油茶胚根不定芽誘導獲得再生植株的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于油茶細胞工程領域，具體涉及一種以油茶胚根為外植體誘導不定芽， 繼而獲得完整試管苗植株的方法。
【背景技術】
[0002] 油茶（CamelliaOleifera)是山茶科（Theaceae)山茶屬（Camellia)常綠灌木或 小喬木，是我國特有的木本食用油料樹種，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料 植物。茶油不飽和脂肪酸含量達90%以上，色佳味香，風味獨特，營養(yǎng)豐富，耐貯藏，有降血 壓、血脂及軟化血管的作用，對心血管疾病的預防有重要作用，是優(yōu)質的食用油之一，被譽 為"東方橄欖油"。同時，油茶副產(chǎn)物還是生產(chǎn)肥料、農(nóng)藥、栲膠的優(yōu)質原料。油茶主要分布 于我國長江流域以南地區(qū)，湖南和江西是油茶主要種植區(qū)。目前，中國共有油茶林4531. 2 萬畝，年產(chǎn)茶油20多萬噸，平均畝產(chǎn)茶油5. 8kg，油茶產(chǎn)業(yè)普遍存在著單位面積產(chǎn)量低和 經(jīng)濟效益差兩大問題。油茶低產(chǎn)低效的重要原因之一就是良種化程度低，品種混亂，大部 分油茶林處于野生狀態(tài)，產(chǎn)量較低，良種苗木短缺不能大面積推廣種植。同時，油茶炭疽病 Glomerellacingulata(Stonem.)SpauldetSchrenk是油茶的主要病害。在長江流域以 南各省的大面積油茶栽培區(qū)，以及河南、陜西南部地區(qū)發(fā)生普遍。病害發(fā)生后，引起嚴重落 果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，嚴重影響了油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。通過組織培養(yǎng)可以快 速繁殖油茶脫毒苗，在此基礎上通過遺傳體系轉化而獲得抗病植株，在木本油料植物遺傳 改良方面有廣闊的前景。
[0003] 組織培養(yǎng)是快速繁殖優(yōu)良植物品種的一條重要途徑，具有廣闊的商業(yè)化前景。關 于油茶組織培養(yǎng)的研宄較多，張智俊等人利用油茶無性系子葉通過體細胞胚胎發(fā)生途徑獲 得了再生植株，李澤等人利用油茶帶芽莖段獲得再生植株，但以上研宄只能在油茶組織培 養(yǎng)快繁方面有重要意義，不能應用到油茶遺傳體系轉化獲得轉基因植株。植物遺傳體系轉 化最常用的方法是農(nóng)桿菌介導法侵染植物葉片、下胚軸、葉柄、胚根等器官，而油茶葉片誘 導不定芽的誘導率僅為17.86%，目前還不能應用在油茶遺傳體系轉發(fā)方面，油茶轉基因至 今還未找到合適的外植體。本發(fā)明通過利用油茶胚根誘導不定芽，再通過不定芽的繼代增 殖、生根和煉苗移栽等一系列過程，旨在建立一個高效穩(wěn)定的油茶胚根離體快繁體系，為油 茶快速繁殖及工廠化育苗奠定基礎。關鍵還在于能夠通過農(nóng)桿菌浸染實現(xiàn)油茶遺傳轉化 的可能性，為油茶快速繁殖及遺傳轉化提供更廣的途徑和技術支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對目前采用油茶葉片誘導不定芽還未獲得再生植株，油茶轉基 因還處于初期探索階段，主要原因是沒有適合油茶遺傳體系轉化的組培體系，在此基礎上， 本發(fā)明提供了一種油茶胚根誘導不定芽獲得再生植株的方法，該方法利用油茶胚根誘導出 不定芽，其誘導率較高，不定芽出芽數(shù)較多，繼代增殖系數(shù)高，壯苗效果好，生根率高，關鍵 還能夠通過農(nóng)桿菌浸染實現(xiàn)油茶遺傳轉化的可能性。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的。
[0006] 油茶胚根不定芽誘導獲得再生植株的方法，包括以下步驟：
