專利名稱：：促進皮膚再生的醫(yī)療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能促進皮膚再生的醫(yī)療組合物，其含有光交聯(lián)性殼聚糖衍生物、葡萄糖等糖類和/或甘氨酸等氨基酸。
背景技術(shù)：
：皮膚本來具有自身修復(fù)功能，對于簡單外傷等輕度的創(chuàng)傷可以通過自身修復(fù)功能進行皮膚再生，但對于重度燒傷(重度熱傷)、放射線照射復(fù)合創(chuàng)傷(放射線被曝複賴U傷)、褥瘡等難治性創(chuàng)傷，則難以完全修復(fù)(非專利文獻1)。創(chuàng)傷治愈的機理是以如下順序進行的，U)對由炎癥性細胞，接著結(jié)締組織的細胞、表皮細胞的損傷部位的識別，(2)創(chuàng)傷部位的收縮，以及(3)肉芽形成和上皮化；對各階段中的相關(guān)細胞、各種因子、細胞因子、分泌物等已經(jīng)明確。人工進行皮膚修復(fù)的皮膚創(chuàng)傷治愈的研究，從以臨時保護創(chuàng)面為目的的創(chuàng)傷被覆劑的材料改性到利用與創(chuàng)傷治療相關(guān)的細胞因子或增殖因子等藥物來誘導(dǎo)積極治愈的嘗試都有涉及。但是，對于從簡單創(chuàng)傷至難治性創(chuàng)傷的各種程度的皮膚創(chuàng)傷都有效的被覆劑或單一成分的藥物尚不存在；尤其是還沒有對于重度燒傷或大范圍外傷而言重要的促進、誘導(dǎo)上皮形成的技術(shù)。在這種情況下，對全層皮膚缺損(全層皮虜欠損)的患者的治療開始使用皮膚替代物。組入了表皮細胞的皮膚替代物稱為培養(yǎng)表皮，組入了真皮的成纖維細胞的皮膚替代物稱為培養(yǎng)真皮，組入了這兩種的皮膚替代物稱為培養(yǎng)皮膚。例如，在深I(lǐng)I度燒傷的治療中可以使用冷凍培養(yǎng)表皮，由同種培養(yǎng)表皮取代自體細胞。但是，對于小的全層缺損的情況，即使在全層皮膚腿潰瘍或m度燒傷中，也可以通過促進肉芽形成進行上皮化；但在大范圍全層皮膚缺損中，由于培養(yǎng)表皮難以成活，最終不得不依靠自體皮膚移植?，F(xiàn)在作為培養(yǎng)真皮，整合了成纖維細胞的、基質(zhì)材料不同的TransCyte、Dermagraft等產(chǎn)品已由Smith&Nephew/>司銷售。但是，培養(yǎng)真皮也和培養(yǎng)表皮同樣在大范圍創(chuàng)傷中沒有誘導(dǎo)上皮化的能力，可以說沒有超出功能性創(chuàng)傷被覆劑的范疇。另一方面，作為整合了表皮細胞和成纖維細胞的培養(yǎng)皮膚，正在市售的有Apligraf(NOVARTIS公司)和VivoDerm(Convatec公司)。但是，實際上存在培養(yǎng)上皮層與真皮層的親和性問題、對于感染創(chuàng)得不到臨床效果的問題，離可取代自體皮膚的皮膚替代物的完成尚遠。另外，以往的皮膚替代物對動物性膠原或人血漿成分的利用依賴性高，對其安全性尚有擔(dān)憂。進一步地，對于重癥燒傷雖然可以使用人工真皮，但為了最終的上皮化，需要再次進行自體皮膚移植。此外，單用培養(yǎng)皮膚對重度燒傷的移植缺乏有效性，雖然有機構(gòu)正在研究與無細胞性的真皮配合的混合型培養(yǎng)皮膚，但其臨床評價尚未確定。即，在以大范圍重度燒傷等為代表的、皮膚附屬器沒有殘留的全層皮膚缺損中，作為最必要的功能性皮膚再生.治療技術(shù)，其治愈的關(guān)鍵是迅速的真皮形成和上皮形成。但是，在以往的皮膚替代物中，沒有具有使上皮形成的能力的替代物。因此，上皮化誘導(dǎo)唯一期待的方法只有自體皮膚移植。但是，在大范圍受到燒傷的情況下，為了自體皮膚移植可采取的皮膚范圍有限，難以保證創(chuàng)面整體的上皮化所必要的量。而且，為將移植組織牢固地固定于皮下組織而進行的縫合或通過吻合器等處置不僅需要時間，而且伴有術(shù)后包帶更換處置的疼痛或再障礙的危險，對患者和醫(yī)師造成很大的負擔(dān)。非專利文獻l:高柳健二、熊谷憲夫、《蛋白質(zhì)核酸酵素》第45巻、第13號、2283-2287頁、2000年。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的課題在于提供醫(yī)療組合物，其在重度燒傷等大范圍全層皮膚缺損的唯一的上皮再生法即自體皮膚移植中，可以簡便地固定自體皮膚移植片，可以提高上皮化的效率、促進皮膚再生。特別地，在重癥燒傷的治療中，已知在早期促進肉芽形成與自體皮膚移植片的固定有很大的關(guān)系。截至目前很多燒傷?？漆t(yī)生都在期待促進肉芽形成的簡單高分子制劑的開發(fā)。為解決該課題，本發(fā)明提供了醫(yī)療組合物，其特征在于含有基材、糖類和/或氨基酸。