專利名稱：棉花子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)植株再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明棉花子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)植株再生的方法，屬于植物組織培養(yǎng)范疇，適用于棉花體細(xì)胞培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的受體材料的培養(yǎng)技術(shù)。
二、技術(shù)背景雖然棉花體細(xì)胞培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、胚珠和胚培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等植株再生的技術(shù)體系早已建立，但至今在應(yīng)用方面仍受到相當(dāng)程度的限制?，F(xiàn)有的棉花組織培養(yǎng)植株再生技術(shù)，都是通過愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖、胚狀體的發(fā)生和萌發(fā)、壯苗培養(yǎng)、試管苗生根途徑獲得再生植株，每一個(gè)階段都需要特定的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)過程復(fù)雜，培養(yǎng)周期長，且愈傷組織在長期繼代培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生染色體變異，產(chǎn)生大量的異常胚狀體，在獲得的試管苗中畸形苗所占的比例偏高。
迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)從棉花子葉離體培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽再生植株的報(bào)道僅有2篇(吳敬音，佘建明等.泗棉3號(hào)葉片叢生芽形成及植株再生[J]，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994，2；張海，易永華等.棉花子葉離體培養(yǎng)與植株再生[J]，西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11(1)84～86)。吳敬音等以5～7d苗齡的子葉為外植體材料，從陸地棉泗棉3號(hào)品種偶爾誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，不但誘導(dǎo)率低，且試驗(yàn)重復(fù)性差；張海等則是首先通過子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后再經(jīng)過愈傷組織分化的途徑而得到再生植株。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是要克服目前在棉花組織培養(yǎng)植株再生技術(shù)中存在的培養(yǎng)過程復(fù)雜、周期長、畸形胚和畸形苗比例高、植株再生率低等問題。以棉花種子無菌苗的子葉為外植體材料，直接從完整子葉的基部切口處誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，從而建立起棉花子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)高頻率植株再生技術(shù)。
技術(shù)方案棉花子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)植株再生的方法，其特征在于，1)材料選用棉花種子無菌苗的子葉為外植體材料；2)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素與B5維生素組成，葡萄糖30g/L，固化劑-phytagel 2g/L；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基附加激素6-芐基氨基嘌呤3.0mg/L，吲哚乙酸1.0mg/L，2-異戊烯腺嘌呤1.0mg/L；添加硝酸銀5.0mg/L；幼苗生長培養(yǎng)基在上述基本培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基嘌呤0.1mg/L；培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8；3)培養(yǎng)方法經(jīng)硫酸脫絨的棉花種子在70％乙醇中消毒2～3min，然后用10％雙氧水處理30～60min，表面消毒處理后的種子在25℃下無菌水中浸泡24h，剝?nèi)シN皮后置于1/2 MS培養(yǎng)基上，15h后切取完整的子葉接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；10d后從子葉的基部切口處誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，不定芽長到1.5cm高度時(shí)轉(zhuǎn)到幼苗生長培養(yǎng)基上，獲得再生植株。培養(yǎng)室溫度為25±1℃，在16h光照條件下培養(yǎng)。
有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明以珂字棉312品種和陸地棉泗棉3號(hào)品種的種子無菌苗15h苗齡的子葉為外植體材料，在附加6-芐基氨基嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸1.0mg/L和2-異戊烯腺嘌呤1.0mg/L不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽的誘導(dǎo)頻率分別達(dá)40％和30％以上。陸地棉泗棉3號(hào)品種的子葉誘導(dǎo)不定芽總的頻率為30％以上，其中發(fā)育正常的不定芽的頻率在16％以上。在上述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加硝酸銀5.0mg/L，珂字棉312品種不定芽的誘導(dǎo)頻率達(dá)70％左右，陸地棉泗棉3號(hào)品種不定芽的誘導(dǎo)頻率達(dá)60％左右。由此，本發(fā)明成功地建立起棉花通過子葉離體培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽途徑高頻率植株再生技術(shù)體系。
本發(fā)明從棉花種子的無菌苗15h苗齡的子葉直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，由不定芽發(fā)育成試管植株，極大地簡化了現(xiàn)有的棉花組織培養(yǎng)植株再生的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)條件操作簡便，培養(yǎng)周期縮短4～6個(gè)月，并提高了植株再生的頻率，為規(guī)?；_展體細(xì)胞培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化提供嶄新的、更為有效的實(shí)用技術(shù)。
四

