脂蛋白的柱上重折疊和純化的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】脂蛋白的柱上重折疊和純化 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供了用于純化人脂蛋白諸如ApoLl的活性形式的方法。更具體地，本發(fā) 明涉及用于使用疏水相互作用柱將大腸桿菌中大量表達(dá)的蛋白的包涵體復(fù)性成活性形式 和去除雜質(zhì)（例如，內(nèi)毒素）的方法。
[0002] 發(fā)明背景 重組治療蛋白的制造提出了許多純化挑戰(zhàn)，包括去除過(guò)程和產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)，諸如內(nèi) 毒素，宿主細(xì)胞蛋白和蛋白片段。這些挑戰(zhàn)用載脂蛋白的生產(chǎn)擴(kuò)增，因?yàn)檫@些疏水性蛋白傾 向于對(duì)雜質(zhì)具有高結(jié)合親和力，并且將共純化，使得分離困難（參見(jiàn)，例如Caparon，等人 (2010) 乂 105:239 - 249)。載脂蛋白與雜質(zhì)的相互作用增加了純化 過(guò)程的復(fù)雜性，并且可以引發(fā)顯著的產(chǎn)率損失，導(dǎo)致低生產(chǎn)量，高成本制造過(guò)程（參見(jiàn)，例 如 Hunter,等人（2009) /Progress 25(2) : 446-453)。
[0003] 人載脂蛋白LI (h-Ap〇Ll)是高密度脂蛋白（HDL)顆粒的次要蛋白組分，并且據(jù) 信在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中發(fā)揮作用（參見(jiàn)，例如，Duchateau，等人（1997) J沒(méi)iW.泛￡?. 272:25576 - 25582)。目前研宄已經(jīng)顯示h-Ap〇Ll的變體和非糖尿病慢性腎病的發(fā)病機(jī)理 之間的聯(lián)系（參見(jiàn)，例如，Genovese,等人（2010) 329:841-845)。攜帶被稱為G1 和G2的兩種ApoLl風(fēng)險(xiǎn)等位基因的非裔美國(guó)人具有腎小球疾病的大大增加的風(fēng)險(xiǎn)。G1變 體具有兩個(gè)錯(cuò)義突變（S342G和I384M)，而G2變體具有6個(gè)堿基對(duì)（bp)框內(nèi)缺失，導(dǎo)致2 個(gè)氨基酸的缺失（N388del :Y389del)。在攜帶一個(gè)或兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因的群體中，局灶性節(jié) 段性腎小球硬化癥（FSGS)發(fā)生較早，并且更迅速地進(jìn)展至終末期腎病（ESRD)(參見(jiàn)，例如， Kopp 等人（2011) 7；辦?. 5bc. 22:2129-2137)。
[0004] 載脂蛋白LI (ApoLl)是h-Ap〇Ll和其相關(guān)變體（例如，EG、Gl、G2)的遺傳修飾的 形式。ApoLl純化制劑的生物活性使用基于細(xì)胞的布氏錐蟲(chóng)（rrjpafliosoffia fo-ycei)評(píng)價(jià)， 因?yàn)锳poLl的大腸桿菌素孔形成結(jié)構(gòu)域?qū)⑻岣呗入x子流入細(xì)胞膜并引起細(xì)胞死亡（參見(jiàn)， 例如 Perez-Morga 等人（2005) Science 309 (5733): 469 - 472)〇
[0005] ApoLl和h-AP0Ll兩者都具有多個(gè)兩親性a螺旋，這導(dǎo)致可逆自結(jié)合現(xiàn)象和在溶 液中形成膠束結(jié)構(gòu)，這與文獻(xiàn)中先前描述的其它載脂蛋白的行為類(lèi)似（參見(jiàn)例如Zehender 等人（2012) SiocAewistry 51:1269 - 1280 和 Calabresi 等人（1994) J 269:32168 - 32174)。呈其主要形式的ApoLl作為結(jié)合在一起的近似彡15個(gè)蛋白分子存 在。ApoLl單體由372個(gè)氨基酸組成，具有近似41 kDa的分子量和約5. 49的理論等電點(diǎn) (pi)。狒狒ApoLl和人Ap〇L2在溶液中也作為多聚蛋白分子存在，分別具有40 kDa和37 kDa的近似分子量和約6. 52和6. 31的理論pi。
[0006] 對(duì)于多種蛋白，包括組氨酸標(biāo)簽的蛋白和重組蛋白，文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了通過(guò)負(fù)載 解折疊蛋白和降低變性劑濃度而層析重折疊蛋白（參見(jiàn)，例如Zhu，等人.（2005) 37 (4): 265 - 269，例如 Cabanne,等人?（2005) J 漢818:23 - 27)。大多數(shù)這些蛋白含有半胱氨酸鍵，這需要被重折疊以便 在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)形成正確的二硫鍵。然而，載脂蛋白由多個(gè)兩親性a螺旋組成，其通常在純 化后重折疊。