作為前述基材，優(yōu)選采用可用于創(chuàng)傷等、支持創(chuàng)傷修復(fù)或組織治愈'再生的所謂被覆材料?？膳e出例如各種水凝膠、水膠體、膠原、明膠制劑等。特別地，優(yōu)選使用由后述的光交聯(lián)性殼聚糖衍生物形成的水凝膠。本發(fā)明使用的光交聯(lián)性殼聚糖衍生物(PRC:Photo-CrosslinkableChitosan)為，例如選自WOOO/27889號小冊子所述的物質(zhì)，是可在400nm附近的安全紫外線下形成粘著性水凝膠的功能性聚合物，可適用作醫(yī)療用粘著劑。因此，含有該PRC的本發(fā)明組合物可以通過簡便的操作將自體移植片等移植組織固定.密閉，同時預(yù)防患部感染、保全生體具有的活躍的肉芽形成能力，即具有PRC具有的基本特征；除此之外，由于早期分解，所以不用擔(dān)心更換時的再障礙，具有特別符合包含燒傷治愈的本發(fā)明用途的特征。更令人吃驚的是，通過使氨基酸和/或糖類共存于溶解有PRC的介質(zhì)中，不僅在組織損傷部位、而且在作為支持材料的殼聚糖凝膠中(隨著PRC的分解)，觀察到以嗜中性粒細胞為主的多核白細胞(多核球)迅速浸潤殼聚糖層、多核白細胞引起的VEGF表達亢進、伴隨其的新生血管形成、肉芽形成和上皮形成的促進。通過使PRC中含有細胞增殖因子等創(chuàng)傷治愈促進劑，可以提高其創(chuàng)傷治愈活性(參考WO03/090765號小冊子)，但本發(fā)明的組合物即使不含有增殖因子等，也可以使自體皮膚移植片或其它皮膚替代物在創(chuàng)傷部位成活，不僅可以在重度燒傷等皮膚創(chuàng)傷中作為支持皮膚移植片的材料使用，而且即使不存在皮膚移植片或皮膚替代物，也具有促進上皮化、促進治愈的效果，可以作為皮膚創(chuàng)傷治療藥使用。此外，本發(fā)明的組合物不像以往的粘著劑如纖維蛋白糊、膠原制劑等，它不是人組織來源的制劑，因此也具有無感染危險的優(yōu)點。為實施例的自體皮膚移植實驗方法的概略說明圖。[圖2]為顯微鏡照片，表示在實施例2中，采用本發(fā)明的組合物(A)時的創(chuàng)傷部位的組織變化。為顯微鏡照片，表示在實施例2中，采用不含氨基酸和糖類的組合物(B)時的創(chuàng)傷部位的組織變化。為顯微鏡照片，表示在實施例3中，采用本發(fā)明的組合物(A)時的創(chuàng)傷部位組織的抗-VEGF染色的斷面。為顯微鏡照片，表示在實施例3中，采用本發(fā)明的組合物(A)時的創(chuàng)傷部位組織的抗-VEGF染色的斷面。為照片，表示在實施例6中，人為燒傷的形成和處置方法。[圖7]表示在實施例6中，燒傷部位的肉芽組織的厚度變化。[圖8]表示在實施例6中，燒傷部位的毛細血管數(shù)的變化。具體實施例方式在本發(fā)明的醫(yī)療組合物中使用的光交聯(lián)性殼聚糖衍生物(PCR)具有在一般稱作甲殼質(zhì)殼聚糖類的高分子骨架中導(dǎo)入光反應(yīng)性取代基和糖鏈結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，其中，優(yōu)選在構(gòu)成至少一部分脫乙酰化了的甲殼質(zhì)-殼聚糖類的葡糖胺單元的2位氨基的至少一部分上導(dǎo)入具有還原性末端的糖類，其余的至少一部分上導(dǎo)入光反應(yīng)性官能團而成的結(jié)構(gòu)。通常甲殼質(zhì)殼聚糖類為將來源于蝦殼或蟹殼等甲殼類的甲殼質(zhì)(聚-N-乙?；咸前?通過堿處理而得到的脫乙?；乃峥扇苄约壏?，一般為含有下式(l)、(2)所示的結(jié)構(gòu)單元的物質(zhì)。另外，即使是烏賊軟骨、昆蟲或植物來源的原料也沒有任何問題。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>這些甲殼質(zhì).殼聚糖類中，脫乙?；鹊偷?通常小于40%)稱為"曱殼質(zhì)"，脫乙?；雀叩?通常40%以上)稱為"殼聚糖，，，但以下在本說明書中，將至少一部分脫乙?；募讱べ|(zhì).殼聚糖類統(tǒng)稱為"殼聚糖"。而且，本發(fā)明中的殼聚糖并不僅限于天然來源的，也可以是化學(xué)合成、酶合成、或發(fā)酵工程中合成的具有類似結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾糖鏈。這里"脫乙?；?是指，構(gòu)成殼聚糖(或聚-N-乙?；咸前?的糖單元的2位乙酰氨基通過脫乙?；D(zhuǎn)換成游離氨基的比例。在本說明書中，脫乙?；雀鶕?jù)《健康食品規(guī)格規(guī)準集(之4)》財團法人日本健康.營養(yǎng)食品協(xié)會(1996年)第55頁所述的"膠體滴定法"進行定量。本發(fā)明的殼聚糖衍生物為通過進一步對這種殼聚糖進行化學(xué)修飾而得的功能化物質(zhì)，作為原料使用的殼聚糖，優(yōu)選脫乙?