專利名稱：發(fā)卡形探針基因芯片及其制備方法和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基因芯片，以及它的制備方法，和利用該基因芯片進行基因檢測的方法。
背景技術(shù)：
與基因有關(guān)的研究是現(xiàn)代生命科學(xué)研究中的一個重要領(lǐng)域。人類基因組計劃和其他基因測序計劃的完成，為與生命、醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究，如基因工程、疾病的診斷和治療、新藥的開發(fā)，奠定了基礎(chǔ)。為了這些后續(xù)的工作，同時需要發(fā)展新的生物技術(shù)，基因芯片就是其中的一個例子。
基因芯片的一種類型是將已知序列的寡聚核酸(以下稱作探針)固化在表面上，通過雜交實驗，檢測被測樣品中的寡聚核酸(基因片段)的堿基序列(定性分析)或檢測某些寡聚核酸堿基序列的含量(定量分析)。
檢測的方法包括熒光、電化學(xué)、交流阻抗、石英晶體微天平、同位素標記、表面等離子體共振、質(zhì)譜、酶標法等。其中應(yīng)用最多的是熒光檢測方法。
所有檢測方法可以劃分為兩類一類需要對探針或樣品進行標記，如熒光、同位素標記、酶標法，稱為有標記法；另一類不需要對探針或樣品進行標記，如交流阻抗、石英晶體微天平、表面等離子體共振、質(zhì)譜法，稱為無標記法。有些檢測方法可以分別設(shè)計成有標記法和無標記法，如電化學(xué)方法。
1996年，Tyagi和Kramer[見文獻S.Tyagi，and F.R.Kramer，NatureBiotechnology，14303(1996)]提出將具有發(fā)卡形結(jié)構(gòu)、同時作了熒光和淬滅基團標記的探針(稱為分子信標)作為DNA雜交的檢測工具。這一新穎的設(shè)計，立即引起世人的注目，在生物技術(shù)(如PCR)中得到迅速的推廣和應(yīng)用。
在將分子信標固化到表面以應(yīng)用于DNA傳感器的研究方面，有人進行了有益的嘗試[見文獻J.Li，et al.，Ana.Sci.171149(2001)；X.J.Liu，and W.H.Tan，Ana.Chem.71.5054(1999)；W.H.Tan，et al.，Chemistry-a European Journal，61107(2000)；X.H.Fang，and W.H.Tan，Ana.Chem.713101(1999)；X.H.Fang，et al.，J.Am.Chem.Soc.1212921(1999)]。但是，分子信標不僅不能克服以前熒光標記方法價格昂貴的缺點，而且使制作成本更為增加。
1995年，Linford和Chidsey等人[見文獻M.R.Linford，et al.，J.Am.Chem.Soc.1173145(1995)]發(fā)現(xiàn)可以通過加熱引發(fā)單晶硅表面的Si-H鍵與有機長鏈端點的C＝C雙鍵的加成反應(yīng)，在硅表面形成穩(wěn)定、致密的有機膜，并且后來發(fā)現(xiàn)[見文獻P.Wagner，et al.J.Struct.Biol.119189(1997)，T.Strother，et.al.Nuclear AcidsResearch，283535(2000)；T.Strother，et al.，J.Am.Chem.Soc.1221205(2000)]紫外光照同樣可以用來制備有機膜，進而可以將寡聚核酸連接到硅表面的有機膜上。此后，有許多關(guān)于硅表面有機膜性質(zhì)的研究，包括本第一發(fā)明人參與和從事的一些研究[本第一發(fā)明人參與的工作見文獻T.Strother，et al.，J.Am.Chem.Soc.1221205(2000)；吳瑞閣等，物理化學(xué)學(xué)報17931(2001)]。
還有在表面寡聚核酸雜交的無標記法檢測技術(shù)中的交流阻抗測量方法[見文獻E.Souteyrand，et al.，J.Phys.Chem.B 1012980(1997)；H.Bemey，et al.，Sensorsand Actuators B 68100(2000)；C.Berggren，et al.，Electroanalysis 11156(1999)]。這一方法測量的是寡聚核酸雜交前后表面介電性質(zhì)的改變，測量過程簡單、條件溫和，測量成本低，不會損傷芯片，而且不需要對寡聚核酸進行任何標記。
