專利名稱：自絮凝細胞顆粒清液連續(xù)發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)酒精的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種自絮凝細胞顆粒清液連續(xù)發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)酒精的工藝技術(shù)。
迄今為止，國內(nèi)外淀粉質(zhì)原料酒精發(fā)酵均采用帶渣發(fā)酵的生產(chǎn)工藝，主要以玉米為原料，并根據(jù)原料玉米前處理方法的不同分為干法和濕法二條技術(shù)路線。在濕法工藝中，原料玉米浸泡后經(jīng)胚乳分離、蛋白分離和纖維分離等工藝步驟得到粗淀粉乳作為后續(xù)酒精發(fā)酵的原料；而在干法工藝中，原料玉米直接脫胚或脫胚脫皮粉碎后得到玉米粉作為后續(xù)酒精發(fā)酵的原料。其共同點為粉漿經(jīng)雙酶法液化和糖化后得到的醪液不經(jīng)過濾或澄清處理直接送入發(fā)酵工段，酵母細胞將可發(fā)酵性糖發(fā)酵生成酒精和二氧化碳后得到的發(fā)酵醪中含有原料殘渣和大量酵母細胞。
發(fā)酵醪蒸餾過程中從粗餾塔塔釜排出大量廢糟液。由于原料殘渣及酵母細胞在酒精蒸餾過程中受熱分解產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，當(dāng)廢糟液直接循環(huán)使用時，盡管這些副產(chǎn)物在系統(tǒng)中達到平衡濃度，但實驗研究和生產(chǎn)實踐均表明，如果廢糟液直接循環(huán)使用的比例高于50％，這些副產(chǎn)物在系統(tǒng)中的平衡濃度會明顯抑制酵母細胞的生長和酒精發(fā)酵過程。因此，現(xiàn)有淀粉質(zhì)原料帶渣發(fā)酵工藝中50％以上的廢糟液不得不采用全蒸發(fā)濃縮即DDGS(Dry Distilled Grain Soluble)技術(shù)處理，蒸發(fā)裝置投資大，運行過程能耗高。
本發(fā)明的目的在于提出一種采用自絮凝細胞顆粒的淀粉質(zhì)原料清液酒精發(fā)酵的工藝技術(shù)路線，即粉漿液化糖化后得到的醪液在酒精發(fā)酵之前進行固液分離，去除原料殘渣得到澄清糖化液，在此基礎(chǔ)上使用自絮凝細胞顆粒連續(xù)發(fā)酵使之生成酒精和二氧化碳。由于細胞自絮凝形成毫米級大小的顆粒，因而在生物反應(yīng)器中可以實現(xiàn)完全固定化，不僅生物反應(yīng)器單位體積的細胞密度顯著提高，酒精發(fā)酵的平均發(fā)酵時間相應(yīng)縮短，而且送至蒸餾工段的發(fā)酵液不再含有原料殘渣和細胞，蒸餾后得到的廢液中有害副產(chǎn)物減少，可以全部直接循環(huán)使用。
實現(xiàn)本發(fā)明的工藝步驟如下1、粉漿配制淀粉乳或玉米粉按照工藝要求的料水比(視淀粉乳的實際濃度和玉米粉的淀粉含量而定)配制成粉漿，使粉漿的淀粉總糖濃度達到20-22％(w/v)，調(diào)節(jié)pH值為6.0-6.2，并按每克淀粉15-20活力單位加入淀粉酶，預(yù)熱至55-60℃。
2、粉漿液化采用蒸汽直接噴射液化技術(shù)使粉漿快速加熱到108-110℃后進入維持器，維持8-10分鐘后常壓閃蒸冷卻到97-98℃后進入液化柱，繼續(xù)液化90分鐘。
3、糖化液化醪冷卻到60-62℃后，使用硫酸調(diào)節(jié)pH值為4.0-4.5，并按每克淀粉150-200活力單位加入糖化酶，糖化時間為10-15h，使DE值達到90以上，滿足后續(xù)自絮凝細胞顆粒酒精發(fā)酵工藝對糖化工藝的特殊要求。
4、固液分離采用過濾或沉降的方式分離糖化醪中的原料殘渣，得到澄清糖化液。
5、種子培養(yǎng)與連續(xù)發(fā)酵使用自絮凝細胞顆粒，種子培養(yǎng)級數(shù)和生物反應(yīng)器規(guī)?？筛鶕?jù)裝置的生產(chǎn)規(guī)模確定，應(yīng)保證逐級接種的接種量為5-10％。種子擴大培養(yǎng)用培養(yǎng)基為糖濃度稀釋到10-12Bx、添加5g/L NH4HCO3和1.5g/LKH2PO4、pH值調(diào)節(jié)到5.0-5.5的糖化液，培養(yǎng)方式為間歇培養(yǎng)和連續(xù)流加培養(yǎng)結(jié)合，即接種后先間歇培養(yǎng)至殘?zhí)菨舛冉档偷?.0％(w/v)，然后開始流加糖化液進行連續(xù)培養(yǎng)。種子培養(yǎng)的工藝條件如下1)培養(yǎng)溫度30-32℃；2)pH值3.8-4.2；3)以0.1vvm的速率通風(fēng)供氧；4)通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流加速率控制殘?zhí)菨舛葹?.8-1.0％(w/v)；5)生物反應(yīng)器中單位體積細胞密度以細胞干重計達到40-50g/L。
