一種促進(jìn)紫錐菊再生芽生長的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種促進(jìn)紫錐菊再生芽生長的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫錐菊/wr/wrea L.)為菊科多年生草本植物，具有良好的免疫調(diào)節(jié) 作用，其提取物是近年來在國際上受到普遍重視的一種免疫促進(jìn)劑和免疫調(diào)節(jié)劑。由于其 確切的功效作用，紫錐菊已經(jīng)成為一種世界著名的藥用植物。人們?yōu)榱双@得多品種的紫錐 菊，通常采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行再生或再生克隆。利用組織培養(yǎng)技術(shù)對植物進(jìn)行再生或再 生克隆，通常包含兩個(gè)步驟。第一步是從外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。第二步是再生芽生長成完 整植株，以備移栽。對于紫錐菊，現(xiàn)有技術(shù)中已有很多報(bào)道研究其外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽； 而至于如何促使這些再生芽生長良好，還需要更多研究。
[0003] 本發(fā)明的發(fā)明人在成功獲得一些特殊紫錐菊種質(zhì)資源以后，發(fā)現(xiàn)有的特殊種質(zhì)資 源的再生芽的生根效率較低，導(dǎo)致其移栽成活率通常較低，原因在于傳統(tǒng)方法復(fù)原的植株 根尖的數(shù)量較少。
[0004] 己酸二乙氨基乙醇酯（DA-6)是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，通常用于田間栽培，很少用 于組織培養(yǎng)，發(fā)明人早前研究發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)紫錐菊再生芽的生長。但是，研究同樣顯示這 種促進(jìn)作用并不是完全與基因劑量相關(guān)的，還具有某種不穩(wěn)定性。對于同一個(gè)種質(zhì)材料，在 適合其他芽生長的培養(yǎng)基上，部分生物量較小的再生芽的生長卻受到抑制。為解決這個(gè)問 題，發(fā)明人研究了 DA-6的作用與所培養(yǎng)的再生芽的初始生物量之間的關(guān)系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)中，生物量不一的紫錐菊再生芽在含有相同濃度DA-6 的培養(yǎng)基中長勢不一的問題，提供了一種促進(jìn)紫錐菊再生芽生長的方法。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。
[0007] -種促進(jìn)紫錐菊再生芽生長的方法，將紫錐菊的不定芽置于含有DA-6的生長培 養(yǎng)基中培養(yǎng)；所述生長培養(yǎng)基是在MS配方中除了添加15~60 g/L蔗糖、3~9 g/L瓊脂 和0. 01~0. 2 mg/L NAA之外，對于不同生物量的紫錐菊再生芽還添加了下述相應(yīng)含量的 DA-6 ： 當(dāng)紫錐菊再生芽為連葉高1. 5~ 2. 5cm的二倍體時(shí)，所述培養(yǎng)基中DA-6的含量為 0. 08-0. 16 mg/L ； 當(dāng)紫錐菊再生芽為連葉高4cm的二倍體或三倍體時(shí)，所述培養(yǎng)基中DA-6的含量為 0. 32-0. 64 mg/L ； 當(dāng)紫錐菊再生芽為連葉高4cm的四倍體時(shí)，所述培養(yǎng)基中DA-6的含量為0. 64~1. 28 mg/L。
[0008] 對于一個(gè)再生芽來說，要使之長成一個(gè)完整植株，關(guān)鍵在于誘導(dǎo)出不定根并使這 些不定根生長良好。發(fā)明人早前研究結(jié)果顯示添加DA-6有助于提升再生芽的生長狀態(tài)，提 升其不定根的數(shù)量，從而更好的達(dá)到對特殊種植材料進(jìn)行保存和增殖目的。本發(fā)明的目的 在于，根據(jù)不同生物量的再生芽對DA-6的敏感性的不同，相應(yīng)地添加不同濃度的DA-6,發(fā) 明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)再生芽的生物量，在再生芽的生長培養(yǎng)基中加入適量濃度的 DA-6可以使再生芽的生長狀態(tài)、不定根的萌發(fā)數(shù)量得到顯著的提升。