雖然目前已經(jīng)有公司生產(chǎn)商品化的基因芯片，但是這些產(chǎn)品都存在著明顯的缺點成本昂貴、重復(fù)性差、穩(wěn)定性差。
特別是，目前所有基因芯片技術(shù)的一個共同的根本性的問題在于特異性差如何在檢測中將只在一個位點上的堿基有差別的兩個寡聚核酸序列(即所謂完全匹配與單點錯配的兩個寡聚核酸序列)區(qū)別開，是一個技術(shù)難題。
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)寡聚核酸序列中單點突變的識別、成本低、穩(wěn)定性好、可以重復(fù)使用的基因芯片。
本發(fā)明的另一目的還在于提供一種制備上述基因芯片的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種利用上述基因芯片進行基因檢測的方法。
本發(fā)明的發(fā)卡形探針基因芯片包括芯片基底和固化在其上的寡聚核酸探針，至少有一個寡聚核酸探針包括探測區(qū)，存在一段或若干段由被檢測樣品的基因序列決定的寡聚核酸序列；莖桿區(qū)，存在一段或若干段寡聚核酸序列以及與該序列相匹配的寡聚核酸序列，莖桿區(qū)中的寡聚核酸序列和與其匹配的寡聚核酸序列形成發(fā)卡形雙鏈結(jié)構(gòu)。莖桿區(qū)的核酸的匹配方式和堿基數(shù)目滿足下述條件發(fā)卡形寡聚核酸探針的解鏈溫度，即在發(fā)卡形寡聚核酸探針不與任何寡聚核酸序列雜交而單獨存在的狀態(tài)的解鏈溫度在發(fā)卡形寡聚核酸探針的探測區(qū)和單點錯配樣品所處的雜交狀態(tài)，即單點錯配雜交狀態(tài)的解鏈溫度-5℃，到發(fā)卡形寡聚核酸探針的探測區(qū)和完全匹配樣品所處雜交狀態(tài)，即完全匹配雜交狀態(tài)的解鏈溫度+5℃的范圍之間。
本發(fā)明的基因芯片的發(fā)卡形寡聚核酸探針為無標記探針。芯片基底表面覆蓋一到若干分子層的電絕緣和電化學(xué)惰性的材料膜。發(fā)卡形寡聚核酸探針化學(xué)鍵合于芯片基底表面。
本發(fā)明的制備上述發(fā)卡形探針基因芯片的方法，其步驟包括1、設(shè)計、合成寡聚核酸探針，設(shè)計合成后的寡聚核酸探針具有如下結(jié)構(gòu)存在一段或若干段由被檢測樣品的基因序列決定的寡聚核酸序列，稱為探測區(qū)；存在一段或若干段寡聚核酸序列以及與該序列相匹配的寡聚核酸序列，稱為莖桿區(qū)；莖桿區(qū)中的寡聚核酸序列和與其匹配的寡聚核酸序列形成發(fā)卡形雙鏈結(jié)構(gòu)；根據(jù)雜交實驗中樣品寡聚核酸序列按照下述要求設(shè)計發(fā)卡形探針的莖桿區(qū)的核酸的匹配方式和堿基數(shù)目發(fā)卡形寡聚核酸探針的解鏈溫度，在單點錯配雜交狀態(tài)的解鏈溫度-5℃到完全匹配雜交狀態(tài)的解鏈溫度+5℃的范圍之間。
2、將至少一個發(fā)卡形寡聚核酸探針固化在芯片基底表面上。
所述的寡聚核酸探針為無標記寡聚核酸探針。芯片基底表面覆蓋一到若干分子層的電絕緣和電化學(xué)惰性的材料膜。本發(fā)明將至少一個發(fā)卡形寡聚核酸探針化學(xué)鍵合于芯片基底表面上。
本發(fā)明的利用上述基因芯片進行基因檢測的方法，芯片基底采用導(dǎo)電基底，其步驟包括1、對基底施加電位控制；2、調(diào)節(jié)基底的表面電位，監(jiān)測不同電位下的探針與被探測樣品的雜交過程；3、根據(jù)監(jiān)測結(jié)果確定該基因芯片對該類被探測樣品的最佳雜交條件；4、在最佳條件下檢測該類被探測樣品，實現(xiàn)該基因芯片對該類被探測樣品完全匹配與單點錯配的寡聚核酸序列的識別。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果A)利用化學(xué)反應(yīng)將無標記發(fā)卡形探針固化到電極，無標記發(fā)卡形探針在電極表面上的分布均勻，不同批次制備的芯片重復(fù)性能良好，同一芯片可以反復(fù)使用。這樣可以大大減少平均每一次檢測的成本。傳統(tǒng)芯片技術(shù)中存在的成本昂貴、重復(fù)性差、穩(wěn)定性差的問題得到改善。本發(fā)明的無標記發(fā)卡形探針和樣品都無須進行任何標記，加之芯片可以重復(fù)使用的特點，制作和使用成本都會大大降低。
