[0009]作為另一種優(yōu)選，所述熒光分子包括異硫氰酸熒光素或磺基羅丹明B磺酰氯，其通過與氨基反應(yīng)接枝在親和素分子表面。
[0010]本發(fā)明還提供了上述長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑的制備方法，包括以下步驟:
[0011](I)將生物素、疏水單元和乙二醇?xì)ぞ厶欠謩e溶于PBS緩沖液中，混勻，室溫反應(yīng)；產(chǎn)物透析、凍干，即得組分A ;
[0012](2)將異硫氰酸熒光素和親和素溶液混勻使反應(yīng)；產(chǎn)物透析、凍干，即得組分B。
[0013]有益效果:本發(fā)明提供的細(xì)胞膜成像試劑生物相容性好、成像效果優(yōu)良，且能長(zhǎng)時(shí)間保持在細(xì)胞膜上而不被內(nèi)吞，可作為新一類細(xì)胞膜成像試劑。
[0014]具體而言，本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下突出的優(yōu)勢(shì):
[0015](I)本發(fā)明提供的試劑生物相容性好、成像效果優(yōu)良，且能長(zhǎng)時(shí)間保持在細(xì)胞膜上而不被內(nèi)吞，其利用膽固醇修飾殼聚糖高分子側(cè)鏈進(jìn)行多位點(diǎn)錨定，形成一層高分子成像基底，再利用生物素與親和素的特異性結(jié)合引入熒光分子，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)18小時(shí)的高質(zhì)量細(xì)胞膜成像。
[0016](2)本發(fā)明采用膽固醇修飾殼聚糖高分子側(cè)鏈，由于膽固醇在細(xì)胞膜上可以進(jìn)行插入，起到對(duì)高分子錨定的作用，多個(gè)膽固醇分子更是增加了錨定的效率。因此組分A作為成像基底可以很快將細(xì)胞膜包圍，將接枝在殼聚糖高分子上的多個(gè)生物素分子暴露出來，用于之后與帶熒光分子的親和素分子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的成像。這種“多位點(diǎn)錨定”并結(jié)合“雙重包覆”的策略,可以極大地提高成像質(zhì)量和成像時(shí)間；實(shí)驗(yàn)顯示,該成像試劑對(duì)細(xì)胞染色18小時(shí)后也沒有明顯內(nèi)吞現(xiàn)象發(fā)生。
[0017](3)本發(fā)明采用生物素與親和素之間的高特異性穩(wěn)固結(jié)合，使熒光分子得以長(zhǎng)時(shí)間包圍在細(xì)胞膜表面而不被內(nèi)吞。此外，由于生物素與親和素的結(jié)合效率極高，可大大節(jié)省了染色時(shí)間。親和素作為生物大分子也在一定程度上保證了熒光分子不易被內(nèi)吞。
[0018](4)本發(fā)明試劑的組成成分殼聚糖、PEG、生物素以及親和素都具備良好的生物相容性，而且起錨定作用的膽固醇更是動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜固有成分，因此該試劑對(duì)細(xì)胞的毒性低。組分A在100 μ g/mL以下，組分B在200 μ g/mL以下，MTT實(shí)驗(yàn)顯示該成像試劑對(duì)細(xì)胞活力幾乎無影響，從而證明了該試劑良好的生物相容性。
[0019](5)本發(fā)明試劑的殼聚糖高分子上剩余的氨基帶有的正電荷，會(huì)與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜發(fā)生靜電相互作用，增加與細(xì)胞膜的親和力，因而進(jìn)一步延長(zhǎng)了染料在細(xì)胞膜上的保持時(shí)間。
[0020](6)本發(fā)明試劑可作為一種細(xì)胞膜長(zhǎng)時(shí)間染色的應(yīng)用平臺(tái)，通過替換不同的熒光分子可以實(shí)現(xiàn)多種顏色的熒光成像。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜熒光成像試劑的分子結(jié)構(gòu)圖。
[0022]圖2為本發(fā)明的細(xì)胞膜熒光成像試劑對(duì)A549肺癌細(xì)胞生存活力的影響評(píng)價(jià)試驗(yàn)(MTT試驗(yàn)，其中殼聚糖及組分A濃度均為100 μ g/mL,組分B濃度為200 μ g/mL)；
[0023]圖3(a) ,3(b) ,3(c)分別為本發(fā)明的細(xì)胞膜熒光成像試劑對(duì)A549肺癌細(xì)胞細(xì)胞膜染色I(xiàn)小時(shí)、8小時(shí)及18小時(shí)后的效果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1
