專利名稱：一種定量檢測趨化因子表達水平的方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及一種定量檢測趨化因子LARC表達水平的方法，和構成本發(fā)明方法的關鍵內對照質粒。
背景技術：
隨著PCR(Polymerase Chain Reaction)技術在基礎研究、臨床診斷等各個領域的廣泛應用，人們逐漸意識到僅僅停留在PCR的定性應用上的諸多局限性。生命科學研究，已超出了最初“有/無”的簡單的定性范圍，而需要更精準的“多/少”的定量概念。以HIV、HBV、HCV等病毒研究為例，定量PCR檢測病毒基因，可協(xié)助判斷潛伏的感染者及無癥狀攜帶者的情況，并可從測定結果來判斷藥物的治療效果、推測復發(fā)的可能性；至于mRNA的RT-PCR定量更能進一步反映病毒的轉錄水平、活動性、復制性等指標。
LARC(Liver and Activation-Regulated Chemokine)是1997年日本學者Hieshima發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個新的CC類趨化蛋白。LARC在生理狀態(tài)下在人肝臟中有一定水平的表達，是肝臟中的一看家趨化蛋白；LARC可趨化活化T淋巴細胞、記憶T淋巴細胞、B淋巴細胞等免疫活性細胞表面，在乙肝病毒感染的病毒特異性細胞免疫，尤其是CTL殺傷肝細胞、清除病毒的免疫應答過程中有重要的角色。LARC的表達水平與其相關疾病如乙型肝炎的免疫狀態(tài)、轉歸、預后等的判斷具有重要意義。由于LARC與大多數(shù)趨化蛋白一樣，具有瞬時分泌、含量微弱、局部表達、而不進入循環(huán)等的特點，無法用傳統(tǒng)的定量方法對其進行精確的定量，所以，需要建立一個良好的分子水平的定量系統(tǒng)，對LARC轉錄及翻譯進行較為準確的定量，用較為精準的量化概念反映該分子的表達水平。
目前常用的對趨化因子進行定量的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫組織化學實驗和定量RT-PCR/PCR法等。其中ELISA方法較為迅速簡便，但需要體液如血清、分泌物等為檢測對象，且精確度和敏感性較差，而趨化蛋白恰恰又是一種分泌水平相對微弱的蛋白質，這勢必限制了該方法的應用。免疫組化實驗能直觀地對趨化蛋白的表達進行定位、定量研究，但對抗體的要求較高、且僅局限于對一些胞內分泌型趨化蛋白的檢測，而大多數(shù)趨化蛋白往往具有廣泛彌散性分泌的特點。定量PCR技術是根據(jù)PCR的產(chǎn)物量來推斷其原始模板量的方法。常用的定量方法主要有外標法(external standard)、內標法(internal standard)和實時熒光法(real time)三種。外標法具有操作簡便、快速等特點，但由于PCR反應是一指數(shù)變化過程，反應過程中任一參數(shù)如模板起始量、引物濃度、DNA聚合酶活性、反應溫度、循環(huán)時間、循環(huán)數(shù)等的微小變化都會顯著改變終產(chǎn)物的量，反應前幾個循環(huán)的不均一性、各反應管不同的升降溫效率等將造成無法避免的管間差異，使定量結果的可靠性大為降低。內標法是在定量系統(tǒng)中設立內參照，將參照基因與待測基因在同一反應管內共同進行擴增，這樣可在很大程度上消除“管間差異”帶來的誤差。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是建立能對LARC轉錄及翻譯水平進行相對精確的定量cQRT-PCR系統(tǒng)，用較為準確的量化概念反映LARC的表達水平。
本發(fā)明通過構建含有與LARC特異性引物互補序列的特定內參照質粒，以同一對引物在同一反應管中競爭擴增LARC，從而對LARC的表達水平進行定量，建立了定量檢測趨化因子LARC表達水平的cQRT-PCR技術。并通過對已知量的LARC水平、HBV不同感染狀態(tài)下體外培養(yǎng)細胞及病人活檢肝組織標本中LARC表達量的研究和測定，驗證了本方法具備了較高的可靠性和準確性。