B)利用本發(fā)明獲得對完全匹配和單點錯配的寡聚核酸序列的識別圖1分別顯示接有無標記發(fā)卡形探針的芯片表面與完全匹配的寡聚核酸序列樣品雜交(正方形數(shù)據(jù)點)、接有無標記發(fā)卡形探針的芯片表面與單點錯配的寡聚核酸序列樣品雜交(三角形數(shù)據(jù)點)、沒有鍵合任何寡聚核酸序列鏈的電極表面(菱形數(shù)據(jù)點)、以及鍵合了無標記發(fā)卡形探針的芯片表面但沒有進行任何寡聚核酸雜交(圓形數(shù)據(jù)點)四種情況下的Mott-Schottky測量結(jié)果。結(jié)果顯示，接有無標記發(fā)卡形探針的芯片表面與完全匹配的寡聚核酸序列雜交時具有與接有無標記發(fā)卡形探針的芯片表面與單點錯配的寡聚核酸序列雜交、沒有鍵合任何寡聚核酸序列鏈的電極表面、鍵合了無標記發(fā)卡形探針但沒有進行任何寡聚核酸雜交的另外三種情況表現(xiàn)出完全不同的性質(zhì)。特別注意，后三種情況的結(jié)果完全重合在一起，表明本發(fā)明具有識別完全匹配和單點錯配的寡聚核酸序列的能力。本發(fā)明實現(xiàn)識別的原理在于在滿足本發(fā)明設(shè)計要求的情況下，有關(guān)分子的自由能(前述三種解鏈溫度與這些自由能有關(guān))的數(shù)值適當，使得探針與完全匹配的寡聚核酸序列的結(jié)合狀態(tài)是穩(wěn)定的(因此能形成雜交雙鏈)，而與單點錯配的寡聚核酸序列的結(jié)合狀態(tài)是不穩(wěn)定的(因此不能形成雜交雙鏈)。
C)利用本發(fā)明，可以在上述B)的基礎(chǔ)上，通過表面電位進一步對芯片表面性質(zhì)進行調(diào)節(jié)，獲得對完全匹配和單點錯配的寡聚核酸序列識別的最佳條件。因為當電位施加到電極之后，表面的各種形態(tài)的寡聚核酸分子的自由能會隨電位的不同而改變，由此造成相應(yīng)的解鏈溫度的改變。不同形態(tài)的寡聚核酸自由能隨電位變化的變化率不同，因此解鏈溫度的改變不同。這樣經(jīng)電位控制而調(diào)節(jié)到發(fā)卡形寡聚核酸探針的解鏈溫度，在單點錯配雜交狀態(tài)的解鏈溫度和完全匹配雜交狀態(tài)的解鏈溫度之間的最佳值，從而獲得對完全匹配和單點錯配的寡聚核酸序列的最佳識別。
圖2顯示實時檢測雜交過程的結(jié)果。結(jié)果顯示，通過對無標記發(fā)卡形探針的設(shè)計，再選擇適當?shù)谋砻骐娢?圖中為-0.7V)，就可以達到在相同雜交條件下芯片對寡聚核酸序列的完全匹配和單點錯配的雜交過程的識別，即芯片對完全匹配的寡聚核酸序列的樣品有響應(yīng)，而對單點錯配的樣品沒有可觀測到的響應(yīng)。圖2同時顯示芯片可以重復(fù)使用。


圖1 不同芯片表面的Mott-Schottky作圖的性質(zhì)對比圖菱形數(shù)據(jù)點來自于在硅基底上接了一層12碳羧酸膜的芯片表面(I)，圓形數(shù)據(jù)點來自于在上述表面(I)上接了無標記發(fā)卡形探針的芯片表面(II)，正方形數(shù)據(jù)點來自于為上述表面(II)與完全匹配的寡聚核酸序列雜交后的芯片表面(III)，三角形數(shù)據(jù)點來自于上述表面(II)與單點錯配的寡聚核酸序列雜交后的芯片表面(IV)。本圖顯示完全匹配的芯片表面(III)具有與其它表面[(I)、(II)、(IV)]不同的性質(zhì)。表面(I)、(II)、(IV)的結(jié)果重合，表面(III)的結(jié)果與其它表面截然不同。
圖2 同一個接有無標記發(fā)卡形探針的基因芯片在不同電位下反復(fù)進行雜交實驗的實時觀察示意圖在400秒時加入單點錯配的寡聚核酸序列樣品，在700秒時加入完全匹配的寡聚核酸序列樣品。當電位選擇適當時，芯片只對加入完全匹配的寡聚核酸序列樣品有響應(yīng)。該圖同時顯示芯片可以重復(fù)使用。