[0025]長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜突光成像試劑(組分A Khitosan-1O1^ cholesterol-10 % b1tin以及組分B:avidin-FITC)的設(shè)計(jì)、合成和細(xì)胞膜熒光染色方法如下:
[0026]試劑的設(shè)計(jì):所述成像試劑的分子結(jié)構(gòu)圖見圖1，該試劑由兩種組分構(gòu)成:組分A以乙二醇?xì)ぞ厶歉叻肿?glycol chitosan)為骨架，側(cè)鏈含有10%的聚乙二醇2000-膽固醇(PEG2000-cholesterol)疏水單元和10%的生物素分子(b1tin);組分B由接枝有異硫氰酸熒光素FITC的親和素(avidin)構(gòu)成。所述的乙二醇?xì)ぞ厶歉叻肿?，具有良好的生物相容性和水溶性。所述的膽固醇疏水?cè)鏈，通過分子量在500以上的PEG2000連接到殼聚糖氨基上，即NHS-PEG2000-cholesterol，增加水溶性。所述的FITC熒光分子，經(jīng)過與氨基反應(yīng)連接到親和素分子上。膽固醇疏水單元可通過疏水相互作用多位點(diǎn)地插入細(xì)胞膜，將高分子骨架錨定在細(xì)胞膜上；隨后，通過生物素與親和素高親和力的牢固結(jié)合將熒光分子接枝在高分子上，作為熒光成像單元。
[0027]試劑的合成，包括以下步驟:
[0028](I)組分A的制備:以N-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇2000-膽固醇(NHS-PEG2000-cholesterol)、(+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯(NHS-B1tin)以及分子量大于10000的乙二醇?xì)ぞ厶歉叻肿訛樵?，合成疏水單元占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比為10%、生物素分子占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比為10%的組分A，即chitosan-10%cholesterol-10 % b1tin0 具體為:分別稱取 16mg NHS-PEG2000-cholesterol> 15.2mgglycol chitosan(聚合度:大于400 ;分子量約80000)以及2.5mg NHS-B1tin,將三者分別溶于PBS緩沖液(pH 7.4，50mM)，迅速混合均勻后，在搖床中室溫下反應(yīng)過夜；反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為1k的透析袋透析3天進(jìn)行純化，最后在凍干機(jī)中凍干制成組分A:chitosan-10% cholesterol-10 % b1tin ；
[0029](2)組分B的制備:將5mg的avidin溶于2.5mL pH = 9.5的碳酸鈉_碳酸氫鈉緩沖溶液；取FITC并溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，配制成濃度2mg/mL的FITC溶液；向avidin溶液中加入250 μ L的FITC溶液，混合均勻后，于4°C冰箱中反應(yīng)過夜；反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量2k的透析袋透析三天除去未反應(yīng)的FITC進(jìn)行純化，最后在凍干機(jī)中冷凍干燥制得組分 B:avidin-FITCo
[0030]組分A及組分B均于-20°C中冷凍保存。
[0031]細(xì)胞膜染色成像實(shí)驗(yàn):將組分A與組分B分別溶于細(xì)胞培養(yǎng)用PBS制成lmg/mL的儲(chǔ)存液，并用0.45 μ m的無菌過濾頭進(jìn)行過濾除去細(xì)菌制得工作液。A549肺癌細(xì)胞在共聚焦培養(yǎng)板上培養(yǎng)12小時(shí)后，先吸去原有培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，再加入2mL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM不完全培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素雙抗)。先加入組分A200 μ L并放回二氧化碳培養(yǎng)箱孵育30分鐘，隨后吸出培養(yǎng)板中液體并PBS清洗I次，換入DMEM完全培養(yǎng)基；再加入400 μ L組分B于培養(yǎng)箱中孵育10分鐘，染色結(jié)束后PBS清洗3次，重新加入DMEM完全培養(yǎng)基并將細(xì)胞置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，并每隔一定時(shí)間跟蹤觀察細(xì)胞膜染色情況。