本發(fā)明的技術方案是通過以下步驟實現(xiàn)的1、構建及鑒定PAL-2質粒 自HepG22.2.15細胞中擴增得到目的基因LARC，以T4DNA連接酶克隆到載體pBS-VH62-ANK質粒中。以P2/P3為引物(P25’GTCGAA TTCCAT TCT AGA AAA GCC ACA G 3’，P35’CGG AAT TCC CAT GTG CTG TAC CAA G 3’)，自新質粒中擴增出的PCR產(chǎn)物，經(jīng)與DNA marker、LARC陽性對照電泳比較，是為324bp的目的基因LARC；進一步以EcoR I對質粒進行酶切，產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，證實目的基因已插入到空載體pBS-VH62-ANK中；DNA測序最終確證了上述結果，將該質粒命名為PAL-2(P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15)(圖1，2)。
2、構建及鑒定PAL-2-IS.4質粒取人工合成的一對互補的42bp外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，以連接酶克隆到經(jīng)Af1 III酶切的質粒載體PAL-2中，得到用作內參照的質粒PAL-2-IS。以P2/P3為引物對質粒進行PCR初步鑒定，產(chǎn)物與PAL-2(324bp)，電泳條帶比對照PAL-2的稍后，提示前者插入了42bp的IS(CATGTAAACATTCTCTTCGACATTCTCTTCAACATTCTCTTC)；該質?？杀籄f1 III酶切成線型。最終經(jīng)測序確認新質粒已插入了IS片段，質粒5’及3’端雙側序列與野生型LARC相同，但中間序列多了42bp，是用于內對照的質粒，命名為PAL-2-IS.4(P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15，IS-Insert Sequence，4-4號陽性克隆)。
3、建立檢測LARC表達的競爭性RT-PCR技術以2.50pg/10μl的PAL-2與不同已知濃度的PAL-2-IS.4共擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像凝膠處理系統(tǒng)掃描分析，結果各個電泳條帶的光密度值與DNA的起始濃度成正比。根據(jù)各擴增條帶的光密度值，用光密度比值法，即以內參照的不同濃度為橫坐標，待測模板與內參照模板光密度掃描值的比值為縱坐標作圖，得到一直線回歸方程y＝ax+b(圖5)；當y＝1，即PAL-2-IS.4與PAL-2擴增產(chǎn)物的光密度值一致時的x值，便是待測樣品中LARC cDNA的起始濃度，計算出的PAL-2濃度為2.38pg/10μl，與實際濃度無顯著性統(tǒng)計學差異(95％可信限)。
4、驗證本發(fā)明方法的準確性1)檢測HBV不同感染狀態(tài)下LARC表達水平，代表HBV不同感染狀態(tài)的肝細胞分別為“正?！备渭毎鸏02、HBV慢性持續(xù)性感染肝細胞HepG22.2.15，并以HBV雙體DNA體外轉染HepG2細胞，建立HBV短暫(急性)感染肝細胞模型。自1×106的不同細胞株中抽提到的總RNA，cQRT-PCR方法對各株細胞中LARC表達的定量結果顯示(表1)HBV不同感染狀態(tài)下LARC的表達水平是不同的，分別為“正?！?.65±0.02pg/10μl/106細胞、HBV“急性”感染3.43±0.02pg/10μl/106細胞、HBV“慢性”持續(xù)感染；1.22±0.04pg/10μl/106細胞；且這三種狀態(tài)下LARC的表達水平存在顯著性差異，即HBV“急性”感染肝細胞＞“正?！备渭毎綡BV“慢性”感染肝細胞(p＜0.05)。