圖1接種15h苗齡的子葉圖2子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽圖3試管苗圖4完整再生植株五具體實(shí)施方式
1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料珂字棉3 12、陸地棉泗棉3號(hào)品種為試驗(yàn)材料。
取種子無菌苗的子葉為外植體材料。
1.2培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素(Murashige T，Skoog F.A revisedmedium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J].Physiol plant，1962，15473～497)和B5維生素(Gamborg O L，Miller R A，Ojima K.Nutrientrepuirements of suspension cultures of soybeanroot cell[J].Exp. Cell Res，1968.50151～158)組成，為植物組織培養(yǎng)中一種常用的培養(yǎng)基。添加葡萄糖30g/L，固化劑-phytagel(SIGMA公司)2g/L；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基附加激素6-芐基氨基嘌呤(簡稱BAP，上海雪滿生物科技有限公司)3.0mg/L，吲哚乙酸(簡稱IAA，南京生工)1.0mg/L，2-異戊烯腺嘌呤(簡稱2ip，SIGMA)1.0mg/L；培養(yǎng)基中添加硝酸銀(簡稱AgNO3，上海試劑一廠)5.0mg/L；幼苗生長培養(yǎng)基在上述基本培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基嘌呤(簡稱BAP，上海雪滿生物科技有限公司)0.1mg/L；培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8；1.3培養(yǎng)方法經(jīng)硫酸脫絨的棉花種子在70％乙醇中消毒2～3min，然后用10％雙氧水處理30～60min，表面消毒處理后的種子在25℃下無菌水中浸泡24h，然后剝?nèi)シN皮置于1/2MS培養(yǎng)基上，15h后切取完整的子葉接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；6d前剔除個(gè)別帶有腋芽的子葉以排除試驗(yàn)誤差，10d左右從子葉基部的切口處誘導(dǎo)不定芽發(fā)出，20d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)頻率；不定芽長到1.5cm高度時(shí)轉(zhuǎn)到幼苗生長培養(yǎng)基上。培養(yǎng)室溫度為25±1℃，在16h光照條件下培養(yǎng)。
2.結(jié)果2.1不同苗齡的子葉對(duì)不定芽誘導(dǎo)頻率的影響分別取培養(yǎng)15h、48h、72h、96h的無菌苗的完整子葉為外植體材料，接種在附加BAP 3.0mg/L、IAA 1.0mg/L、2ip 1.0mg/L的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。試驗(yàn)結(jié)果顯示苗齡為15h時(shí)，珂字棉312和陸地棉泗棉3號(hào)品種子葉的不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)40％和30％以上；苗齡為72h時(shí)，泗棉3號(hào)的子葉未誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。隨著種子無菌苗苗齡的延長，子葉誘導(dǎo)不定芽的頻率明顯下降(表1)。
表1 不同苗齡的子葉對(duì)不定芽誘導(dǎo)頻率的影響

2.2不同激素種類及配比對(duì)不定芽的誘導(dǎo)頻率的影響苗齡均為15h，激素組合為BAP 3.0mg/L、2ip 1.0mg/L和IAA 1.0mg/L，珂字棉312和陸地棉泗棉3號(hào)品種子葉的不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)40％和30％以上。試驗(yàn)結(jié)果表明在BAP 3.0mg/L前提下，2ip對(duì)誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的作用優(yōu)于ZT，IAA的作用優(yōu)于IBA(表2，表3)。
表2 激素對(duì)珂字棉312品種的子葉誘導(dǎo)不定芽頻率的影響

表3 激素對(duì)泗棉3號(hào)品種的子葉誘導(dǎo)不定芽頻率的影響

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同的激素組合對(duì)陸地棉泗棉3號(hào)品種的子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽的質(zhì)量有顯著的影響，有相當(dāng)比例的不定芽發(fā)育成畸形試管苗。試驗(yàn)結(jié)果顯示在激動(dòng)素同為BAP和2ip時(shí)，生長素IAA對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生正常不定芽的作用優(yōu)于IBA，發(fā)育正常的不定芽的誘導(dǎo)頻率達(dá)16％以上(表4)。
表4 激素對(duì)泗棉3號(hào)品種的子葉誘導(dǎo)發(fā)育正常的不定芽頻率的影響