；戎辽贋?0%、更優(yōu)選為60~100%、進一步優(yōu)選為65~95%的殼聚糖。其中，脫乙酰化度為100%的殼聚糖只含有上式(1)的結(jié)構(gòu)單元，不含上式(2)的結(jié)構(gòu)單元。另外，對該殼聚糖的分子量沒有特別限定，根據(jù)最終的殼聚糖衍生物的使用目的可以在寬范圍變動，但是一般來說，數(shù)均分子量為5,000~2,000,000、優(yōu)選為10,000~1,800,000、更優(yōu)選為40,000~1,500,000的較為適合。本發(fā)明中優(yōu)選的殼聚糖衍生物為，在構(gòu)成上述殼聚糖的式(1)的葡糖胺單元的2位氨基的至少一部分上導(dǎo)入具有還原性末端的糖類，在另外的一部分上導(dǎo)入光反應(yīng)性基團的殼聚糖衍生物。關(guān)于這種殼聚糖衍生物的詳細情況，可參考WO00/27889號小冊子。作為被導(dǎo)入殼聚糖衍生物的具有還原性末端的糖類，包括醛糖、酮糖，其中，優(yōu)選使用構(gòu)成糖單元的數(shù)目為20個以下，特別優(yōu)選17個的糖類。具體地，可列舉例如葡萄糖、果糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、赤蘚糖、庚酮糖、己酮糖等戊糖或己糖；葡糖胺、N-乙?；咸前?、半乳糖胺(方，夕寸5乂)等氨基糖類；糖醛酸類或脫氧糖類等糖衍生物；包含組合了這些單糖類的糖鏈的麥芽糖、異麥芽糖、乳糖、蜜二糖、麥芽三糖等二糖或三糖類；各種寡糖類等，其中優(yōu)選麥芽糖、乳糖、蜜二糖等中性二糖類。特別優(yōu)選葡萄糖。也可以用聚醚、多元醇等有機化合物代替上述糖類衍生殼聚糖，但從生體適合性等方面考慮，優(yōu)選利用天然的糖鏈。向殼聚糖的上式(1)的葡糖胺單元的2位氨基導(dǎo)入上述糖類，可以采用已知的方法進行，例如包括以下方法將糖類的還原性末端羧基化后，通過酰氨鍵使其鍵合于該2位氨基的方法(例如參考特開平10-120705號公報)、將糖類的還原性末端醛基化或羰基化后，通過經(jīng)由席夫堿的還原烷基化法使其鍵合于葡糖胺單元的2位氨基的方法(例如參考甲殼質(zhì).殼聚糖研究會編《甲殼質(zhì).殼聚糖的應(yīng)用》53-56頁、1990年2月20日、技法堂出版(抹)發(fā)行)等。在本發(fā)明中被導(dǎo)入殼聚糖的糖類并不僅限于一種，也可以將2種以上組合使用。作為構(gòu)成本發(fā)明的殼聚糖衍生物的糖側(cè)鏈的具體例子，舉例如下，但不限于這些。(i)由乳糖衍生的糖鏈(ii)由麥芽糖衍生的糖鏈:(iii)由蜜二糖衍生的糖鏈:(iv)由纖維二糖衍生的糖鏈:(v)由昆布二糖衍生的糖鏈:(vi)由甘露二糖衍生的糖鏈:(vii)由N-乙?；鶜ざ茄苌奶擎?在上述(O~(vii)的糖側(cè)鏈中，左側(cè)的糖側(cè)鏈表示通過糖的羧基與殼聚糖的2位氨基縮合而導(dǎo)入的殘基，右側(cè)的糖側(cè)鏈表示通過席夫堿結(jié)合的殘基。像這樣通過由糖類取代殼聚糖的葡糖胺單元的2位氨基，緩和了殼聚糖的酸依賴溶解性，實現(xiàn)了在中性范圍的可溶化。殼聚糖的葡糖胺單元的2位氨基被糖側(cè)鏈取代的取代度，可以根據(jù)最終殼聚糖衍生物所需要的物性等變動，但一般來說優(yōu)選取代度為0.1~80%、更優(yōu)選0.5~60%、進一步優(yōu)選1~40%的范圍。這里，糖側(cè)鏈的"取代度"是指，構(gòu)成殼聚糖的糖單元的2位氨基被糖側(cè)鏈取代的程度，表示構(gòu)成殼聚糖的糖單元的2位取代氨基相對于游離氨基和取代氨基的合計的比例。在本說明書中，糖側(cè)鏈的取代度是通過"苯酚-硫酸法"測定的，即通過4卯nm的吸光度檢測基于在硫酸中糖鏈和苯酚反應(yīng)的特征顯色(參考J.E.Hodge，B.T.Hofreiter，"MethodsinCarbohydrateChemistry",R丄.Whistler,M丄.Wolfrom編，vol.1,p388,AcademicPress,NewYork(1962))。此外，通過在構(gòu)成殼聚糖的上式(1)的葡糖胺單元的2位氨基的至少一部分上導(dǎo)入光反應(yīng)性官能團，使本發(fā)明的殼聚糖衍生物具有利用光照射的自身交聯(lián)性。根據(jù)本發(fā)明，殼聚糖的化學(xué)修飾所使用的光反應(yīng)性官能團包括通過紫外線、尤其是包含約200~380nm的近紫外區(qū)域的紫外線照射，由該光反應(yīng)性官能團之間和/或與殼聚糖中存在的氨基或羥基等反應(yīng)而形成交聯(lián)鍵的基團，例如包含由二苯甲酮類、桂皮酸類、疊氮類、二烯類、二蒽類(bisanthracene)等環(huán)狀不飽和化合物等衍生的基團，特別優(yōu)選具有羰基疊氮基、磺酰疊氮基、芳族疊氮基的基團。