生物反應(yīng)器中種子培養(yǎng)達到規(guī)定的密度后，將種子培養(yǎng)用培養(yǎng)基切換成糖濃度20-22％(w/v)的高糖濃度發(fā)酵培養(yǎng)基，添加無機鹽的濃度從初期的1.5g/LNH4HCO3和0.5g/L KH2PO4逐步遞減到0.5g/L NH4HCO3和0.15g/L KH2PO4，可以維持發(fā)酵液中無機N和P的濃度分別為0.2-0.3g/L和50-60mg/L，滿足自絮凝細胞顆粒正常酒精發(fā)酵的要求。采用多級生物反應(yīng)器串聯(lián)的工藝方案可以提高發(fā)酵終點發(fā)酵液中酒精濃度，生物反應(yīng)器串聯(lián)級數(shù)視生物反應(yīng)器容積規(guī)模而定。酒精發(fā)酵的工藝操作條件如下1)發(fā)酵溫度34-36℃；2)pH值為3.8-4.2；3)CO2的通氣速率為0.05vvm；4)糖液流加速率為0.04-0.05h-1，相當(dāng)于平均發(fā)酵時間20-25h。
按照上述工藝條件，發(fā)酵終點酒精濃度可以達到11-14％(v)，其他各項工藝技術(shù)指標(biāo)達到現(xiàn)有酒精發(fā)酵工藝的最佳水平。
6、發(fā)酵液蒸餾粗餾塔采用再沸器間接加熱的工藝技術(shù)方案以減少塔釜排出廢液總量，保證后續(xù)廢液直接循環(huán)使用時總體工藝水平衡。發(fā)酵液蒸餾后得到的廢液送固液分離工段洗滌濾渣，再次過濾后所得低濃度糖液送粉漿配制工段配制粉漿。
本發(fā)明的效果和益處在于細胞以自絮凝顆粒的方式在生物反應(yīng)器中實現(xiàn)完全固定化，不僅生物反應(yīng)器單位體積細胞密度顯著提高，酒精發(fā)酵的平均發(fā)酵時間縮短到現(xiàn)有工藝的1/3-1/2，而且自絮凝細胞顆粒要求清糖液發(fā)酵，這些技術(shù)特征使得發(fā)酵液蒸餾后得到的廢液不再含有原料殘渣和細胞，全部可以直接循環(huán)使用，節(jié)省了現(xiàn)有酒精發(fā)酵工藝廢糟液蒸發(fā)濃縮的能耗及新建裝置中蒸發(fā)濃縮設(shè)備的建設(shè)投資。


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附圖是自絮凝細胞顆粒連續(xù)培養(yǎng)和酒精發(fā)酵生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。
主體結(jié)構(gòu)包括1封頭；2沉降區(qū)環(huán)形擋板；3沉降區(qū)外筒體；4沉降區(qū)穩(wěn)流導(dǎo)筒；5緩沖區(qū)過渡節(jié)；6主發(fā)酵區(qū)筒體；7顆粒懸浮導(dǎo)流筒；8底部封頭。
主要工藝接管包括a培養(yǎng)基入口；b多余自絮凝細胞顆粒排放口；c驅(qū)動氣進口，種子擴大培養(yǎng)時使用空氣，酒精發(fā)酵時使用CO2；d發(fā)酵液出口；e接種口；f種子擴大培養(yǎng)時作為尾氣出口，酒精發(fā)酵時作為CO2出口。
以下結(jié)合附圖詳細敘述本發(fā)明的最佳實施例。
本發(fā)明最佳實施例中所用菌種為一株具有自絮凝特性且酒精發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母，已送指定微生物菌種保藏機構(gòu)保藏。