[0032]染色結(jié)果:圖3(a) ,3(b) ,3(c)分別為染色I(xiàn)小時(shí)、8小時(shí)及18小時(shí)后細(xì)胞膜成像圖；可見細(xì)胞膜被均勻地標(biāo)記上綠色熒光，隨著染色時(shí)間的延長(zhǎng)并沒有發(fā)生明顯內(nèi)吞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞膜長(zhǎng)時(shí)間熒光成像。
[0033]實(shí)施例2
[0034]本實(shí)施例的實(shí)施方法與實(shí)施例1中的方法一致，只是選用的乙二醇?xì)ぞ厶歉叻肿臃肿恿考s10000，NHS-PEG2000-cholesterol分子中的膽固醇疏水單元依次改成磷脂分子(1，2-肉豆蘧酰基磷脂酰乙醇胺，DMPE)、烷烴(十八個(gè)碳原子，C18)或者維生素E等疏水側(cè)鏈，合成得到三種細(xì)胞膜熒光成像試劑。
[0035]實(shí)施例3
[0036]為了實(shí)現(xiàn)其他顏色的細(xì)胞膜熒光成像，本實(shí)施例的實(shí)施方法與實(shí)施例1中的方法類似，，只是選用的乙二醇?xì)ぞ厶歉叻肿臃肿恿考s100000，將實(shí)施例1中的熒光分子FITC替換成為磺基羅丹明B磺酰氯熒光試劑，實(shí)施方法與實(shí)施例1中方法一致。
[0037]實(shí)施例4
[0038]本實(shí)施例的實(shí)施方法與實(shí)施例1中的方法類似，只是成像試劑組分A中的錨定單元占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比改為30%，生物素單元占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比改為5%,所制得的成像試劑組成為 chitosan-30% cholesterol-5% b1tin。
[0039]實(shí)施例5
[0040]本實(shí)施例的實(shí)施方法與實(shí)施例1中的方法類似，只是成像試劑組分A中的錨定單元占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比改為5%，生物素單元占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比改為30%,所制得的成像試劑組成為 chitosan-5% cholesterol-30% b1tin。
【權(quán)利要求】
1.一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑，其特征在于:由組分A和組分B組成；所述組分A為側(cè)鏈含有生物素和疏水單元的乙二醇?xì)ぞ厶歉叻肿?；所述組分B為接枝有熒光分子的親和素分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑，其特征在于:所述生物素占組分A的乙二醇?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的5-30% ;所述疏水單元占組分A的乙二醇?xì)ぞ厶歉叻肿又貜?fù)單元數(shù)的5-30%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑，其特征在于:所述乙二醇?xì)ぞ厶欠肿恿吭?0000以上，優(yōu)選10000-100000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑，其特征在于:所述生物素包括(+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯；所述生物素通過與氨基反應(yīng)接枝在殼聚糖高分子上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑，其特征在于:所述疏水單元包括膽固醇、磷脂分子、烷烴和維生素E ;所述疏水單元通過聚乙二醇高分子鏈接到乙二醇?xì)ぞ厶堑陌被希凰銎渲芯垡叶几叻肿臃肿恿吭?00以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑，其特征在于:所述熒光分子包括異硫氰酸熒光素或磺基羅丹明B磺酰氯，其通過與氨基反應(yīng)接枝在親和素分子表面。
7.一種長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞膜成像試劑的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將生物素、疏水單元和乙二醇?xì)ぞ厶欠謩e溶于PBS緩沖液中，混勻，室溫反應(yīng)；產(chǎn)物透析、凍干，即得組分A ; (2)將異硫氰酸熒光素和親和素溶液混勻使反應(yīng)；產(chǎn)物透析、凍干，即得組分B。
【文檔編號(hào)】C08B37/08GK104316500SQ201410485961
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】吳富根, 賈浩然, 王宏銀 申請(qǐng)人:東南大學(xué)