圖3 交流阻抗測量池示意圖1--工作電極2--金屬 3--氮氣通道4--芯片5--參比電極6--對電極7--聚四氟乙烯電化學(xué)池其中接了無標記發(fā)卡形探針的芯片構(gòu)成工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑做為對電極。
圖4發(fā)卡形探針基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖11--導(dǎo)體或半導(dǎo)體基底 12--電絕緣層 13--莖桿區(qū) 14--探測區(qū)實施例按照現(xiàn)有方法[見物理化學(xué)學(xué)報17931(2001)“硅表面上構(gòu)筑具有化學(xué)特性的圖形的新方法”，吳瑞閣等]制備得到以羧基終止的單層有機膜覆蓋的p-硅表面。選擇人體癌癥抑制基因p53的一段寡聚核酸序列為被測樣品。研究表明，在p53中有多個位點都可能因發(fā)生單點突變而引發(fā)癌癥。這里選擇的被檢測的一段正常基因序列為(用219表示)5′-GGC ATG AAC CGG AGG-3′，單點突變的致癌序列為(用220表示)5′-GGC ATG AAC TGG AGG-3′，其中黑體并斜體有下劃線的堿基為發(fā)生突變位置的堿基。設(shè)計的無標記發(fā)卡型探針的堿基序列為5′-GCGAGC CCT CCG GTT CAT GCC GCTCGC-(CH2)6-NH2-3′，其中下劃線的堿基為莖桿區(qū)，探測區(qū)的堿基序列與正?；蛐蛄型耆ヅ?。計算得到的解鏈溫度為Tm(單點錯配雜交)＝58℃，Tm(無標記發(fā)卡形探針)＝67℃，Tm(完全匹配雜交)＝66℃。利用無標記發(fā)卡形探針的-NH2基團與有機膜的羧基之間的縮合反應(yīng)形成的肽鍵將無標記發(fā)卡形探針固化到硅表面有機膜上[10 mM EDAC/10mM NHS(MES buffer，pH＝6.5)活化，固定反應(yīng)4℃ 4小時]，制得接有無標記發(fā)卡形探針的芯片?？梢杂脙煞N方式來識別完全匹配和單點錯配的基因片段第一種，在不同電極電位下測量Mott-Schottky作圖的性質(zhì)。首先被測樣品與芯片雜交[被測樣品的20mM Tris-HCl+100mM MgCl2，pH＝8.1緩沖溶液滴加在芯片表面，37℃下反應(yīng)6小時]。芯片清洗[2×SSPE，37℃，然后超純水]后，以20mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH＝8.1溶液為支持電解質(zhì)，利用如圖3所示的阻抗檢測池，除氧情況下，利用電化學(xué)工作站(商品，CHI660A，上海)在15kHz到45kHz之間5mV交流電壓下進行不同電極電位(V)下表面電容(Cs)的測量，將(Cs)-2對V作圖，得Mott-Schottky圖。同時做一芯片液單純雜交緩沖溶液的對比實驗。識別結(jié)果如圖1所示。完全匹配樣品的Mott-Schottky圖與對比實驗的不同，單點錯配樣品的Mott-Schottky圖與對比實驗的重合。
第二種，在某一最佳電極電位下實時觀察雜交過程。利用圖3所示的阻抗檢測池，利用電化學(xué)工作站(商品，CHI660A，上海)，除氧情況下，在20mMTris-HCl+100mM MgCl2，pH＝8.1緩沖溶液下滴加被測樣品，直接觀察雜交過程。為此首先用的已知的完全匹配和單點錯配標準溶液的實驗找到識別的最佳電極電位。在本實施例中為-0.7V。在25kHz 5mV交流電壓和最佳電極電位(-0.7V)下，隨著被測樣品的加入，檢測表面電容(Cs)。當加入單點錯配的樣品時，電容沒有躍變，當加入完全匹配的樣品時，電容發(fā)生躍變。結(jié)果如圖2中第一幅圖(-0.7V)所示。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)卡形探針基因芯片，包括芯片基底和固化在其上的寡聚核酸探針，至少有一個寡聚核酸探針包括探測區(qū)，存在一段或若干段由被檢測樣品的基因序列決定的寡聚核酸序列，其特征在于該寡聚核酸探針還包括莖桿區(qū)，存在一段或若干段寡聚核酸序列以及與該序列相匹配的寡聚核酸序列，莖桿區(qū)中的寡聚核酸序列和與其匹配的寡聚核酸序列具有發(fā)卡形雙鏈結(jié)構(gòu)；莖桿區(qū)的核酸的匹配方式和堿基數(shù)目滿足下述條件發(fā)卡形寡聚核酸探針的解鏈溫度，在單點錯配雜交狀態(tài)的解鏈溫度-5℃，到完全匹配雜交狀態(tài)的解鏈溫度+5℃的范圍之間。