本發(fā)明最佳實施例中自絮凝細胞顆粒連續(xù)擴大培養(yǎng)和酒精發(fā)酵的生物反應(yīng)器如附圖所示，公稱容積為0.5M3。封頭(1)Dg800標(biāo)準(zhǔn)橢圓封頭；沉降區(qū)環(huán)形擋板(2)Dg700筒體，高度1200mm；沉降區(qū)外筒體(3)Dg800，高度1200mm；沉降區(qū)穩(wěn)流導(dǎo)筒Dg550，高度500mm，其上端與發(fā)酵液出口接管(d)中心線距離300mm；緩沖區(qū)過渡節(jié)(5)的錐角為60°；主發(fā)酵區(qū)筒體(6)Dg400，高度3200mm；顆粒懸浮導(dǎo)流筒(7)Dg150，高度3945mm，其底端與主發(fā)酵區(qū)筒體(6)的底端平齊；底部封頭(8)Dg400標(biāo)準(zhǔn)橢圓封頭。除顆粒懸浮導(dǎo)流筒(7)采用厚度2mm的不銹鋼板卷制外，其余部分均采用厚度4mm的碳鋼板制造。培養(yǎng)基入口(a)為Dg10法蘭連接接管；多余自絮凝細胞顆粒排放口(b)為Dg25法蘭連接接管；驅(qū)動氣進口(c)為內(nèi)徑φ4nn的噴嘴；發(fā)酵液出口(d)為Dg50法蘭連接接管，其中心線距離沉降區(qū)外筒體(3)底端500mm；接種口(e)為發(fā)酵行業(yè)通用快接頭；種子擴大培養(yǎng)時作為尾氣出口及酒精發(fā)酵時作為CO2出口的接管(f)為Dg50法蘭連接接管。
上述生物反應(yīng)器的其他尺寸，包括冷卻方式等均采用發(fā)酵行業(yè)常規(guī)設(shè)計。
以干法脫胚脫皮、粉碎細度60目、淀粉含量78-80％的玉米粉為原料，淀粉酶和糖化酶均為中國無錫星達生物工程有限公司生產(chǎn)的工業(yè)用酶制劑，活力分別為20000u/g和100000u/g。
四臺上述生物反應(yīng)器并串聯(lián)混合使用，自絮凝酵母細胞顆粒種子培養(yǎng)階段并聯(lián)操作，酒精發(fā)酵階段串聯(lián)操作，依靠高位差使發(fā)酵液在生物反應(yīng)器之間流動。
培養(yǎng)基組成如下1#培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖10，酵母浸膏5，蛋白胨3，用于三角瓶中游離細胞到自絮凝顆粒的培養(yǎng)；2#培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖30，酵母浸膏5，蛋白胨3，用于三角瓶中自絮凝顆粒的擴大培養(yǎng)；3#培養(yǎng)基組成為糖度10-12Bx的糖化液，分別添加5g/L的NH4HCO3和1.5g/L的KH2PO4，用于發(fā)酵罐中自絮凝細胞顆粒的擴大培養(yǎng)；4#培養(yǎng)基組成為糖度20-22Bx的糖化液，用于酒精發(fā)酵，由于廢液循環(huán)過程中殘余N和P等營養(yǎng)物質(zhì)的積累，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NH4HCO3和KH2PO4的濃度分別由初始的1.5g/L和0.50g/L逐漸降低到0.45g/L和0.15g/L，可以滿足自絮凝細胞顆粒正常酒精發(fā)酵過程的營養(yǎng)需求。
上述培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器和工藝管道使用前均需熱滅菌，按照發(fā)酵行業(yè)的常規(guī)操作進行。
液化糖化在二臺帶有夾套、容積5M3的標(biāo)準(zhǔn)機械攪拌式糖化罐中進行，操作步驟如下按照料水比1∶2.5配制粉漿，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0-6.2，并按15u/g玉米粉加入淀粉酶，粉漿預(yù)熱到55-60℃后，使用直接蒸氣快速加熱到108-110℃并維持10min，卸壓閃蒸使液化醪溫度降低到97-98℃，維持90min，完成粉漿液化操作。將液化醪冷卻到60-62℃后，使用H2SO4調(diào)節(jié)pH值為4.0-4.5，按照150u/g玉米粉加入糖化酶，糖化時間10h。糖化后的醪液使用板式過濾機過濾得到澄清糖化液供后續(xù)自絮凝細胞顆粒培養(yǎng)和酒精發(fā)酵使用，所得濾渣經(jīng)蒸餾廢液洗滌回收殘留糖份后作為副產(chǎn)物排出系統(tǒng)。
將斜面試管保藏的菌種接種到裝有100mL 1#培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在150rpm和30℃條件下培養(yǎng)24h，酵母細胞可以完全自絮凝形成顆粒，搖瓶停止旋轉(zhuǎn)后，自絮凝酵母細胞顆粒迅速沉降，培養(yǎng)液變得澄清，棄去上清液并更換2#培養(yǎng)基進行分瓶擴大培養(yǎng)，間隔24h再次棄去上清液分瓶擴大培養(yǎng)，直至達到生物反應(yīng)器接種要求的種子量。