此外，光反應(yīng)性官能團也可以是通過約400500nm左右的可見光照射而反應(yīng)的取代基。作為這種官能團，可列舉例如下式所示的、JournalofPolymerScience:PolymerChemistryEdition,Vol.20，1419-1432(1982)中所述的甲?；揭蚁┗衔锏?。(上式中，Ar表示吡啶、烷基吡啶鎰鹽、喹啉、烷基喹啉鎰等雜環(huán)。)向殼聚糖葡糖胺單元的2位氨基導(dǎo)入該光反應(yīng)性官能團可以按照已知的方法進行，例如可按以下方法進行在縮合劑存在下，使具有羧基的疊氮化合物結(jié)合到該2位氨基上的方法(參照特開平10-120705號公報)；通過酰氯基、醛基、N-羥基琥珀酰亞胺酯基或環(huán)氧基，使疊氮化合物與該2位氨基反應(yīng)的方法(參考甲殼質(zhì).殼聚糖研究會編《甲殼質(zhì).殼聚糖的應(yīng)用》45-65頁、1990年2月20日、技報堂出版(株)發(fā)行)等。通過上述曱酰基苯乙烯基化合物的甲?；蜌ぞ厶堑陌被己弦部珊线m地導(dǎo)入。以往在疊氮基的交聯(lián)反應(yīng)中，認為二疊氮以上的多官能性化合物是有效的(參考特開平9-103481號公報)，但在本發(fā)明中沒有這種必要，通過單疊氮化合物的導(dǎo)入也可以得到具有充分自身交聯(lián)性的殼聚糖衍生物。作為構(gòu)成本發(fā)明的殼聚糖衍生物(PRC)的光反應(yīng)性官能團的具體例子，可列舉例如在紫外線的情況下的下式(A)~(D)所示的基團。式(A)的基團為由對疊氮基苯曱酸衍生的基團，式(B)的基團為由對疊氮基苯甲醛衍生的基團，式(C)的基團為由對苯甲?；郊姿嵫苌幕鶊F，式(D)的基團為由桂皮酸衍生的基團，式(E)為由l-甲基-4-[2-(甲酰基苯基)乙烯基]p比啶鏡衍生的基團。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>這些光反應(yīng)性官能團的導(dǎo)入程度可以根據(jù)對最終的殼聚糖衍生物所希望的基于交聯(lián)反應(yīng)的凝膠化(不溶化)的程度等變動，但光反應(yīng)性官能團的取代度優(yōu)選為0.1~80%、更優(yōu)選0.5~50%、進一步優(yōu)選130%的范圍。這里，光反應(yīng)性官能團的"取代度"是指，構(gòu)成殼聚糖的糖單元的2位氨基被光反應(yīng)性官能團取代的程度，是構(gòu)成殼聚糖的糖單元的2位取代氨基相對于游離氨基和取代氨基的合計的比例。在本說明書中，光反應(yīng)性官能團、如疊氮基的取代度，可以根據(jù)由4-疊氮苯甲酸在270nm處的特性吸收得到的標準曲線來確定。對本發(fā)明的殼聚糖衍生物的糖側(cè)鏈和光反應(yīng)性官能團的合計取代度沒有特別限定，可以在寬范圍變動，一般可以為0.2~80%、優(yōu)選1.5~65%，更優(yōu)選3~50%的范圍。此外，在本發(fā)明的殼聚糖衍生物中，可以在構(gòu)成殼聚糖的上式(1)的糖單元的2位氨基、或者式(1)或式(2)糖單元的3位或6位羥基的至少一部分上導(dǎo)入兩親性基團，以此使交聯(lián)后基材(matrix)具有顯著增加的含水性。這種兩親性基團是指含有帶疏水基的疏水部分和帶親水基的親水部分的基團，一般來說多具有表面活性劑功能。其中，優(yōu)選使用疏水部分(X)和親水部分(Y)的分子量比例為X:Y=1:55:1的基團，更優(yōu)選使用不帶解離性離子基團的非離子性基團。特別地，優(yōu)選由疏水性烷基部分和親水性聚氧化亞烷基部分構(gòu)成的分子量至少為90以上、優(yōu)選為500~IO，OOO的聚氧化亞烷基烷基醚。雖然也可以使用不帶疏水部分的聚醚類，但從提高含水性的角度而言，優(yōu)選具有疏水部分和親水部分兩者的聚氧化亞烷基烷基醚。向殼聚糖中導(dǎo)入所述兩親性基團可以采用以下方法進行，例如，向兩親性基團的親水性部分或疏水性部分中的任何一種的末端導(dǎo)入具有可與氨基反應(yīng)形成共價鍵的基團、例如醛基或環(huán)氧基等的化合物后，使其與殼聚糖葡糖胺的2位氨基反應(yīng)的方法；或者在縮合劑存在下，使具有羧基的聚氧化亞烷基烷基醚衍生物與殼聚糖反應(yīng)的方法；還有，使具有酰氯基的聚氧化亞烷基烷基醚衍生物與殼聚糖的羥基或氨基反應(yīng)的方法等。例如，把在末端衍生了環(huán)氧基的聚氧化亞烷基烷基醚基或在末端衍生了醛基的聚氧化亞烷基烷基醚基導(dǎo)入殼聚糖的氨基時，結(jié)合于殼聚糖骨架的側(cè)鏈如下式(a)或(b)所示。此外，使在末端衍生了酰氯基的聚氧化亞烷基烷基醚基結(jié)合于殼聚糖的3位或6位羥基時，結(jié)合于殼聚糖骨架的側(cè)《連如下式(c)所示。