2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)卡形探針基因芯片，其特征在于所述發(fā)卡形寡聚核酸探針為無標記探針。
3.如權(quán)利要求1所述的發(fā)卡形探針基因芯片，其特征在于芯片基底表面覆蓋一到若干分子層的電絕緣和電化學(xué)惰性的材料膜。
4.如權(quán)利要求1所述的發(fā)卡形探針基因芯片，其特征在于發(fā)卡形寡聚核酸探針化學(xué)鍵合于芯片基底表面。
5.一種制備如權(quán)利要求1所述的發(fā)卡形探針基因芯片的方法，其步驟包括1)設(shè)計、合成寡聚核酸探針，設(shè)計合成后的寡聚核酸探針至少有一個具有如下結(jié)構(gòu)存在一段或若干段由被檢測樣品的基因序列決定的寡聚核酸序列，稱為探測區(qū)；存在一段或若干段寡聚核酸序列以及與該序列相匹配的寡聚核酸序列，稱為莖桿區(qū)；莖桿區(qū)中的寡聚核酸序列和與其匹配的寡聚核酸序列形成發(fā)卡形雙鏈結(jié)構(gòu)；根據(jù)被檢測樣品寡聚核酸序列，按照下述要求設(shè)計發(fā)卡形探針的莖桿區(qū)的核酸的匹配方式和堿基數(shù)目發(fā)卡形寡聚核酸探針的解鏈溫度，在單點錯配雜交狀態(tài)的解鏈溫度-5℃到完全匹配雜交狀態(tài)的解鏈溫度+5℃的范圍之間；2)將至少一個發(fā)卡形寡聚核酸探針固化在芯片基底表面上。
6.如權(quán)利要求5所述的制備發(fā)卡形探針基因芯片的方法，其特征在于所述的寡聚核酸探針為無標記寡聚核酸探針。
7.如權(quán)利要求5所述的制備發(fā)卡形探針基因芯片的方法，其特征在于在芯片基底表面覆蓋一到若干分子層的電絕緣和電化學(xué)惰性的材料膜。
8.如權(quán)利要求5所述的制備發(fā)卡形探針基因芯片的方法，其特征在于將至少一個發(fā)卡形寡聚核酸探針化學(xué)鍵合于芯片基底表面上。
9.一種利用權(quán)利要求1所述發(fā)卡形探針基因芯片進行基因檢測的方法，芯片基底采用導(dǎo)電基底，其步驟包括1)對芯片基底施加電位控制；2)調(diào)節(jié)芯片基底的表面電位，監(jiān)測不同電位下的寡聚核酸探針與被探測樣品的雜交過程；3)根據(jù)監(jiān)測結(jié)果確定該基因芯片對該類被探測樣品的最佳雜交條件；4)在最佳條件下檢測該類被探測樣品，實現(xiàn)該基因芯片對該類被探測樣品完全匹配與單點錯配的寡聚核酸序列的識別。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因芯片,包括芯片基底和固化在其上的寡聚核酸探針,探針包括探測區(qū)和莖桿區(qū);莖桿區(qū)中的寡聚核酸序列和與其匹配的寡聚核酸序列形成發(fā)卡形雙鏈結(jié)構(gòu),其核酸的匹配方式和堿基數(shù)目滿足下列條件:發(fā)卡形寡聚核酸探針的解鏈溫度,在單點錯配雜交狀態(tài)的解鏈溫度－5℃到完全匹配雜交狀態(tài)的解鏈溫度+5℃的范圍之間。本發(fā)明可通過對該基因芯片進行電位控制進一步優(yōu)化雜交條件。本發(fā)明基因芯片和樣品都無須作任何標記,芯片可以重復(fù)使用,制作和使用成本大大降低,且具有識別完全匹配和單點錯配的寡聚核酸序列的能力?？蓮V泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1373228SQ0211630
公開日2002年10月9日 申請日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者趙新生, 魏芳, 孫豳 申請人:北京大學(xué)