[0009] 另外，只要是二倍體來源的，無論是葉柄、葉片或根外植體長出的不定芽，對6-DA 的濃度要求一樣。
[0010] 為促進(jìn)產(chǎn)生發(fā)達(dá)的根系，優(yōu)選地，當(dāng)紫錐菊再生芽為1. 5cm的二倍體時(shí)，所述培養(yǎng) 基中DA-6的含量為0? 08mg/L。
[0011] 為促進(jìn)產(chǎn)生發(fā)達(dá)的根系，優(yōu)選地，當(dāng)紫錐菊再生芽為2. 5cm的二倍體時(shí)，所述培養(yǎng) 基中DA-6的含量為0? 16mg/L。
[0012] 為促進(jìn)植株的長高及產(chǎn)生發(fā)達(dá)的根系，優(yōu)選地，當(dāng)紫錐菊再生芽為葉片6-8、連葉 高4cm的四倍體時(shí)，所述培養(yǎng)基中DA-6的含量為0. 64mg/L。
[0013] 為促進(jìn)植株的長高，優(yōu)選地，當(dāng)紫錐菊再生芽為葉片6-8、連葉高4cm的二倍體或 三倍體時(shí)，所述培養(yǎng)基中DA-6的含量為0. 32 mg/L。
[0014] 為促進(jìn)產(chǎn)生發(fā)達(dá)的根系，優(yōu)選地，當(dāng)紫錐菊再生芽為葉片6-8、連葉高4cm的二倍 體或三倍體時(shí)，所述培養(yǎng)基中DA-6的含量為0. 64 mg/L。
[0015] 優(yōu)選地，將紫錐菊葉柄外植體再生芽接種在相對應(yīng)的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為 25±4 °C，光照強(qiáng)度為1000~2500 lx，光照時(shí)間為10~16 h/d的條件下培養(yǎng)10~60 d。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果在于： 本發(fā)明解決了原有技術(shù)下，不同生物量的紫錐菊再生芽生長培養(yǎng)中部分生物量較小的 再生芽生長受到抑制的突出問題，對于紫錐菊的生物技術(shù)研究、特別是對于不能夠產(chǎn)生種 子但具有更高種植價(jià)值的特殊種質(zhì)材料的種苗克隆具有重要的可直接應(yīng)用的價(jià)值。
【附圖說明】
[0017] 圖1為不同DA-6濃度對較小和中等生物量的二倍體再生芽的生長的影響；其中， 1~5分別是用0、0. 01、0. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6處理生物量較小的二倍體再生芽；6~10 分別是用〇、〇. 〇l、〇. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6處理生物量較大的二倍體再生芽。
[0018] 圖2為不同DA-6濃度對較大生物量二倍體、三倍體和四倍體再生芽生長的影響； 其中，1~5分別是用0、0. 16、0. 32、0. 64、1. 28mg/L的DA-6處理的二倍體再生芽；6~10分別 是用0、0? 16、0. 32、0. 64、1. 28mg/L的DA-6處理的三倍體再生芽；11~15分別是用0、0? 16、 0. 32、0. 64、1. 28mg/L的DA-6處理的四倍體再生芽。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但實(shí)施例并不對 本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常 規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0020] 植物材料：本發(fā)明所述二倍體紫錐菊由種子獲得；四倍體紫錐菊的獲得方法可參 考Nilanthi D, Chen X L, Zhao F C,etal.Induction of tetraploids from petiole explants through colchicine treatments inEchinaceapurpureaL [J]. BioMed Research International, 2009。三倍體紫錐菊是將二倍體和四倍體雜交獲得。這些植株 的倍性均通過根尖染色體計(jì)數(shù)技術(shù)進(jìn)行了鑒定。
[0021] 實(shí)施例1 本實(shí)施例研究了不同DA-6濃度對較小和中等生物量的二倍體再生芽的生長的影響： S1.再生芽的準(zhǔn)備：首先獲得紫錐菊葉柄外植體，葉柄外植體來自組織培養(yǎng)條件下的 紫錐