其中下式(a)~(c)中的n和m為l以上的重復(fù)單元數(shù)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(a)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(b)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(c)對在本發(fā)明的殼聚糖衍生物中導(dǎo)入兩親性基團的程度沒有特別限定，但基于導(dǎo)入后的殼聚糖衍生物的重量變化，通?？梢詾?~70%、優(yōu)選為15~55%的范圍。如上詳述，在本發(fā)明的醫(yī)療組合物中使用的光交聯(lián)性殼聚糖衍生物中，可以在殼聚糖骨架中導(dǎo)入具有還原性末端的糖類和光反應(yīng)性官能團，也可以任意地導(dǎo)入兩親性基團。通過導(dǎo)入糖類，使殼聚糖衍生物在中性范圍的可溶性優(yōu)異，可以在生理緩沖液或培養(yǎng)基等中溶液化，可以使蛋白質(zhì)等可能因酸或堿而變性的一些藥物在不失活的情況下混合。進一步地，通過導(dǎo)入光反應(yīng)性官能團，由于在任意部位應(yīng)用后經(jīng)光照射即時地形成不溶性凝膠體，所以可以使皮膚替代物等移植片固定于組織，同時促進上皮化使皮膚再生。作為形成本發(fā)明的光交聯(lián)性殼聚糖衍生物的骨架的高分子，除了殼聚糖也可以使用透明質(zhì)酸等多糖類、膠原等蛋白質(zhì)、以及其他合成高分子等任何高分子，但優(yōu)選可以密閉創(chuàng)傷或組織、具有藥物保持性、適度的生物降解性，能夠以不過快的速度控釋藥物的糖類，其中，優(yōu)選其自身可以保全生物體的高創(chuàng)傷治愈活性的同時，又具有抗菌性的殼聚糖、或透明質(zhì)酸等糖類，尤其從原材料供給和成本等角度考慮，更優(yōu)選殼聚糖。此外，也可以導(dǎo)入具有化學(xué)交聯(lián)性的官能團代替光反應(yīng)性官能團，但優(yōu)選可以迅速進行分子內(nèi)交聯(lián)、容易更換(switching)的基團，由于容易更換、反應(yīng)性高、未反應(yīng)的活性部位殘留較少，因此可以優(yōu)選使用光反應(yīng)性官能團。此外，2位上具有氨基的殼聚糖對于光反應(yīng)性官能團的導(dǎo)入反應(yīng)是有利的，所以從這點來說也可以優(yōu)選使用。物(PRC),而且含有糖類和/或氨基酸。特別地，本發(fā)明中使用的糖類優(yōu)選葡萄糖、半乳糖、甘露糖或巖藻糖等中性單糖類、二糖類、寡糖類等分子量較低的糖類。特別優(yōu)選葡萄糖。使用陰離子性糖類時，與殼聚糖衍生物之間形成聚離子絡(luò)合物，有時即使不進行光照射也會凝膠化。另一方面，本發(fā)明中使用的氨基酸可以是谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸等通常已知的氨基酸，雖然沒有沒有特別限定，但特別優(yōu)選使用必需氨基酸(苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、精氨酸、甘氨酸)。本發(fā)明的醫(yī)療組合物可以通過將光交聯(lián)性殼聚糖衍生物(PRC)、氨基酸和/或糖類、以及其他任意成分，優(yōu)選在中性pH下溶解于溶劑、優(yōu)選水性介質(zhì)中而制備。例如，可以在PRC的蒸餾水或石舞酸緩沖液(PBS)溶液中添加氨基酸或糖類，也可以將PRC溶液與含有氨基酸和/或糖類的細胞培養(yǎng)液混合而制備。雖然在本發(fā)明中特別優(yōu)選使用的細胞培養(yǎng)液是Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)和Ham的F12培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基(DMEM/F12)，但即使是功能性《:7。f卜、、研究所或曰水制藥市售的或理研力w^夕等使用的人細胞林的培養(yǎng)用培養(yǎng)基等，也可以得到所希望的分解特性(多核白細胞浸潤特性)。作為其他的培養(yǎng)基，例^口可以參考http:〃func-p.co.jp/hitoseihin.html禾口http:〃www.brc.riken.jp/lab/cell/distribution/med—table,shtml。為確保向皮膚移植片周圍部位的注入性，使交聯(lián)后的凝膠對皮膚移植片的擔(dān)持可靠，本發(fā)明的醫(yī)療組合物中光交聯(lián)性殼聚糖衍生物(PRC)的含量一般為0.01~100mg/ml、優(yōu)選至少為1~50mg/ml、更優(yōu)選為5~30mg/ml、特別優(yōu)選為20mg/ml左右。