[0007] 1)誘導不定芽：在無菌條件下切取長為1. 0-1. 5cm的油茶無菌苗胚根根段，接種 到l/2MS+2.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/LIAA+0.05mg/LIBA+2.0mg/L6八3的培養(yǎng)基中誘導 不定芽；
[0008] 2)繼代培養(yǎng)：將胚根誘導的不定芽切下接種到1/2MS+2. 0-3.Omg/L 6-BA+0. 05-0.lmg/LIBA+0-1.Omg/L6^的培養(yǎng)基中進行不定芽的繼代培養(yǎng)；
[0009] 3)壯苗培養(yǎng)：將增殖培養(yǎng)得到的芽轉接到WPM+0. 1-1.Omg/LNAA+3. 0-5.Omg/L GA3的培養(yǎng)基中進行壯苗培養(yǎng)；
[0010] 4)生根培養(yǎng)；
[0011] 5)煉苗、移栽。
[0012] 上述方法中誘導不定芽時暗培養(yǎng)3天后，再到光照條件下培養(yǎng)30-35天。
[0013] 上述方法中繼代增殖培養(yǎng)時暗培養(yǎng)3天，再到光照條件下培養(yǎng)20-30天。
[0014] 上述方法中壯苗培養(yǎng)時暗培養(yǎng)2天，再轉到光照條件下培養(yǎng)20-25天。
[0015] 上述方法中將壯苗培養(yǎng)獲得3-4cm的苗接到1/2MS+1. 0-2.Omg/L IBA+1. 0-2. 0mg/LNAA+35g/L珍珠巖的培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。
[0016] 上述方法中生根培養(yǎng)時暗培養(yǎng)5天，再轉到光照下培養(yǎng)20天即可生根。
[0017] 上述方法中培養(yǎng)溫度為26 士I°C，光照培養(yǎng)時光照強度為2100-22001x，光照時間 12-14h/d;所述方法中用到的培養(yǎng)基均附加蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，pH調至5. 4-5. 6。
[0018] 上述方法中胚根誘導不定芽使用的培養(yǎng)基優(yōu)選為：1/2MS+2. 0mg/L6-BA+O. 05mg/ LIAA+0. 05mg/LIBA+2.Omg/LGA3;
[0019] 增殖培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基優(yōu)選為：l/2MS+2.Omg/L6-BA+O. 05mg/LIBA+1.Omg/L GA3;
[0020] 壯苗培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基優(yōu)選為：WPM+0. 5mg/LNAA+3. 0-5.Omg/LGA3。
[0021] 上述方法中煉苗、移栽的具體過程如下：
[0022] 將生根后的油茶試管苗先在室內(nèi)進行移栽前煉苗3-5天，然后從培養(yǎng)瓶中取出， 附帶珍珠巖直接移栽到營養(yǎng)杯中，基質為泥炭土：珍珠巖：黃土 = 2:1:1，組培苗移栽后保 持濕度80%以上，覆蓋薄膜并每天噴水1~2次，兩周后即逐步進行正常管理。
[0023] 上述方法中所述的油茶無菌苗的獲得過程如下：
[0024] 選取成熟的當年生油茶種子，取除種皮，將種仁用自來水沖洗3-5min，然后浸泡 10-1511，中間換水2-3次，然后在超凈工作臺中先用75%的酒精浸泡20-30 8，無菌水沖洗 3-5次，再用0. 1 %的HgCl2消毒3-6min，用無菌水沖洗5-6次，切掉胚乳的大部分，把附帶 胚乳的種胚接種在WPM基本培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2-3天后轉到光照條件下培養(yǎng)20-25天即獲 得無菌苗；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強度為2100-22001X，光照時間12-14h/d。
[0025] 本發(fā)明主要過程包括：油茶胚根不定芽誘導、繼代增