2)檢測正常及慢性肝炎活檢肝標本中LARC表達量，對數(shù)例正常人的肝臟組織標本及經(jīng)病理診斷證實為慢性乙型肝炎的肝臟活檢標本分別抽提總RNA，在同一RNA起始水平，以相同的競爭性RT-PCR方法對LARC mRNA的表達進行定量，結果表明，慢性乙型肝炎患者肝臟中LARC的表達水平呈現(xiàn)出個體差異，其含量界于2.372-4.6pg/10μl之間，但均普遍顯著低于其在正常肝臟組織中的平均表達量8.74pg/10μl(p＜0.01)；提示人體肝臟中存在著基礎分泌量的LARC，HBV慢性感染狀態(tài)下，病毒可通過某種途徑下調LARC的表達。本發(fā)明具有如下特點1、本發(fā)明是一種定量檢測LARC表達水平的競爭性逆轉錄PCR(cQRT-PCR)2、本發(fā)明RT-PCR系統(tǒng)中含特定的內參照質粒(PAL-2-IS.4)
3、該質粒DNA內含一比正常(野生型)LARC大42bp、但其5’和3’末端序列與LARC基因的5’和3’末端序列同源的特定基因序列4、本發(fā)明cQRT-PCR技術可檢測包括細胞和組織標本中LARC的表達量5、本方法可用于人、小鼠、大鼠等哺乳類動物LARC基因表達水平的檢測6、本方法可用于某些疾病如慢性乙肝等疾病的診斷、預后判斷及各種治療和預防效果的評價


圖1是質粒PAL-2構建示意圖HepG22.2.15細胞中獲得的LARC純化產(chǎn)物與pBS-VH62-ANK質粒DNA分別經(jīng)EcoR I酶切，1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳后，回收酶切產(chǎn)物。將得到的兩個片段以T4DNA連接酶連接，取5μl連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)菌DH5α。所得質粒命名為PAL-2。
圖2是質粒PAL-2的鑒定Aa.以P2為引物的測序結果；Ab以P3為引物的測序結果；DPAL-2的DNA序列。
圖3是內參照質粒PAL-2-IS的構建示意圖人工合成一對互補的42bp外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，利用克隆于PAL-2的LARC基因內源性Af1 III位點經(jīng)Af1 III酶切后，加入IS退火產(chǎn)物，以T4DNA連接酶連接，轉化感受態(tài)菌DH5α。獲得內參照質粒PAL-2-IS(P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15，IS-Insert Sequence)。
圖4是質粒PAL-2-IS.4的測序鑒定粗體為插入片斷的DNA序列，下劃線為Af1 III酶切位點圖5是競爭性定量RT-PCR檢測LARC表達水平在同一PCR反應體系中，同時擴增固定濃度的PAL-2和不同濃度梯度的內參照PAL-2-IS.4，兩者的共擴增產(chǎn)物電泳后，對各條帶的光密度值進行掃描分析，得到PAL-2的推算濃度。A.PAL-2與PAL-2-IS.4的共擴增，B.光密度比值法。
表1HBV不同感染狀態(tài)肝細胞株中LARC的表達量編號 細胞 回歸方程 r pLARC的濃度(pg/10μl)aL02y＝0.29x+0.23 0.96 ＜0.012.65bHepG22.2.15 y＝0.55x+0.31 0.94 ＜0.011.22cHepG2-2 y＝0.51x-0.16 0.90 ＜0.012.29dHepG2-4 y＝0.37x+0.13 0.92 ＜0.012.34eHepG2-6 y＝0.49x-0.09 0.90 ＜0.012.23fHepG2-7 y＝0.62x-0.47 0.92 ＜0.012.35gHepG2-pEHH-2 y＝0.36x-0.16 0.93 ＜0.013.21hHepG2-pEHH-4 y＝0.35x-0.16 0.90 ＜0.013.30iHepG2-pEHH-6 y＝0.32x-0.09 0.91 ＜0.013.40jHepG2-pEHH-8 y＝0.32x-0.10 0.91 ＜0.013.47kHepG2-pEHH-10y＝0.32x-0.08 0.92 ＜0.013.37lHepG2-pDEH-12y＝0.35x-0.13 0.89 ＜0.013.26表2慢性肝炎及正常肝臟標本中LARC的表達量編號 回歸方程 r pLARC的濃度 LARC的起始濃度(pg/10ul) (pg/10ul)a y＝1.78x-2.26 0.89 ＜0.01 1.83 4.575b y＝1.72x-0.92 