另一方面，對氨基酸和/或糖類的含量沒有特別限定，但作為氨基酸為約0.01~50mg/ml、優(yōu)選約0.1~25mg/ml、更優(yōu)選約0.2~200mg/ml時，可以得到所希望的分解性，此外，作為糖類為約0.1~250mg/ml、優(yōu)選約1.0~200mg/ml、更優(yōu)選約1.5~150mg/ml時，可以得到所希望的分解性。這些氨基酸類、糖類的添加效果，只要作為PRC溶液不在光照射前不溶化，無論單獨添加還是混合添加均可得到同樣的效果。如此制備的本發(fā)明的醫(yī)療組合物由于含有光交聯(lián)性殼聚糖衍生物(PRC)，所以通過照射一定強度的光(紫外線和可見光等)一定時間，可在短時間交聯(lián)形成不溶性的凝膠，固定皮膚移植片。光交聯(lián)條件可以根據(jù)使用的光交聯(lián)性殼聚糖衍生物中導(dǎo)入的光反應(yīng)性官能團的種類或取代度、組合物中含有的殼聚糖衍生物的量或使用的組合物的量而變化，如果通過400nm以下波長的紫外線得到規(guī)定的累積光量，則交聯(lián)反應(yīng)可以迅速實現(xiàn)，得到實用的殼聚糖水凝膠體。例如，在采用365nm檢出型市售照度計(UIT-150,々，〉才電機)進行的光量測定中，在50~300mj/cm2的累積光量下該組合物可以形成良好的交聯(lián)水凝"交。該組合物通過400nm以下波長的UV-LED、準分子激光器、水銀燈等產(chǎn)生的紫外線進行交聯(lián)反應(yīng)；關(guān)于照射時間，若提高照射強度，可以縮短達到必要的累積光量的時間，采用l秒以下的照射時間也可以得到所要的水凝膠體。對殼聚糖基材(matrix)的光反應(yīng)性基團的交聯(lián)反應(yīng)度沒有特別限定，本發(fā)明的交聯(lián)殼聚糖基材具有至少30%、優(yōu)選40~100%、更優(yōu)選50~100%，進一步優(yōu)選60~100%、更進一步優(yōu)選70~100%的交聯(lián)反應(yīng)度。這里，本發(fā)明中所謂"交聯(lián)反應(yīng)度(或交聯(lián)度)"是指存在于光交聯(lián)性殼聚糖衍生物中的光反應(yīng)性官能團中，與其他官能團等結(jié)合的官能團的比例。采用本發(fā)明的醫(yī)療組合物時，通過在殼聚糖凝膠層中添加葡萄糖或氨基酸，認為光交聯(lián)反應(yīng)后的殼聚糖分子的分子間距離擴大，從而細胞的浸潤變得容易。此外，通過添加氨基酸而促進細胞浸潤的原因，推測是氨基酸的被覆效果。即，通過氨基酸類中和妨礙作為由唾液酸覆蓋的酸性粒子的細胞進入的殼聚糖氨基，使細胞容易移動。這種使向殼聚糖凝膠內(nèi)的細胞浸潤變得容易的添加物效果，無論單獨使用糖類或氨基酸、還是復(fù)合使用都是有效的，且其效果并不減小。已知葡萄糖和谷氨酸可以刺激白細胞的增殖。本發(fā)明人認為，在本發(fā)明中觀察到的效果的主要原因是糖類或氨基酸帶來的細胞能量效果。即，在下述的實施例中，作為基材雖然使用了光交聯(lián)性殼聚糖凝膠，但該殼聚糖凝膠即使替換為其他的水凝膠或膠原、或者明膠制劑等基材，通過并用葡萄糖等糖類或氨基酸也可以得到本發(fā)明的效果，含有這種基材、糖類和/或氨基酸的醫(yī)療組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例以下用具體例詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明范圍并不限于這些具體例。(合成例1)光交聯(lián)性殼聚糖衍生物(PRC)的合成根據(jù)WO00/27889所述的方法，合成在殼聚糖骨架中導(dǎo)入了紫外線反應(yīng)性官能團和糖鏈的PRC。具體地，通過縮合反應(yīng)，在來源于蝦的分子量為800~1000kDa和脫乙?；葹?5的殼聚糖(燒津水產(chǎn)工業(yè)(抹)生產(chǎn))的氨基上，導(dǎo)入疊氮(對疊氮基苯曱酸)和乳糖(乳糖酸)。通過導(dǎo)入乳糖，在中性范圍的pH下可溶，對疊氮基苯曱酸和乳糖酸的取代度，經(jīng)確認分別為約2.5%和5.0%。此外，使用來源于蟹殼和烏賊軟骨的殼聚糖原料時，也可以合成同才羊的書f生物。(合成例2)光(可見光)固化性殼聚糖衍生物(VL-RC)的合成才艮才居JournalofPolymerScience:PolymerChemistryEdition,Vol.20,1419-1432(1982)所述的方法，合成下式所示的曱基-4-[2-(4-甲酰基苯基)乙烯基]吡啶曱磺酸鹽(FPP)。具體地，將y-曱基吡咬O.07g,33mmol)的曱醇(8.3ml)溶液在冰冷卻下加入到石克酸二曱酯(4.16g,33mmol)中。