將搖瓶培養(yǎng)的種子接種到裝有3#培養(yǎng)基的一臺生物反應(yīng)器中，按照如前所述工藝條件進行通風(fēng)培養(yǎng)。當(dāng)生物反應(yīng)器中殘?zhí)菨舛冉档偷?％(w/v)時，開始流加培養(yǎng)，培養(yǎng)基流加速度根據(jù)殘?zhí)菨舛日{(diào)節(jié)，保持殘?zhí)菨舛炔坏陀?％(w/v)，流加培養(yǎng)3d后各發(fā)酵罐中自絮凝細胞顆粒的密度以細胞干重計可以達到20-30g/L時，將培養(yǎng)的自絮凝酵母細胞顆粒種子等分到四臺生物反應(yīng)器中，四臺生物反應(yīng)器并聯(lián)操作，重復(fù)上述培養(yǎng)過程種子至各生物反應(yīng)器中自絮凝酵母細胞顆粒以細胞干重計細胞密度達到40-50g/L，種子培養(yǎng)結(jié)束。
切換4#培養(yǎng)基，同時將通風(fēng)切換成CO2，并將各生物反應(yīng)器由并聯(lián)操作調(diào)整為依次串聯(lián)操作?；诎l(fā)酵罐總有效容積的稀釋速率為0.05h-1，相當(dāng)于平均發(fā)酵時間20h。裝置運行過程中間隔24h檢測各生物反應(yīng)器中自絮凝酵母細胞顆粒的濃度、發(fā)酵液中總N和總P。當(dāng)自絮凝酵母細胞顆粒的密度超過50g/L時，可以從生物反應(yīng)器下部排放口排出多余酵母，保持生物反應(yīng)器中自絮凝酵母細胞顆粒濃度在工藝規(guī)定的范圍內(nèi)，同時使發(fā)酵液中總無機N和P保持在0.2-0.3g/L和50-60mg/L范圍內(nèi)。
末級生物反應(yīng)器流出的發(fā)酵液進行蒸餾處理，得到蒸餾廢液用來洗滌糖化醪過濾所得濾渣，再次過濾得到稀糖液用于配制粉漿。
上述四級串聯(lián)生物反應(yīng)器系統(tǒng)可以穩(wěn)定運行，達到工藝步驟(5)規(guī)定的各項技術(shù)指標(biāo)，整個過程無廢液向系統(tǒng)外排放。
權(quán)利要求
1.一種自絮凝細胞顆粒清液連續(xù)發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)酒精的工藝方法，其特征在于a)淀粉質(zhì)原料，制備滿足自絮凝細胞顆粒酒精發(fā)酵工藝特殊要求糖化液的技術(shù)，控制糖化時間為10-15h,DE值達到90，糖化后固液分離去除糖化醪中原料殘渣；b)淀粉質(zhì)原料，使用自絮凝細胞顆粒清液發(fā)酵生產(chǎn)酒精的技術(shù)，生物反應(yīng)器中的細胞密度以單位體積干重計達到40-50g/L以上，生物反應(yīng)器多級串聯(lián)操作，在連續(xù)發(fā)酵的平均發(fā)酵時間20-25h條件下，發(fā)酵終點酒精濃度達到11-14％(v)；c)與淀粉質(zhì)原料自絮凝細胞顆粒清液酒精連續(xù)發(fā)酵工藝相匹配的蒸餾廢液全循環(huán)使用的技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及到一種自絮凝細胞顆粒清液連續(xù)發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)酒精的工藝方法。自絮凝細胞顆粒在生物反應(yīng)器中實現(xiàn)固定化,生物反應(yīng)器中的細胞密度以單位體積細胞干重計可以高達40－50g/L以上。生物反應(yīng)器多級串聯(lián),在平均發(fā)酵時間為20－25h的條件下,發(fā)酵終點酒精濃度達到11－14%(V)。在此基礎(chǔ)上,提出了制備滿足自絮凝細胞顆粒酒精發(fā)酵工藝要求糖化液及酒精蒸餾廢液直接循環(huán)使用的技術(shù)。節(jié)省了廢糟液蒸發(fā)濃縮的能耗。
文檔編號C12P7/06GK1323903SQ01114010
公開日2001年11月28日 申請日期2001年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月28日
發(fā)明者白鳳武, 云戰(zhàn)友, 劉傳斌, 謝健, 李寧 申請人:大連理工大學(xué)