0.91 ＜0.01 1.11 2.773c y＝1.73x-0.94 0.90 ＜0.01 1.13 2.826d y＝1.74x-1.99 0.91 ＜0.01 1.72 4.3e y＝1.37x-0.29 0.93 ＜0.01 0.95 2.372f y＝1.71x-1.93 0.89 ＜0.01 1.71 4.275g y＝1.70x-1.88 0.92 ＜0.01 1.10 2.74h y＝1.52x-0.18 0.90 ＜0.01 1.66 4.15i y＝1.76x-2.03 0.91 ＜0.01 1.75 4.374j y＝1.61x-0.70 0.92 ＜0.01 1.05 2.629k y＝1.47x-1.70 0.91 ＜0.01 1.84 4.6l y＝0.28x+0.02 0.95 ＜0.01 3.54 8.83m y＝0.30x-0.06 0.94 ＜0.01 3.44 8.6n y＝0.30x-0.05 0.97 ＜0.01 3.51 8.77權利要求
1.一種定量檢測趨化因子表達水平的方法，其特征是通過構建含有特定內參照質粒PAL-2-IS.4，以同一對引物在同一反應管中競爭擴增，建立對趨化因子的表達水平的競爭性定量檢測方法。
2.按權利要求1所述的方法，其特征是所述的趨化因子為LARC。
3.按權利要求1所述的方法，其特征是所述的內參照質粒PAL-2-IS.4與LARC特異性引物互補序列，該質粒DNA內含比野生型sLARC大42bp、其5’和3’末端序列與LARC基因的5’和3’末端序列同源的特定基因序列。
4.按權利要求1所述的方法，其特征是按以下步驟進行a)從HepG22.2.15細胞中擴增得目的基因LARC，以T4DNA連接酶克隆到載體pBS-VH62-ANK質粒中，以P2/P3為引物，從新質粒中擴增出324bp的目的基因LARC；再以EcoR I對質粒行酶切，目的基因插入到空載體pBS-VH62-ANK中構建成PAL-2質粒，其中P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15；b)構建及鑒定PAL-2-IS.4質粒，取人工合成的一對互補的42bp外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，以連接酶克隆到PAL-2中，得質粒PAL-2-IS后，以P2/P3為引物對質粒進行鑒定，經(jīng)測序確認新質粒已插入了IS片段，得內對照質粒PAL-2-IS.4c)建立檢測LARC表達的競爭性RT-PCR技術，以PAL-2與PAL-2-IS.4共擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像凝膠處理系統(tǒng)掃描分析，根據(jù)各擴增條帶的光密度值，用光密度比值法，得直線回歸方程y＝ax+b，d)驗證本發(fā)明方法的準確性。1)檢測HBV不同感染狀態(tài)下LARC表達水平，2)檢測正常及慢性肝炎活檢肝標本中LARC表達量。
5.按權利要求4的方法，其特征是所述的P2/P3引物，其中P2序列5’GTCGAA TTCCAT TCT AGA AAA GCC ACA G 3’，P3序列5’CGG AAT TCC CAT GTG CTG TAC CAA G 3’。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域,本發(fā)明通過構建含有與LARC特異性引物互補序列的特定內參照質粒,以同一對引物在同一反應管中競爭擴增LARC,從而對LARC的表達水平進行定量,建立了定量檢測趨化因子LARC表達水平的cQRT－PCR技術。并通過對LARC水平、HBV不同感染狀態(tài)下體外培養(yǎng)細胞及病人活檢肝組織標本中LARC表達量的測定,驗證了本方法具備了較高的可靠性和準確性,本方法可用于某些疾病如慢性乙肝等疾病的診斷、預后判斷及各種治療和預防效果的評價。
文檔編號C12Q1/68GK1362527SQ0113223
公開日2002年8月7日 申請日期2001年11月19日 優(yōu)先權日2001年11月19日
發(fā)明者熊思東, 葉巍, 陳習武, 儲以微 申請人:復旦大學