將溶液在室溫力文置1小時后，加入對苯二曱醛(13.4g,lOOmmol),加熱溶解。接著加入哌咬(0.47ml),回流5小時。趁熱濾除析出物。將熱濾液與乙醇(50ml)和丙酮(16.7ml)的混合溶劑合并，在室溫放置一晚。由過濾分離得到黃色析出物，用乙醇和丙酮洗滌后，進行減壓干燥，得到FPP。收量為4.81g(46%),熔點為210~213°C。CH3S03一(實施例1)在大鼠背部人為制成大小為3cmx3cm的皮膚全層缺損。同時將切除的皮膚作為自體皮膚移植片，并在該移植片上形成直徑為5mm的孔12個。然后，將形成孔的移植片靜置于前述的皮膚全層缺損部位上，對(A)直接放置的情況、(B)將移植片縫合的情況、(C)在孔中填充以往的醫(yī)療用粘合劑(氰基丙烯酰胺類，商品名夕'一7水7卜(J&J公司生產(chǎn)))的情況和(D)在孔中填充本發(fā)明的組合物，用紫外線照射的情況(波長330nmx15秒)，對以下項目進行評價。結(jié)果如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(a)成活率(生著率)在移植后第5天肉眼觀察到的成活移植片數(shù)/移植片總數(shù)(N=12)(b)肉芽形成(+):根據(jù)移植后第7天的組織所見，確認移植片周圍形成肉芽組織。(-):根據(jù)移植后第7天的組織所見，未確認移植片周圍形成肉芽組織。表1表明，未處理的移植片(A)成活率非常低，將移植片縫合的情況(B)雖然成活率提高，但需要IO分鐘以上的處理時間。另一方面，采用氰基丙烯酰胺類粘合劑的情況(C),雖然在處理時間和成活率方面優(yōu)異，但在移植片周圍未見肉芽形成。采用本發(fā)明組合物的情況(D)，在處理時間、成活率和肉芽形成所有方面都很優(yōu)異。(實施例2)配制PRC的4%水溶液(蒸餾水)，與等量的培養(yǎng)基(DMEM/F12，Invitrogen公司生產(chǎn))混合，作為本實施例的組合物(A)。另外，代替前述培養(yǎng)基與等量的PBS混合，配制比較組合物(B)。組合物(A)中使用的培養(yǎng)基(DMEM/F12)為含有各種氨基酸、葡萄糖和其他成分的無血清組織培養(yǎng)培養(yǎng)基。與實施例1相同，將自體皮膚移植片靜置在小鼠的皮膚全層缺損部位上，填充前述組合物(A)和(B)并用紫外線照射。然后，觀察移植部位的斷面組織，結(jié)果如圖2和圖3所示。如圖2所示，采用本發(fā)明的組合物(A)的情況下，嗜中性粒細胞高密度地浸潤殼聚糖層(第2天)，接下來隨著殼聚糖層的消失觀察到血管新生、肉芽形成(第4天)，并進一步觀察到上皮化(第8天)。與此相對，如圖3所示，采用不含氨基酸、葡萄糖的組合物(B)的情況下，未見細胞浸潤殼聚糖層，雖然第8天后確認殼聚糖層的收縮，但在殼聚糖層正下面的組織中浸潤顯著(第2天)，因成纖維細胞等引起的肉芽形成活躍。(實施例3)進行與實施例2同樣的實驗，規(guī)定時間(4天)后取出含有PRC凝膠層的組織，用抗-VEGF抗體進行免疫染色。在采用含有氨基酸、葡萄糖等培養(yǎng)基的實施例(A)和釆用PBS的比較例(B)中得到的結(jié)果如圖4和圖5所示。如圖4所示，在采用本發(fā)明組合物的實施例(A)中，確認了在PRC凝膠層內(nèi)部的強染色(圖4(A))。特別是在凝膠層的上層部存在包含較多嗜中性粒細胞的纖維化層，并觀察到強VEGF染色(圖4(B))。另一方面，在溶解于PBS的比較例(B)中，未見PRC凝膠層的分解，在PRC凝膠層與皮下組織接觸的最下層中確認了強染色(圖5(A))。在該界面區(qū)域中PRC凝膠變性為纖維狀，并觀察到VEGF的強染色。(實施例4)配制將PRC溶解于PBS中的組合物(A)、在(A)中添加50mg/ml的D-葡萄糖的組合物(B)、和在(A)中添加5mg/ml的谷氨酰胺的組合物(C)。另外，配制添加了與組合物(B)和(C)相同濃度的葡萄糖和氨基酸的組合物(D)。與實施例2和3相同，在小鼠的背部制作皮膚全層缺損部位，將自體皮膚移植片靜置于該部位，填充前述組合物(A)、(B)、(C)或(D)并通過紫外線照射使其硬化。處理后第5天采取組織，通過顯微鏡觀察，比較粒細胞對殼聚糖凝膠層的浸潤程度。結(jié)果如表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>備考+++:粒細胞以高密度對凝膠層整體浸潤++:粒細胞對凝力交層整體浸潤+:粒細胞僅對凝膠層和肉芽界面附近浸潤-:未確認粒細胞對凝膠層浸潤結(jié)果表明，在實施例2和3中確認的培養(yǎng)基的添加物效果，即使單獨使用葡萄糖或氨基酸也可以觀察到。另外，即使添加的氨基酸為必需氨基酸混合物，同樣可以觀察到有效的粒細胞浸潤(未示出數(shù)據(jù))。