[0007] 純化載脂蛋白的先前方法由以下組成：使用高尿素濃度使蛋白自我結(jié)合最小化 以去除過(guò)程雜質(zhì)，且經(jīng)常涉及多個(gè)步驟（例如Hunter,等人（2008) A 1204:42 - 47和Bankston,等人（2010)沿'otecA 7； 5:1028-1039)。純化ApoLl 的當(dāng)前 方法涉及使用蛋白的N端組氨酸標(biāo)簽形式組合固定的金屬離子親和層析（IMAC)，以提高蛋 白純度。結(jié)合至蛋白的組氨酸標(biāo)簽?zāi)軌驅(qū)崿F(xiàn)替代純化方案，但可導(dǎo)致免疫原性。由于ApoLl 蛋白在高尿素濃度下不顯著解離，所以需要不同方法用于去除過(guò)程相關(guān)的雜質(zhì)。當(dāng)前方法 涉及基于其擴(kuò)增賦形劑與ApoLl的相互作用的能力選擇賦形劑（即，洗滌劑和變性劑組合） 和層析樹(shù)脂和膜，用于基于蛋白的折疊狀態(tài)選定清除過(guò)程雜質(zhì)。本發(fā)明通過(guò)提供純化高度 自我結(jié)合載脂蛋白的方法來(lái)填補(bǔ)該未滿足的需求。
[0008] 附圖描述 以下附圖形成本說(shuō)明書(shū)的部分，并且被包括以進(jìn)一步說(shuō)明本公開(kāi)的某些方面。本公開(kāi) 可以通過(guò)參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)組合本文呈現(xiàn)的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述而更好 地理解。
[0009] 圖1是ApoLl EIK和KIK同種型的比較。
[0010] 圖2A-2C是EIK WT、G1和G2 (HIC進(jìn)料和洗脫液）分別的RP-HPLC概況。
[0011] 圖3是AP0L1 WT在各種緩沖液基質(zhì)中的圓二色譜概況。緩沖條件如下代表：3M鹽 酸胍，空心三角（厶），8M尿素，2 w/v% SDS，空心正方形（口）和HIC洗脫液，空心圓（〇 )〇
[0012] 圖4A-4B是AP0L2 HIC和ApoL2狒狒進(jìn)料和洗脫液的RP-HPLC概況。
[0013] 圖5是AP0L1野生型、AP0L2和AP0L1狒狒的還原SDS-Page凝膠。
[0014] 圖6A-6B是ApoLl狒狒和ApoL2的圓二色譜概況。
[0015] 圖7A-7B是ApoLl狒狒和ApoL2的色氨酸熒光概況。
[0016] 圖8是載脂蛋白層析純化方法的示意圖。
[0017] 圖9是AP0L1野生型和AP0L1狒狒的生物活性概況。
[0018] 發(fā)明概述 本發(fā)明基于脂蛋白可以使用專(zhuān)門(mén)的層析步驟重折疊和純化的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供了重折 疊和純化細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的脂蛋白的方法，其包括：在增溶緩沖液中增溶和解折疊包涵體； 將含有脂蛋白的緩沖液的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至至少65 -130 mS/cm;將含有所述脂蛋白的緩沖液 負(fù)載在疏水相互作用層析（HIC)柱上；用洗滌緩沖液洗滌HIC柱；和用梯度洗脫緩沖液或 非梯度洗脫緩沖液洗脫所述脂蛋白，從而產(chǎn)生具有至少44%的純度的HIC柱洗脫液，如通 過(guò)反相高效液相層析（RP-HPLC)所測(cè)定。在某些中，所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞；并且所 述增溶緩沖液包含2% SDS、100mM Tris、100mM NaCl、200mM精氨酸和8M尿素，pH 7至10。 在進(jìn)一步實(shí)施方案中，將所述脂蛋白在所述增溶緩沖液中在15-30°C孵育一至二十四小時(shí)。 在進(jìn)一步實(shí)施方案中，對(duì)于含有半胱氨酸殘基的載脂蛋白，將二硫蘇糖醇（lmM)添加至解 折疊緩沖液中。
[0019] 本發(fā)明還涵蓋，用20 mM磷酸鈉和1至2M硫酸銨將含有所述脂蛋白的緩沖液的電 導(dǎo)率調(diào)節(jié)至65 -100 mS/cm。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述HIC柱負(fù)載有高達(dá)15克載脂蛋白 /每升HIC樹(shù)脂；所述洗滌緩沖液包含1 M硫酸銨，pH 7,并且所述梯度洗脫緩沖液包含約 20 mM磷酸鈉和1 M硫酸銨，pH7(緩沖液A)至約20 mM磷酸鈉，pH 7(緩沖液B)的梯度，并 且所述脂蛋白經(jīng)20個(gè)柱體積洗脫。在其它實(shí)施方案中，緩沖液A包含20 mM磷酸鈉和0.2 至0. 3 M硫酸銨，pH 7,并且緩沖液B包含20 mM磷酸鈉，pH 7,尿素濃度為0至8M。在其 它實(shí)施方案中，緩沖液A和緩沖液B都由0至8M尿素構(gòu)成。
[0020] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了純化載脂蛋白的方法，其包括：以流通模式將含有載脂蛋白 的HIC柱洗脫液負(fù)載至耐鹽陰離子交換層析膜上，進(jìn)料條件為pH 6.5 - 8.0,電導(dǎo)率為 彡5至30 mS/cm，且膜負(fù)載率為至少50毫克載脂蛋白/每mL膜；用pH 6. 5-8. 0的20mm HEPES和200mM NaCl洗滌所述膜；和收集流通液。
[0021] 在又進(jìn)一步實(shí)施方案中，