2.3AgNO3對(duì)不定芽誘導(dǎo)頻率的影響在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加硝酸銀，能有效抑制酚類化合物的氧化。隨著AgNO3的濃度從0mg/L提高到5.0mg/L時(shí)，珂字棉312品種的子葉誘導(dǎo)不定芽頻率由41.18％提高到69.47％；而進(jìn)一步從5.0mg/L提高到9.0mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)頻率則從69.47％降至62.07％。隨著AgNO3濃度的提高，泗棉3號(hào)品種的子葉誘導(dǎo)不定芽頻率由31.65％提高到57.29％(表5)。
表5 AgNO3對(duì)不同品種的子葉誘導(dǎo)不定芽頻率的影響

3.結(jié)論本發(fā)明以珂字棉312品種和陸地棉泗棉3號(hào)品種的種子無菌苗15h苗齡的子葉為外植體材料，在附加6-芐基氨基嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸1.0mg/L和2-異戊烯腺嘌呤1.0mg/L不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽的誘導(dǎo)頻率分別達(dá)40％和30％以上；陸地棉泗棉3號(hào)品種的子葉誘導(dǎo)發(fā)育正常的不定芽的頻率在16％以上。在上述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加硝酸銀5.0mg/L，珂字棉312品種不定芽的誘導(dǎo)頻率達(dá)70％左右，陸地棉泗棉3號(hào)品種不定芽的誘導(dǎo)頻率達(dá)60％左右。由此，成功地建立起棉花通過子葉離體培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽途徑高頻率植株再生技術(shù)體系。不定芽長到1.5cm高度時(shí)轉(zhuǎn)到幼苗生長培養(yǎng)基上，形成完整的植株試管苗(圖3、圖4)。
權(quán)利要求
1.棉花子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)植株再生的方法，其特征在于，1)材料選用棉花種子無菌苗的子葉為外植體材料；2)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素與B5維生素組成，附加葡萄糖30g/L，固化劑phytagel 2g/L；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基在上述基本培養(yǎng)基中添加激素6-芐基氨基嘌呤3.0mg/L，吲哚乙酸1.0mg/L，2-異戊烯腺嘌呤1.0mg/L，硝酸銀5.0mg/L；幼苗生長培養(yǎng)基在上述基本培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基嘌呤0.1mg/L；培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8；3)培養(yǎng)方法經(jīng)硫酸脫絨的棉花種子在70％乙醇中消毒2～3 min，然后用10％雙氧水處理30～60 min，表面消毒處理后的種子在25℃室溫下無菌水中浸泡24h，剝?nèi)シN皮后置于1/2 MS培養(yǎng)基上，15h后切取完整的子葉接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；10d后從子葉的基部切口處誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽；不定芽長到1.5cm高度時(shí)轉(zhuǎn)到幼苗生長培養(yǎng)基上，獲得再生植株；以上培養(yǎng)室溫度為25±1℃，在16光照條件下培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及棉花子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)植株再生的方法，屬于植物組織培養(yǎng)范疇。本發(fā)明以棉花種子無菌苗的子葉為外植體材料，接種在附加6－芐基氨基嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸1.0mg/L、2－異戊烯腺嘌呤1.0mg/L、硝酸銀5.0mg/L的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽長到1.5cm高度時(shí)轉(zhuǎn)到幼苗生長培養(yǎng)基上，獲得再生植株；珂字棉312品種不定芽的誘導(dǎo)頻率高達(dá)70％左右，陸地棉泗棉3號(hào)品種不定芽的誘導(dǎo)頻率高達(dá)60％左右。棉花子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)植株再生技術(shù)操作簡便，培養(yǎng)周期短，植株再生頻率高，為規(guī)?；_展棉花體細(xì)胞培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化提供新的更有效的實(shí)用技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101088323SQ200710024879
公開日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2007年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者倪萬潮, 張保龍, 許亞楠, 佘建明, 沈新蓮, 張香桂, 何曉蘭, 楊郁文 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院