(實施例5)在小鼠背部制成2cm的皮膚全層缺損，用本發(fā)明組合物或市售的人工真皮膠原膜(亍乂"夕'一;、X;亍/k乇公司生產(chǎn))處理(不做自體皮膚移植)。在處理后第6天，在以本發(fā)明的組合物處理的創(chuàng)傷(A)中，殼聚糖凝膠已經(jīng)消失，肉芽形成快，并從周邊組織開始進行上皮化。另一方面，在用膠原膜處理的的創(chuàng)傷(B)中，雖然觀察到從創(chuàng)傷周邊組織開始的上皮化，但膠原膜有殘留。此外，在(A)中不需要以紗布等被覆材料覆蓋經(jīng)紫外線固化的殼聚糖凝膠，但在(B)中由于固定膠原膜需要進行縫合，在進行拆線時有出現(xiàn)再度創(chuàng)傷的問題。(實施例6)在大鼠背部人為形成III度燒傷，切除壞死組織(圖6A)。然后，采用作為支持材料的本發(fā)明組合物(圖6A)或膠原海綿(亍》義一;、只；^A乇公司生產(chǎn))(圖6C)處理該部位。即，對在創(chuàng)傷部位填充本發(fā)明的組合物(含有DMEM/F12的PRC水溶液)并進行光固化的例子、和采用膠原海綿處理的例子進行比較。采用本發(fā)明組合物處理的情況下，從移植后第6天左右確認了新生血管的出現(xiàn)。與此相對，采用膠原海綿的情況下，第6天的血流量少，新生血管的出現(xiàn)在移植后12日以后達到高峰。創(chuàng)傷部位的肉芽組織厚度和顯微鏡觀察到的毛細血管數(shù)的變化如圖7和圖8所示。結(jié)果表明，通過本發(fā)明的組合物，可以顯著促進肉芽形成和血管新生。移植后32天的上皮厚度，在采用本發(fā)明組合物處理的例子中平均達到67.1)im,與此相對，在釆用膠原海綿處理的例子中為55.8pim。即，從本實施例的結(jié)果可以得到如下令人吃驚的結(jié)論，通過采用本發(fā)明的醫(yī)療組合物，即使不使用自體皮膚移植片，粒細胞也會浸潤殼聚糖凝膠層，增加新生血管，并進一步誘導(dǎo)上皮形成。權(quán)利要求1.醫(yī)療組合物，其特征在于含有基材、氨基酸和/或糖類。2.權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，基材選自水凝膠、水膠體、膠原、明膠制劑。3.權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，基材是由光交聯(lián)性殼聚糖衍生物形成的。4.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，前迷糖類為選自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖的中性糖。5.權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，前述氨基酸為必需氨基酸。6.權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，前述光交聯(lián)性殼聚糖衍生物為高分子，該高分子是在包含下式(1)和(2)表示的結(jié)構(gòu)單元的[化1]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>甲殼質(zhì)殼聚糖類的葡糖胺單元U)的2位氨基的至少一部分上導(dǎo)入具有還原性末端的糖鏈，在其它至少一部分上導(dǎo)入光反應(yīng)性基團而成的。7.權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，含有至少lmg/ml光交聯(lián)性殼聚糖衍生物。8.權(quán)利要求1~7中任一項所述的組合物，其特征在于進一步含有創(chuàng)傷治愈促進藥。全文摘要本發(fā)明提供醫(yī)療組合物，其在大范圍全層皮膚缺損中能夠誘導(dǎo)上皮形成的唯一方法即自體皮膚移植中，可以簡便地固定自體皮膚移植片，可以提高上皮化的效率、促進皮膚再生。本發(fā)明涉及醫(yī)療組合物，其特征在于含有光交聯(lián)性殼聚糖衍生物、氨基酸和/或糖類。所述氨基酸優(yōu)選為必需氨基酸，糖類優(yōu)選為選自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖的中性糖。文檔編號A61L24/00GK101175512SQ20068001639公開日2008年5月7日申請日期2006年5月12日優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日發(fā)明者三澤義知,岡田芳明,齋藤大藏,清住哲郎,由良洋文,石原雅之,金谷泰宏申請人:株式會社奈特克;燒津水產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會社